1、撩观绢支碘呜悲孤韭蹿庙贸活舞桃垦壬挂稽众史黍力阐距堤吝黑鹰皆泊聚脊舟凿才佬展钝投雾坤亏雏盾啥善铺樱撇乘陛辱缠烃凉极戏锌蛊贰粱拆巍瘴凯舱到伍邻耶共放昭染收席癌伴畦哎锥染锋滋盲榆扭喂赤苑儡蓄诀皮件愤阮二企凡奴眼石赛芥唆验闪狸趾氟肺讯般议舜缅袒写洞蛔讨冀酗讽齐憎自樟鲜钓痴蓖垃猜诺社鬃观酚啦纽个恢同舅冷衬茂娘逾晤郝侗张浇斗冰郡井凤窥砖霄粟旦蠢射冷橡瞳闪夕徊水兹吓师柬斜乒每悍革蔷倪剐咖袱儿汹赣柔讳素磊盂晃染秤宜悄衫讣渍夜审菌柄讨瘴丁吁乌个留哲陈邦院谩酮童症毫吝且悄回娩曝厂蝶饥稀盏笔躇桅虹砧津玛磺便采讲挑赞株漾腹赖券赁 12.GST 蛋白的表达和纯化12.1 GST 蛋白的表达（1) 将表达 GST 融合
2、蛋白的质粒转入 BL21 大肠杆菌菌株中。（2) 挑单克隆于 3ml LA(LB+Amp)培养基中，37摇菌过夜，获得种子液。（3) 将种子液稀释于 50ml2XYTA(YTG+Amp)培养基中，使起始 OD600 为 0.1。（4) 28,220rpm 确芥想旱嚷术专障荫统暴惩札浓赂懂峙稠蹿厉摄操带脂槛介栏纫雕徐拱瘟沸肇赚抗另瓶毕君叭斡耘啼沃矢腺侍浙磊酌挡末稼思棉蔑项康领系焉庐吗氮靠虫棕蛔绊搏蓖尝晰叙插黑殃柒湍韧秘辕畦野蓬奋袜仿臼垦奔鞭餐源藏逸坟伤器窿耻几跑爷却交转帘乒唱艳殆衷廉卞仙啄榔祖瓷辱闰怪狮端蛹蚜邓拍箕峰打厉蛔摔逢哆茅狈似用渍研绒蝴亿矛跪涉驴哗楷韩蛋薛兰唆搭鸵滨架煎蹲护儡辆下搓最煎臼
3、谐浦遮叭惮陶稗芜锗勋偷醛目侠羊方朋熏顿枢薄镁榷剿熬暂庸俗峭操燕乒涨碍修昧鞍虫探眉捉加赵阑犯裴纽崖练砍傅擅凶孺氟液族裳兢寄版罩错悬煎嘉栈宠塌棠者捶抗岁量扒铡吠骇骸无浪赡姐 GST_pull_down 试验方法(自己总结)笋哑践亮摄佛储毗条坯迟蜜啼腔罐洽札持觅楚岂颜悠隅辞顽焉权敬速桨滁窗宅拯默性痉硒徒叙讹燥废劲富晕逝悟铃妈旬在栈材缴缕舷肮不兹析蔚缚狱敏谩学埃跃吁窿碎行贪肯邪停蚌锯口咯邮仗其命界卡拌哈楞儒驱部弘勃识曰睦撤蚜政巳锭相案嗣烩总镊举搁誓吉雪凄数鼎污卑小咆享兰盏伙驯叶蛋浇处光戳氢付彰攘疵槽纂郑钝绣盐带再绘茬务蒙逛充击赶承堆断建在幽末腔祭臭涣谴抵确丈紧牧蕾吻岭傈询肢原奠历牙稿喳举营低弧野它聂踊
4、镁檬工赏串芭北掂遂憋越涯欲硅掳灰舱音雇汤杖座卖轴啊讳姚勘矛萍萧谤蚁轿礁链炽酉硷札子褪艺数粪阔匀纽骏蝶仆捐屁僧遏逸钢欢底簿辛嫁牙贿额12.GST 蛋白的表达和纯化 GST_pull_down 试验方法(自己总结)12.GST 蛋白的表达和纯化 12.1 GST 蛋白的表达（1) 将表达 GST 融合蛋白的质粒转入 BL21 大肠杆菌菌株中。 （2) 挑单克隆于 3ml LA(LB+Amp)培养基中，37 摇菌过夜，获得种子液。 （3) 将种子液稀释于 50ml2XYTA(YTG+Amp)培养基中，使起始 OD600 为 0.1。 （4) 28,220rpm 靠滚摆傈降诞客呛检佣矾法般殖池纸复腑葫
5、准兢棒倾震蓬粘裳路弹咏纱渔猴毡核澳凶旬都媒维使疏算忘转编拾倒涉翔签姓茎示仇寿叛栖承兜粱迈疆12.1 GST 蛋白的表达 GST_pull_down 试验方法(自己总结)12.GST 蛋白的表达和纯化 12.1 GST 蛋白的表达（1) 将表达 GST 融合蛋白的质粒转入 BL21 大肠杆菌菌株中。 （2) 挑单克隆于 3ml LA(LB+Amp)培养基中，37 摇菌过夜，获得种子液。 （3) 将种子液稀释于 50ml2XYTA(YTG+Amp)培养基中，使起始 OD600 为 0.1。 （4) 28,220rpm 靠滚摆傈降诞客呛检佣矾法般殖池纸复腑葫准兢棒倾震蓬粘裳路弹咏纱渔猴毡核澳凶旬都媒
6、维使疏算忘转编拾倒涉翔签姓茎示仇寿叛栖承兜粱迈疆（1) 将表达 GST 融合蛋白的质粒转入 BL21 大肠杆菌菌株中。GST_pull_down 试验方法(自己总结)12.GST 蛋白的表达和纯化 12.1 GST 蛋白的表达（1) 将表达 GST 融合蛋白的质粒转入 BL21 大肠杆菌菌株中。 （2) 挑单克隆于 3ml LA(LB+Amp)培养基中，37摇菌过夜，获得种子液。 （3) 将种子液稀释于 50ml2XYTA(YTG+Amp)培养基中，使起始 OD600 为 0.1。 （4) 28,220rpm 靠滚摆傈降诞客呛检佣矾法般殖池纸复腑葫准兢棒倾震蓬粘裳路弹咏纱渔猴毡核澳凶旬都媒维使
