1、生物化学论文题 目：应乐果甜蛋白介绍专业班级：XXX学 号：XXX学生姓名：XXX日期：2012 年 12月 15日应乐果甜蛋白介绍应乐果甜蛋白（monellin）是从一种叫 Dioscoreophyllum cumminsii的热带植物的浆果中提取出来的。1972 年，美国的Monell化学研究中心从 Dioscoreophyllum cumminsii中分离出该低分子量的甜 味蛋白，所以应乐果蛋白也称莫内甜蛋白。应乐果甜蛋白是一种超甜蛋白。其甜度极高，按摩尔比是蔗糖的 10万余倍，按重量计是蔗糖的 3000-4000倍。应乐果甜蛋白分子由 94个氨基酸组成，分为 A、B 两条链。其中 A链
2、 44个氨基酸，B链 50个氨基酸。这两条链是通过非共价相互作用而结合在一起的。自然存在的 A链和 B链不完全一致，其中 90%的 A链以 Arg开始，10%的 A链以 Phe-Arg开始。57%的 B链以 Gly-Glu开始，24%的 B链以 Glu开始，另有 19%的 B链以 Thr-Gly-Glu开始。应乐果甜蛋白的分子量是 10.7kD。它的分子结合紧密，没有大环；分子借助两条链之间的氢键和疏水键使结构稳定。分子内有 5个反向平行的 折叠链，其中 2条来自 B链，3 条来自 A链。B 链唯一一个 螺旋位于 折叠的凹部。 螺旋的相对取向对应乐果甜蛋白至关重要。在乙醇和三氟乙醇 1:1的混
3、合溶液中，A 链能发生结构重组，由 折叠转变成 螺旋。应乐果甜蛋白和其他甜味蛋白整体结构明显不同，但均能产生甜味，这说明甜味蛋白的功能部位是局部的，很可能只相当于一到几个氨基酸所占的空间结构，而分子中其他部位可能是维持功能部位立体结构的。这样看来，应乐果甜味蛋白的特别可能是因为特异氨基酸的定点突变，已经有研究表明，一些甜味物质是通过羧基与受体结合而引发甜味的，应乐果甜蛋白的甜度远高于同重的蔗糖，可能是因为突变减少了非特异性羧基与甜味受体结合的机会。无机盐离子对应乐果甜蛋白的甜味也会产生影响，尤其是Ca2+。Ca 2+缺乏时，会抑制应乐果甜蛋白的甜味。而浓度为 0.2g/L的应乐果甜蛋白与磷酸盐
4、、EDTA 在 pH5.8时反应，其甜味会丧失，这也归因于溶液中 Ca2+浓度下降。Ca 2+之所以能影响应乐果甜蛋白的甜味，可能与味细胞中的 Ca2+通道及 Ca2+中介的阳离子通道有关。应乐果甜蛋白具有低热量，高甜度，多食不会引起龋齿，适合于糖尿病患者食用等优点。因此，有可能取代蔗糖成为一种新型甜味剂。但 D.Cumminisii这种热带植物很难在其他地区引种成功，使得直接从这种植物中提取应乐果甜蛋白难以形成较大规模，因此人们便把希望寄托在应乐果甜蛋白的基因工程上。研究人员通过一段连接序列（linker）将 A链和 8链连接起来，制备了一条应乐果甜蛋白的单链类似物 SCM，并将其在大肠杆菌
5、中进行表达。结果发现表达产物不仅具有甜味，而且还有很好的热稳定性和更大范围的值耐受力。应乐果甜蛋白在酸性条件下加热到 50以上时便丧失了甜味，这也限制应乐果甜蛋白作为甜味剂的使用，单链应乐果甜蛋白在大肠杆菌中表达成功，热稳定性增加，为更好地开发应乐果甜蛋白打下了基础。此外，单链应乐果甜蛋白在大肠杆菌中表达的成功，使得通过基因重组技术 来生产应乐果甜蛋白成为可能。在应乐果甜蛋白转基因研究上另一个重要事件是应乐果甜蛋白在土豆和莴苣中转化成功。研究人员将单链应乐果甜蛋白基因构建不同的表达载体，分别转人土豆和莴苣中，得到的表达产物能达到总蛋白质含量的 1%，并且检测到甜味。这个实验的意义在于第一次使应
6、乐果甜蛋白的甜味特性在高等植物中表达，而土豆是全世界广泛栽培的， 这使得通过转基因技术大规模提取应乐果甜蛋白成为可能。另一方面，应乐果甜蛋白既然能在土豆、莴苣中转化成功,那么就可能在其他作物种转化成功，为改善作物口味开辟了一条新的途径。1997年，Kondo 等用一个 Gly残基将应乐果甜蛋白的 A、B 链连起来，形成一个应乐果甜蛋白的单链类似物，然后将单链应乐果甜蛋白基因置于甘油醛-3-磷酸-脱羧酶启动子下游,构建表达载体，转化酵母 Candida Utilis，得到的表达产物占到可溶蛋白的 50%以上,单产达 10mg/g湿重，这个产量等于甚至于超过了自然提取的的应乐果甜蛋白的产量。这使得通过工业化生产获得一种廉价的甜味剂变得可行。1999年，崔洪志等合成单链应乐果甜蛋白基因,转化大肠杆菌BL21进行表达，表达产物不仅具有甜味，更重要的是其产量占菌体可溶性蛋白的 22.8%。随后他们通过对 SCM进行定点突变，优化发酵条件，得到了甜度、产量更高的表达产物，表达量达到菌体可溶性蛋白的 40%以上。
