1、I南瓜种籽中活性物质提取工艺的优化摘要: 南瓜籽中含有丰富的植物甾醇，角鲨烯， 维生素 E、胡罗卜素等活性物质，其中植物甾醇，角鲨烯， 维生素 E 都属于不皂化物的重要组成部分。本试验首先进行单因素实验，以不皂化物的提取率为指标，考察不同皂化时间、皂化温度、液料比、KOH-乙醇溶液浓度四个因素对南瓜籽中不皂化物质提取量的影响，在单因素实验的基础上，再选用响应面（RSM）法，优化最佳皂化工艺条件。最终确定在皂化时间为 1.5h、皂化温度为 69、液料比为 10mL/g 和 KOH-乙醇浓度为 2mol/L 时，不皂化物的理论得率为 1.37%。关键词：南瓜种籽 活性物质 提取 优化前言1.1 南
2、瓜籽简介南瓜（Cucurbit moschata Duch） ，属葫芦科一年生草本植物，又名倭瓜、番瓜、饭瓜、窝瓜等。南瓜以其营养价值极高被世界营养学家公认为是 21 世纪的保健食品。南瓜的果实、茎、叶、花朵和种子中含有丰富的胡罗卜素、多糖、南瓜子氨酸、环丙基氨基酸（CTY） 、南瓜子碱、葫芦巴碱、膳食纤维、抗菌活性蛋白，植物甾醇，角鲨烯，维生素 E 等 1。特别是由于科学技术的发展，国外一些科学技术先进的国家对南瓜所具有的保健功能有了更多新的发现，并对过去已知和新发现的这些功能给予很高评价，从而显著地提高了南瓜在蔬菜生产和加工领域的地位，南瓜生产和消费迅速发展。南瓜籽味甘、性温, 归脾、胃、
3、大肠经 , 有驱虫、下乳、健脾、利水之功效 , 主治绦虫、蛔虫、钩虫病、百日咳、产后缺乳、腹胀、产后手足浮肿、痔疮等症 2。南瓜籽中油脂量较高, 其保健功效成分主要存在于南瓜籽油中 , 油脂成分占到干质量的 35%50%, 最高的可达到 64. 4%3。南瓜种子中含有丰富的植物甾醇，角鲨烯，维生素 E、胡罗卜素等活性物质。具有驱除寄生虫、降低胆固醇、抗炎、抗氧化、缓解高血压、治疗和预防前列腺增生等作用。虽然我国籽用南瓜的栽培面积逐年扩大，但是籽用南瓜的加工利用很少，没有进行南瓜籽的深层开发。1.2 不皂化物简介不皂化物包括自然界中的脂类物质如甾醇，烃类，醇类，脂肪族和萜烯醇类等。不皂化物：在本
4、标准规定的操作条件下，试样用氢氧化钾皂化后的全部生成物用一种特定的溶剂提取，蒸发溶剂、干燥后的残留物,用质量百分含量表示。 生育酚，脂肪醇，角鲨烯和植物甾醇等属于不皂化物的组成部分 4-6，其中植物甾醇占重要部分 7,除了南瓜籽等 3 种籽油外，几乎所有的油不皂化物中甾醇部分占大约 30%8，研究表明，南瓜籽不皂化物中含有植物甾醇（-谷甾醇和豆甾醇 33.3mg/100 g 籽)，角鲨II烯(89.0mg/100 g 籽)和生育酚(15.7mg/100 g 籽) 9。油不皂化物中含有角鲨烯，角鲨烯是三萜类开环化合物, 是甾醇和 4-甲基甾醇的生源前体, 有助于提高油类的氧化稳定性 10，油不皂
5、化物含有生育酚和甾醇具有抗氧化作用，对油的稳定性起到重要作用，可考虑不皂化物作为天然抗氧化剂使用 11。2 试验材料与方法 2.1 原料来源本试验选用黑龙江省宝库 1 号裸仁南瓜籽为原料，由黑龙江省讷河市宝库良种繁育研究所提供。2.2 仪器与试剂2.2.1 仪器 仪器名称 生产公司W201 恒温浴锅 上海申胜生物技术有限公司电热恒温水浴锅 上海市医疗器械五厂202-2A 型电热恒温干燥箱 天津市泰斯特仪器有限公司B 型玻璃仪器气流烘干器 郑州杜甫仪器厂R-205 旋转蒸发仪 上海申胜生物技术有限公司SHB-3 型循环水多用真空泵 郑州杜甫仪器厂SHB-型循环水多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司