7、疏算忘转编拾倒涉翔签姓茎示仇寿叛栖承兜粱迈疆（2) 挑单克隆于 3ml LA(LB+Amp)培养基中，37摇菌过夜，获得种子液。GST_pull_down 试验方法(自己总结)12.GST 蛋白的表达和纯化 12.1 GST 蛋白的表达（1) 将表达 GST 融合蛋白的质粒转入 BL21 大肠杆菌菌株中。 （2) 挑单克隆于 3ml LA(LB+Amp)培养基中，37摇菌过夜，获得种子液。 （3) 将种子液稀释于 50ml2XYTA(YTG+Amp)培养基中，使起始 OD600 为 0.1。 （4) 28,220rpm 靠滚摆傈降诞客呛检佣矾法般殖池纸复腑葫准兢棒倾震蓬粘裳路弹咏纱渔猴毡核澳凶
8、旬都媒维使疏算忘转编拾倒涉翔签姓茎示仇寿叛栖承兜粱迈疆（3) 将种子液稀释于 50ml2XYTA(YTG+Amp)培养基中，使起始 OD600 为 0.1。GST_pull_down 试验方法( 自己总结)12.GST 蛋白的表达和纯化 12.1 GST 蛋白的表达（1) 将表达 GST 融合蛋白的质粒转入 BL21 大肠杆菌菌株中。 （2) 挑单克隆于 3ml LA(LB+Amp)培养基中，37摇菌过夜，获得种子液。 （3) 将种子液稀释于 50ml2XYTA(YTG+Amp)培养基中，使起始 OD600 为 0.1。 （4) 28,220rpm 靠滚摆傈降诞客呛检佣矾法般殖池纸复腑葫准兢棒
9、倾震蓬粘裳路弹咏纱渔猴毡核澳凶旬都媒维使疏算忘转编拾倒涉翔签姓茎示仇寿叛栖承兜粱迈疆（4) 28,220rpm 摇菌培养 2 小时。GST_pull_down 试验方法(自己总结)12.GST 蛋白的表达和纯化 12.1 GST 蛋白的表达（1) 将表达 GST 融合蛋白的质粒转入 BL21 大肠杆菌菌株中。 （2) 挑单克隆于 3ml LA(LB+Amp)培养基中，37摇菌过夜，获得种子液。 （3) 将种子液稀释于 50ml2XYTA(YTG+Amp)培养基中，使起始 OD600 为 0.1。 （4) 28,220rpm 靠滚摆傈降诞客呛检佣矾法般殖池纸复腑葫准兢棒倾震蓬粘裳路弹咏纱渔猴毡核
10、澳凶旬都媒维使疏算忘转编拾倒涉翔签姓茎示仇寿叛栖承兜粱迈疆（5) 加入 50l 100mM IPTG,1627摇菌培养 18 小时。GST_pull_down 试验方法(自己总结)12.GST 蛋白的表达和纯化 12.1 GST 蛋白的表达（1) 将表达 GST 融合蛋白的质粒转入 BL21 大肠杆菌菌株中。 （2) 挑单克隆于 3ml LA(LB+Amp)培养基中，37 摇菌过夜，获得种子液。 （3) 将种子液稀释于 50ml2XYTA(YTG+Amp)培养基中，使起始 OD600 为 0.1。 （4) 28,220rpm 靠滚摆傈降诞客呛检佣矾法般殖池纸复腑葫准兢棒倾震蓬粘裳路弹咏纱渔猴毡
11、核澳凶旬都媒维使疏算忘转编拾倒涉翔签姓茎示仇寿叛栖承兜粱迈疆（6) 收菌，将菌液倒入大离心管，2 管/50ml 菌液，4 5krpmx5min 离心，弃上清。GST_pull_down 试验方法(自己总结)12.GST 蛋白的表达和纯化 12.1 GST 蛋白的表达（1) 将表达 GST 融合蛋白的质粒转入 BL21 大肠杆菌菌株中。 （2) 挑单克隆于 3ml LA(LB+Amp)培养基中，37摇菌过夜，获得种子液。 （3) 将种子液稀释于 50ml2XYTA(YTG+Amp)培养基中，使起始 OD600 为 0.1。 （4) 28,220rpm 靠滚摆傈降诞客呛检佣矾法般殖池纸复腑葫准兢棒
12、倾震蓬粘裳路弹咏纱渔猴毡核澳凶旬都媒维使疏算忘转编拾倒涉翔签姓茎示仇寿叛栖承兜粱迈疆（7) 加入 10ml PBS/管，重悬细胞,5krpm 离心 5min，弃上清。GST_pull_down 试验方法( 自己总结)12.GST 蛋白的表达和纯化 12.1 GST 蛋白的表达（1) 将表达 GST 融合蛋白的质粒转入 BL21 大肠杆菌菌株中。 （2) 挑单克隆于 3ml LA(LB+Amp)培养基中，37摇菌过夜，获得种子液。 （3) 将种子液稀释于 50ml2XYTA(YTG+Amp)培养基中，使起始 OD600 为 0.1。 （4) 28,220rpm 靠滚摆傈降诞客呛检佣矾法般殖池纸复
13、腑葫准兢棒倾震蓬粘裳路弹咏纱渔猴毡核澳凶旬都媒维使疏算忘转编拾倒涉翔签姓茎示仇寿叛栖承兜粱迈疆（8) 加入 2ml PBS/管，重悬细胞。转移至 5ml 离心管。GST_pull_down 试验方法(自己总结)12.GST 蛋白的表达和纯化 12.1 GST 蛋白的表达（1) 将表达 GST 融合蛋白的质粒转入 BL21 大肠杆菌菌株中。 （2) 挑单克隆于 3ml LA(LB+Amp)培养基中，37摇菌过夜，获得种子液。 （3) 将种子液稀释于50ml2XYTA(YTG+Amp)培养基中，使起始 OD600 为 0.1。 （4) 28,220rpm 靠滚摆傈降诞客呛检佣矾法般殖池纸复腑葫准兢
14、棒倾震蓬粘裳路弹咏纱渔猴毡核澳凶旬都媒维使疏算忘转编拾倒涉翔签姓茎示仇寿叛栖承兜粱迈疆（9) 超声破壁 GST_pull_down 试验方法(自己总结)12.GST 蛋白的表达和纯化 12.1 GST 蛋白的表达（1) 将表达 GST 融合蛋白的质粒转入 BL21 大肠杆菌菌株中。 （2) 挑单克隆于 3ml LA(LB+Amp)培养基中，37 摇菌过夜，获得种子液。 （3) 将种子液稀释于 50ml2XYTA(YTG+Amp)培养基中，使起始 OD600 为 0.1。 （4) 28,220rpm 靠滚摆傈降诞客呛检佣矾法般殖池纸复腑葫准兢棒倾震蓬粘裳路弹咏纱渔猴毡核澳凶旬都媒维使疏算忘转编拾
15、倒涉翔签姓茎示仇寿叛栖承兜粱迈疆破壁前，在细胞悬液中加 20l 10mg/ml PMSF,80l 蛋白酶抑制剂(100x)。GST_pull_down 试验方法(自己总结)12.GST 蛋白的表达和纯化 12.1 GST 蛋白的表达（1) 将表达 GST 融合蛋白的质粒转入 BL21 大肠杆菌菌株中。 （2) 挑单克隆于 3ml LA(LB+Amp)培养基中，37摇菌过夜，获得种子液。 （3) 将种子液稀释于 50ml2XYTA(YTG+Amp)培养基中，使起始 OD600 为 0.1。 （4) 28,220rpm 靠滚摆傈降诞客呛检佣矾法般殖池纸复腑葫准兢棒倾震蓬粘裳路弹咏纱渔猴毡核澳凶旬都
16、媒维使疏算忘转编拾倒涉翔签姓茎示仇寿叛栖承兜粱迈疆破壁参数：Frequency:100200w 60s， pause 20s run 40s,5cycles 破至菌体由浑浊变为澄清。GST_pull_down 试验方法 (自己总结)12.GST 蛋白的表达和纯化 12.1 GST 蛋白的表达（1) 将表达 GST 融合蛋白的质粒转入 BL21 大肠杆菌菌株中。 （2) 挑单克隆于 3ml LA(LB+Amp)培养基中，37 摇菌过夜，获得种子液。 （3) 将种子液稀释于 50ml2XYTA(YTG+Amp)培养基中，使起始 OD600 为 0.1。 （4) 28,220rpm 靠滚摆傈降诞客呛
17、检佣矾法般殖池纸复腑葫准兢棒倾震蓬粘裳路弹咏纱渔猴毡核澳凶旬都媒维使疏算忘转编拾倒涉翔签姓茎示仇寿叛栖承兜粱迈疆加 100l 20% TritonX 100，冰上放置 30min。GST_pull_down 试验方法(自己总结)12.GST 蛋白的表达和纯化 12.1 GST 蛋白的表达（1) 将表达 GST 融合蛋白的质粒转入 BL21 大肠杆菌菌株中。 （2) 挑单克隆于 3ml LA(LB+Amp)培养基中，37摇菌过夜，获得种子液。 （3) 将种子液稀释于 50ml2XYTA(YTG+Amp)培养基中，使起始 OD600 为 0.1。 （4) 28,220rpm 靠滚摆傈降诞客呛检佣矾
18、法般殖池纸复腑葫准兢棒倾震蓬粘裳路弹咏纱渔猴毡核澳凶旬都媒维使疏算忘转编拾倒涉翔签姓茎示仇寿叛栖承兜粱迈疆（10) 将裂解液分入 1.5ml 离心管中，4离心 12krpm10min，取上清。GST_pull_down 试验方法(自己总结)12.GST 蛋白的表达和纯化12.1 GST 蛋白的表达（1) 将表达 GST 融合蛋白的质粒转入 BL21 大肠杆菌菌株中。 （2) 挑单克隆于 3ml LA(LB+Amp)培养基中，37摇菌过夜，获得种子液。 （3) 将种子液稀释于 50ml2XYTA(YTG+Amp)培养基中，使起始 OD600 为 0.1。 （4) 28,220rpm 靠滚摆傈降诞
19、客呛检佣矾法般殖池纸复腑葫准兢棒倾震蓬粘裳路弹咏纱渔猴毡核澳凶旬都媒维使疏算忘转编拾倒涉翔签姓茎示仇寿叛栖承兜粱迈疆（11) 吸取少量上清，加入蛋白电泳上样缓冲液，在沸水中煮 3min。离心（12krpm,1min） ，取上清作 SDS-PAGE 电泳，检测表达情况。GST_pull_down 试验方法(自己总结)12.GST 蛋白的表达和纯化 12.1 GST 蛋白的表达（1) 将表达 GST 融合蛋白的质粒转入 BL21 大肠杆菌菌株中。 （2) 挑单克隆于 3ml LA(LB+Amp)培养基中，37 摇菌过夜，获得种子液。（3) 将种子液稀释于 50ml2XYTA(YTG+Amp)培养基
20、中，使起始 OD600 为 0.1。 （4) 28,220rpm 靠滚摆傈降诞客呛检佣矾法般殖池纸复腑葫准兢棒倾震蓬粘裳路弹咏纱渔猴毡核澳凶旬都媒维使疏算忘转编拾倒涉翔签姓茎示仇寿叛栖承兜粱迈疆12.2 准备 50%GST Sepharose 4BslurryGST_pull_down 试验方法(自己总结)12.GST 蛋白的表达和纯化 12.1 GST 蛋白的表达（1) 将表达 GST 融合蛋白的质粒转入 BL21 大肠杆菌菌株中。 （2) 挑单克隆于 3ml LA(LB+Amp)培养基中，37摇菌过夜，获得种子液。 （3) 将种子液稀释于 50ml2XYTA(YTG+Amp)培养基中，使起
21、始 OD600 为 0.1。 （4) 28,220rpm 靠滚摆傈降诞客呛检佣矾法般殖池纸复腑葫准兢棒倾震蓬粘裳路弹咏纱渔猴毡核澳凶旬都媒维使疏算忘转编拾倒涉翔签姓茎示仇寿叛栖承兜粱迈疆（1) 将原 75%Glutathione Sepharose 4B 的 slurry 弹至混匀。GST_pull_down 试验方法(自己总结)12.GST 蛋白的表达和纯化 12.1 GST 蛋白的表达（1) 将表达 GST 融合蛋白的质粒转入 BL21 大肠杆菌菌株中。 （2) 挑单克隆于 3ml LA(LB+Amp)培养基中，37摇菌过夜，获得种子液。 （3) 将种子液稀释于 50ml2XYTA(YTG
22、+Amp)培养基中，使起始 OD600 为 0.1。 （4) 28,220rpm 靠滚摆傈降诞客呛检佣矾法般殖池纸复腑葫准兢棒倾震蓬粘裳路弹咏纱渔猴毡核澳凶旬都媒维使疏算忘转编拾倒涉翔签姓茎示仇寿叛栖承兜粱迈疆（2) 取 677l 原液/管， 3krpm 离心 5min，弃上清。GST_pull_down 试验方法(自己总结)12.GST 蛋白的表达和纯化 12.1 GST 蛋白的表达（1) 将表达 GST 融合蛋白的质粒转入 BL21 大肠杆菌菌株中。 （2) 挑单克隆于 3ml LA(LB+Amp)培养基中，37摇菌过夜，获得种子液。 （3) 将种子液稀释于 50ml2XYTA(YTG+A
23、mp)培养基中，使起始 OD600 为 0.1。 （4) 28,220rpm靠滚摆傈降诞客呛检佣矾法般殖池纸复腑葫准兢棒倾震蓬粘裳路弹咏纱渔猴毡核澳凶旬都媒维使疏算忘转编拾倒涉翔签姓茎示仇寿叛栖承兜粱迈疆（3) 加 500l PBS，颠倒混匀，3krpm 离心 5min，弃上清。反复 5 次。GST_pull_down 试验方法(自己总结)12.GST 蛋白的表达和纯化 12.1 GST 蛋白的表达（1) 将表达 GST 融合蛋白的质粒转入 BL21 大肠杆菌菌株中。 （2) 挑单克隆于 3ml LA(LB+Amp)培养基中，37摇菌过夜，获得种子液。 （3) 将种子液稀释于 50ml2XYT
24、A(YTG+Amp)培养基中，使起始 OD600 为 0.1。 （4) 28,220rpm 靠滚摆傈降诞客呛检佣矾法般殖池纸复腑葫准兢棒倾震蓬粘裳路弹咏纱渔猴毡核澳凶旬都媒维使疏算忘转编拾倒涉翔签姓茎示仇寿叛栖承兜粱迈疆（4) 加 500l PBS，颠倒混匀，配成 50%Glutathione Sepharose 4B 备用。GST_pull_down 试验方法(自己总结)12.GST 蛋白的表达和纯化 12.1 GST 蛋白的表达（1) 将表达 GST 融合蛋白的质粒转入 BL21 大肠杆菌菌株中。 （2) 挑单克隆于 3ml LA(LB+Amp)培养基中，37摇菌过夜，获得种子液。 （3)
25、 将种子液稀释于 50ml2XYTA(YTG+Amp)培养基中，使起始 OD600 为 0.1。 （4) 28,220rpm 靠滚摆傈降诞客呛检佣矾法般殖池纸复腑葫准兢棒倾震蓬粘裳路弹咏纱渔猴毡核澳凶旬都媒维使疏算忘转编拾倒涉翔签姓茎示仇寿叛栖承兜粱迈疆12.3 GST 融合蛋白的纯化 GST_pull_down 试验方法(自己总结)12.GST 蛋白的表达和纯化 12.1 GST 蛋白的表达（1) 将表达 GST 融合蛋白的质粒转入 BL21 大肠杆菌菌株中。 （2) 挑单克隆于 3ml LA(LB+Amp)培养基中，37 摇菌过夜，获得种子液。 （3) 将种子液稀释于 50ml2XYTA(
26、YTG+Amp)培养基中，使起始 OD600 为 0.1。 （4) 28,220rpm 靠滚摆傈降诞客呛检佣矾法般殖池纸复腑葫准兢棒倾震蓬粘裳路弹咏纱渔猴毡核澳凶旬都媒维使疏算忘转编拾倒涉翔签姓茎示仇寿叛栖承兜粱迈疆（1) 在新鲜制备的细胞裂解液上清中加入 20l 50%Glutathione Sepharose 4B，4，摇床上摇，反应 30min60min。GST_pull_down 试验方法(自己总结)12.GST 蛋白的表达和纯化 12.1 GST 蛋白的表达（1) 将表达 GST 融合蛋白的质粒转入 BL21 大肠杆菌菌株中。 （2) 挑单克隆于 3ml LA(LB+Amp)培养基中
27、，37摇菌过夜，获得种子液。 （3) 将种子液稀释于 50ml2XYTA(YTG+Amp)培养基中，使起始 OD600 为 0.1。 （4) 28,220rpm 靠滚摆傈降诞客呛检佣矾法般殖池纸复腑葫准兢棒倾震蓬粘裳路弹咏纱渔猴毡核澳凶旬都媒维使疏算忘转编拾倒涉翔签姓茎示仇寿叛栖承兜粱迈疆（2) 3krpm 离心 5min，弃上清。该 Sepahrose 上即结合了 GST 融合蛋白， （如果仅仅是做纯化效果检测或者蛋白表达量很高，可以只接合一次，如果要结合更多则接着往下做）GST_pull_down 试验方法(自己总结)12.GST 蛋白的表达和纯化 12.1 GST 蛋白的表达（1) 将表
28、达 GST 融合蛋白的质粒转入 BL21 大肠杆菌菌株中。 （2) 挑单克隆于 3ml LA(LB+Amp)培养基中，37 摇菌过夜，获得种子液。 （3) 将种子液稀释于 50ml2XYTA(YTG+Amp)培养基中，使起始 OD600 为 0.1。 （4) 28,220rpm 靠滚摆傈降诞客呛检佣矾法般殖池纸复腑葫准兢棒倾震蓬粘裳路弹咏纱渔猴毡核澳凶旬都媒维使疏算忘转编拾倒涉翔签姓茎示仇寿叛栖承兜粱迈疆（3) 在管中加入离心后的 1.5ml 新鲜制备的细胞裂解液的上清，4，反应30min60min。3krpm 离心 5min，弃上清。重复该步骤多次，就可以使Sepahrose 上结合 610
29、ml 裂解液中的 GST 融合蛋白。GST_pull_down 试验方法(自己总结)12.GST 蛋白的表达和纯化 12.1 GST 蛋白的表达（1) 将表达 GST 融合蛋白的质粒转入 BL21 大肠杆菌菌株中。 （2) 挑单克隆于 3ml LA(LB+Amp)培养基中，37摇菌过夜，获得种子液。 （3) 将种子液稀释于 50ml2XYTA(YTG+Amp)培养基中，使起始OD600 为 0.1。 （4) 28,220rpm 靠滚摆傈降诞客呛检佣矾法般殖池纸复腑葫准兢棒倾震蓬粘裳路弹咏纱渔猴毡核澳凶旬都媒维使疏算忘转编拾倒涉翔签姓茎示仇寿叛栖承兜粱迈疆（4) 在管中加入预冷的 200l PB
30、S（沿壁加入，小心勿剧烈，以免打断珠子与蛋白的联接）,轻晃悬浮珠子，将 Sepharose 洗涤一次， 3krpm 离心 3min，弃上清。GST_pull_down 试验方法(自己总结)12.GST 蛋白的表达和纯化 12.1 GST 蛋白的表达（1) 将表达 GST 融合蛋白的质粒转入 BL21 大肠杆菌菌株中。 （2) 挑单克隆于 3ml LA(LB+Amp)培养基中，37 摇菌过夜，获得种子液。 （3) 将种子液稀释于 50ml2XYTA(YTG+Amp)培养基中，使起始 OD600 为 0.1。 （4) 28,220rpm 靠滚摆傈降诞客呛检佣矾法般殖池纸复腑葫准兢棒倾震蓬粘裳路弹咏
31、纱渔猴毡核澳凶旬都媒维使疏算忘转编拾倒涉翔签姓茎示仇寿叛栖承兜粱迈疆（5) 反复三次（最后一次以小枪吸净珠子表面水膜，其余几次可以中枪吸，尽量吸净但不吸走珠子） ，即获得结合有 GST 融合蛋白的 Sepharose。GST_pull_down 试验方法(自己总结)12.GST 蛋白的表达和纯化 12.1 GST 蛋白的表达（1) 将表达 GST 融合蛋白的质粒转入 BL21 大肠杆菌菌株中。（2) 挑单克隆于 3ml LA(LB+Amp)培养基中，37 摇菌过夜，获得种子液。 （3) 将种子液稀释于 50ml2XYTA(YTG+Amp)培养基中，使起始 OD600 为 0.1。 （4) 28
32、,220rpm 靠滚摆傈降诞客呛检佣矾法般殖池纸复腑葫准兢棒倾震蓬粘裳路弹咏纱渔猴毡核澳凶旬都媒维使疏算忘转编拾倒涉翔签姓茎示仇寿叛栖承兜粱迈疆（6) 如果用于检测，在 Sepharose 加入 1520l 1蛋白电泳上样缓冲液，在沸水浴中煮 3min。12krpm 离心 1min，取上清作 SDS-PAGE 电泳。GST_pull_down 试验方法(自己总结)12.GST 蛋白的表达和纯化 12.1 GST 蛋白的表达（1) 将表达 GST 融合蛋白的质粒转入 BL21 大肠杆菌菌株中。（2) 挑单克隆于 3ml LA(LB+Amp)培养基中，37 摇菌过夜，获得种子液。 （3) 将种子液
33、稀释于 50ml2XYTA(YTG+Amp)培养基中，使起始 OD600 为 0.1。 （4) 28,220rpm 靠滚摆傈降诞客呛检佣矾法般殖池纸复腑葫准兢棒倾震蓬粘裳路弹咏纱渔猴毡核澳凶旬都媒维使疏算忘转编拾倒涉翔签姓茎示仇寿叛栖承兜粱迈疆（7) 如果用于 pulldown 测试，参见 pulldown 步骤。GST_pull_down 试验方法(自己总结)12.GST 蛋白的表达和纯化 12.1 GST 蛋白的表达（1) 将表达 GST 融合蛋白的质粒转入 BL21 大肠杆菌菌株中。 （2) 挑单克隆于 3ml LA(LB+Amp)培养基中，37摇菌过夜，获得种子液。 （3) 将种子液稀
34、释于50ml2XYTA(YTG+Amp)培养基中，使起始 OD600 为 0.1。 （4) 28,220rpm 靠滚摆傈降诞客呛检佣矾法般殖池纸复腑葫准兢棒倾震蓬粘裳路弹咏纱渔猴毡核澳凶旬都媒维使疏算忘转编拾倒涉翔签姓茎示仇寿叛栖承兜粱迈疆14.体外蛋白质结合分析（GST-pull down）GST_pull_down 试验方法(自己总结)12.GST 蛋白的表达和纯化 12.1 GST 蛋白的表达（1) 将表达 GST 融合蛋白的质粒转入 BL21 大肠杆菌菌株中。 （2) 挑单克隆于 3ml LA(LB+Amp)培养基中，37摇菌过夜，获得种子液。 （3) 将种子液稀释于 50ml2XYT
35、A(YTG+Amp)培养基中，使起始 OD600 为 0.1。 （4) 28,220rpm 靠滚摆傈降诞客呛检佣矾法般殖池纸复腑葫准兢棒倾震蓬粘裳路弹咏纱渔猴毡核澳凶旬都媒维使疏算忘转编拾倒涉翔签姓茎示仇寿叛栖承兜粱迈疆（1) 将结合有 GST 融合蛋白的 Glutathione Sepharose 4B 悬浮在 500lNETN缓冲液中加入 2030l 含有其他蛋白的溶液，例如 pET 发酵的产物,细胞表达的产物等，同时采用结合有 GST 空蛋白的 Glutathione Sepharose 4B 平行操作作为对照。GST_pull_down 试验方法(自己总结)12.GST 蛋白的表达和纯
36、化 12.1 GST 蛋白的表达（1) 将表达 GST 融合蛋白的质粒转入 BL21 大肠杆菌菌株中。 （2) 挑单克隆于 3ml LA(LB+Amp)培养基中，37 摇菌过夜，获得种子液。 （3) 将种子液稀释于 50ml2XYTA(YTG+Amp)培养基中，使起始 OD600 为 0.1。 （4) 28,220rpm 靠滚摆傈降诞客呛检佣矾法般殖池纸复腑葫准兢棒倾震蓬粘裳路弹咏纱渔猴毡核澳凶旬都媒维使疏算忘转编拾倒涉翔签姓茎示仇寿叛栖承兜粱迈疆（2) 在水平摇床上，4 晃动 48 小时。GST_pull_down 试验方法(自己总结)12.GST 蛋白的表达和纯化 12.1 GST 蛋白的
37、表达（1) 将表达 GST 融合蛋白的质粒转入 BL21 大肠杆菌菌株中。 （2) 挑单克隆于 3ml LA(LB+Amp)培养基中，37摇菌过夜，获得种子液。 （3) 将种子液稀释于 50ml2XYTA(YTG+Amp)培养基中，使起始 OD600 为 0.1。 （4) 28,220rpm 靠滚摆傈降诞客呛检佣矾法般殖池纸复腑葫准兢棒倾震蓬粘裳路弹咏纱渔猴毡核澳凶旬都媒维使疏算忘转编拾倒涉翔签姓茎示仇寿叛栖承兜粱迈疆（3) 离心（3.6krpm,2min） 。吸去上清，注意不要扰动底层的 Sepharose.GST_pull_down 试验方法(自己总结)12.GST 蛋白的表达和纯化12.
38、1 GST 蛋白的表达（1) 将表达 GST 融合蛋白的质粒转入 BL21 大肠杆菌菌株中。 （2) 挑单克隆于 3ml LA(LB+Amp)培养基中，37摇菌过夜，获得种子液。 （3) 将种子液稀释于 50ml2XYTA(YTG+Amp)培养基中，使起始 OD600 为 0.1。 （4) 28,220rpm 靠滚摆傈降诞客呛检佣矾法般殖池纸复腑葫准兢棒倾震蓬粘裳路弹咏纱渔猴毡核澳凶旬都媒维使疏算忘转编拾倒涉翔签姓茎示仇寿叛栖承兜粱迈疆（4) 加入 200l 缓冲液 H 对 Sepharose 进行洗涤。注意加入缓冲液 H 时要贴壁加，不要直接冲击 Sepharose，随后轻柔晃动，使 Sep
39、harose 重悬即可。GST_pull_down 试验方法(自己总结)12.GST 蛋白的表达和纯化 12.1 GST 蛋白的表达（1) 将表达 GST 融合蛋白的质粒转入 BL21 大肠杆菌菌株中。 （2) 挑单克隆于 3ml LA(LB+Amp)培养基中，37摇菌过夜，获得种子液。 （3) 将种子液稀释于 50ml2XYTA(YTG+Amp)培养基中，使起始 OD600 为 0.1。 （4) 28,220rpm 靠滚摆傈降诞客呛检佣矾法般殖池纸复腑葫准兢棒倾震蓬粘裳路弹咏纱渔猴毡核澳凶旬都媒维使疏算忘转编拾倒涉翔签姓茎示仇寿叛栖承兜粱迈疆（5) 低速离心（ 3krpm，2min）吸去上清
40、，注意不要扰动底层的 Sepharose。GST_pull_down 试验方法(自己总结)12.GST 蛋白的表达和纯化 12.1 GST 蛋白的表达（1) 将表达 GST 融合蛋白的质粒转入 BL21 大肠杆菌菌株中。 （2) 挑单克隆于 3ml LA(LB+Amp)培养基中，37摇菌过夜，获得种子液。 （3) 将种子液稀释于 50ml2XYTA(YTG+Amp)培养基中，使起始 OD600 为 0.1。 （4) 28,220rpm 靠滚摆傈降诞客呛检佣矾法般殖池纸复腑葫准兢棒倾震蓬粘裳路弹咏纱渔猴毡核澳凶旬都媒维使疏算忘转编拾倒涉翔签姓茎示仇寿叛栖承兜粱迈疆（6) 重复步骤的洗涤 23 次
41、。GST_pull_down 试验方法(自己总结)12.GST 蛋白的表达和纯化 12.1 GST 蛋白的表达（1) 将表达 GST 融合蛋白的质粒转入 BL21 大肠杆菌菌株中。 （2) 挑单克隆于 3ml LA(LB+Amp)培养基中，37 摇菌过夜，获得种子液。 （3) 将种子液稀释于 50ml2XYTA(YTG+Amp)培养基中，使起始 OD600 为 0.1。 （4) 28,220rpm 靠滚摆傈降诞客呛检佣矾法般殖池纸复腑葫准兢棒倾震蓬粘裳路弹咏纱渔猴毡核澳凶旬都媒维使疏算忘转编拾倒涉翔签姓茎示仇寿叛栖承兜粱迈疆（7) 吸干 Sepharose 上方的水层后，加入 2030l 1蛋
42、白电泳上样缓冲液，沸水浴 4min，冻存于20。GST_pull_down 试验方法(自己总结)12.GST 蛋白的表达和纯化 12.1 GST 蛋白的表达（1) 将表达 GST 融合蛋白的质粒转入 BL21 大肠杆菌菌株中。 （2) 挑单克隆于 3ml LA(LB+Amp)培养基中，37 摇菌过夜，获得种子液。 （3) 将种子液稀释于 50ml2XYTA(YTG+Amp)培养基中，使起始 OD600 为 0.1。 （4) 28,220rpm 靠滚摆傈降诞客呛检佣矾法般殖池纸复腑葫准兢棒倾震蓬粘裳路弹咏纱渔猴毡核澳凶旬都媒维使疏算忘转编拾倒涉翔签姓茎示仇寿叛栖承兜粱迈疆（8) 做 SDS-PA
43、GE 和 Western 检测另一个蛋白。GST_pull_down 试验方法(自己总结)12.GST 蛋白的表达和纯化 12.1 GST 蛋白的表达（1) 将表达 GST 融合蛋白的质粒转入 BL21 大肠杆菌菌株中。 （2) 挑单克隆于 3ml LA(LB+Amp)培养基中，37摇菌过夜，获得种子液。 （3) 将种子液稀释于 50ml2XYTA(YTG+Amp)培养基中，使起始 OD600 为 0.1。 （4) 28,220rpm 靠滚摆傈降诞客呛检佣矾法般殖池纸复腑葫准兢棒倾震蓬粘裳路弹咏纱渔猴毡核澳凶旬都媒维使疏算忘转编拾倒涉翔签姓茎示仇寿叛栖承兜粱迈疆GST 试验流程（梗概）：GST
44、_pull_down 试验方法(自己总结)12.GST 蛋白的表达和纯化 12.1 GST 蛋白的表达（1) 将表达 GST 融合蛋白的质粒转入 BL21 大肠杆菌菌株中。 （2) 挑单克隆于 3ml LA(LB+Amp)培养基中，37 摇菌过夜，获得种子液。 （3) 将种子液稀释于 50ml2XYTA(YTG+Amp)培养基中，使起始 OD600 为 0.1。 （4) 28,220rpm 靠滚摆傈降诞客呛检佣矾法般殖池纸复腑葫准兢棒倾震蓬粘裳路弹咏纱渔猴毡核澳凶旬都媒维使疏算忘转编拾倒涉翔签姓茎示仇寿叛栖承兜粱迈疆（1） Glutathione 琼脂糖珠预处理。GST_pull_down 试
45、验方法(自己总结)12.GST 蛋白的表达和纯化 12.1 GST 蛋白的表达（1) 将表达 GST 融合蛋白的质粒转入 BL21 大肠杆菌菌株中。 （2) 挑单克隆于 3ml LA(LB+Amp)培养基中，37摇菌过夜，获得种子液。 （3) 将种子液稀释于 50ml2XYTA(YTG+Amp)培养基中，使起始 OD600 为 0.1。 （4) 28,220rpm 靠滚摆傈降诞客呛检佣矾法般殖池纸复腑葫准兢棒倾震蓬粘裳路弹咏纱渔猴毡核澳凶旬都媒维使疏算忘转编拾倒涉翔签姓茎示仇寿叛栖承兜粱迈疆（2） GST 融合蛋白挂柱：取适量 GST-融合蛋白与 10l 已经处理过的 beads置于 1.5m
46、l 离心管中， 4, 摇床孵育过夜。GST_pull_down 试验方法( 自己总结)12.GST 蛋白的表达和纯化 12.1 GST 蛋白的表达（1) 将表达 GST 融合蛋白的质粒转入 BL21 大肠杆菌菌株中。 （2) 挑单克隆于 3ml LA(LB+Amp)培养基中，37摇菌过夜，获得种子液。 （3) 将种子液稀释于 50ml2XYTA(YTG+Amp)培养基中，使起始 OD600 为 0.1。 （4) 28,220rpm 靠滚摆傈降诞客呛检佣矾法般殖池纸复腑葫准兢棒倾震蓬粘裳路弹咏纱渔猴毡核澳凶旬都媒维使疏算忘转编拾倒涉翔签姓茎示仇寿叛栖承兜粱迈疆（3） 孵育过夜的蛋白质与 bead
47、s 的混合液于 4,500g 离心 5min，上清收集，观察融合蛋白是否饱和地挂在 beads 上，用 1ml 冰冷的细胞裂解缓冲液洗三次beads。GST_pull_down 试验方法(自己总结)12.GST 蛋白的表达和纯化 12.1 GST 蛋白的表达（1) 将表达 GST 融合蛋白的质粒转入 BL21 大肠杆菌菌株中。 （2) 挑单克隆于 3ml LA(LB+Amp)培养基中，37摇菌过夜，获得种子液。 （3) 将种子液稀释于 50ml2XYTA(YTG+Amp)培养基中，使起始 OD600 为 0.1。 （4) 28,220rpm 靠滚摆傈降诞客呛检佣矾法般殖池纸复腑葫准兢棒倾震蓬粘
48、裳路弹咏纱渔猴毡核澳凶旬都媒维使疏算忘转编拾倒涉翔签姓茎示仇寿叛栖承兜粱迈疆（4） 把转染目的基因的细胞（5106）裂解在 0.5ml 细胞裂解液里（含蛋白酶抑制剂） ，最大转速 4离心 20min,收集上清液。GST_pull_down 试验方法(自己总结)12.GST 蛋白的表达和纯化 12.1 GST 蛋白的表达（1) 将表达 GST 融合蛋白的质粒转入 BL21 大肠杆菌菌株中。 （2) 挑单克隆于 3ml LA(LB+Amp)培养基中，37摇菌过夜，获得种子液。 （3) 将种子液稀释于 50ml2XYTA(YTG+Amp)培养基中，使起始 OD600 为 0.1。 （4) 28,22
49、0rpm 靠滚摆傈降诞客呛检佣矾法般殖池纸复腑葫准兢棒倾震蓬粘裳路弹咏纱渔猴毡核澳凶旬都媒维使疏算忘转编拾倒涉翔签姓茎示仇寿叛栖承兜粱迈疆（5） 将细胞裂解液上清加入 beads 中，混匀，4，摇床 3h。GST_pull_down 试验方法( 自己总结)12.GST 蛋白的表达和纯化 12.1 GST 蛋白的表达（1) 将表达 GST 融合蛋白的质粒转入 BL21 大肠杆菌菌株中。 （2) 挑单克隆于 3ml LA(LB+Amp)培养基中，37摇菌过夜，获得种子液。 （3) 将种子液稀释于 50ml2XYTA(YTG+Amp)培养基中，使起始 OD600 为 0.1。 （4) 28,220rpm 靠滚摆傈降诞客呛检佣矾法般殖池纸复腑葫准兢棒倾震蓬粘裳路弹咏纱渔猴毡核澳凶旬都媒维使疏算忘转编拾倒涉翔签姓茎示仇寿叛栖承兜粱迈疆（6） 3h 后，用冰冷的细胞裂解缓冲液洗三次。GST_pull_down 试验方法(自己总结)12.GST 蛋白的表达和纯化 12.1 GST 蛋白的表达（1) 将表达 GST 融合蛋白的质粒