6、FW100 型高速万能粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司电子天平 上海梅特勒托利多仪器有限公司2.2.2 试剂 试剂名称 纯度 试剂来源无水乙醇 分析纯 天津市天力化学试剂有限公司正己烷 分析纯 天津市天力化学试剂有限公司氢氧化 分析纯 天津市天力化学试剂有限公司盐酸 分析纯 天津市科密欧化学试剂有限公司无水硫酸钠 分析纯 天津市天力化学试剂有限公司乙醚 分析纯 天津市天力化学试剂有限公司2.3 试验方法III2.3.1 南瓜籽粉的制备南瓜籽经过筛选，除去杂质后粉碎过筛，储存于-20冰箱中，备用。2.3.2 实验流程及原理实验流程见图 2-1：不不不不 HCl-不不 不不 不不 不不不不不不不K
7、OH-不不 不不不不不不 不不 不不不不不 不不不不不不不不不不不不不不 不不不/不不不1:不不不图 2-1 南瓜籽中提取不皂化物实验流程实验原理见图 2-2：图 2-2 南瓜籽中提取不皂化物实验原理2.3.3 南瓜种籽中提取不皂化物质最佳皂化条件研究首先进行单因素实验，考察不同料液比、KOH-乙醇溶液浓度、皂化时间和皂化温度IV这四个因素对非皂化物质提取率的影响，确定较优水平；在单因素实验的基础上，再选用响应面安排试验，对试验结果进行优化，从而确定最佳皂化工艺条件。2.3.3.1 不同皂化时间对南瓜种籽中不皂化物质提取率的影响精确称取 2 g 样品，在优化后酸解条件的基础上，以液料比为 15
8、 mL/g 加入 0.5 mol/L的 KOH-乙醇溶液 ，于温度为 80水浴上回流加热，皂化时间分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，考察不同皂化时间对不皂化物提取的影响，每项实验重复三次。2.3.3.2 不同皂化温度对南瓜种籽对不皂化物质提取率的影响精确称取2 g样品，以液料比为15 mL/g加入0.5 mol/L KOH-乙醇溶液，分别在温度为30、40、50、60、70、80、90条件下进行皂化，皂化时间为1 h，研究不同皂化温度对不皂化物提取的影响，每项实验重复三次。2.3.3.3 不同液料比对南瓜种籽中不皂化物质提取率的影响 精确称取2 g样品，分别以液料比为5、10、
9、15、20、25 mL/g加入0.5 mol/L KOH-乙醇溶液，于皂化温度为80，皂化时间1 h条件下进行皂化处理，研究不同液料比对不皂化物提取的影响，每项实验重复三次。2.3.3.4 不同 KOH-乙醇溶液浓度对南瓜种籽中不皂化物质提取率的影响精确称取2 g样品，以液料比为15 mL/g分别加入浓度为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mol/L KOH-乙醇溶液，于皂化温度为 80，皂化时间1 h条件下进行皂化反应，研究不同KOH-乙醇溶液浓度对不皂化物提取的影响，每项实验重复三次。2.3.4 响应面法确定不皂化物最佳皂化工艺参数2.3.4.1 响应面实验通过以上单因素试验，确定液
10、料比、KOH-乙醇溶液浓度、皂化时间和皂化温度这四个因素的较优水平，用响应面法设计实验。2.3.4.2 响应面验证实验精确称取2 g样品，按响应面实验得出的最优皂化工艺条件进行实验，实验重复三次。对试验结果进行分析，确定不皂化物最佳皂化工艺条件。3 结果与分析 3.1 南瓜种籽中提取不皂化物质最佳皂化条件研究3.1.1 不同皂化时间对南瓜种籽中不皂化物质提取率的影响不同皂化时间对南瓜种籽中不皂化物质提取率的影响，见图 3-1：V0.00.20.40.60.81.01.20.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0皂 化 时 间 （ h）不皂化物提取率（%）图 3-1 不同皂化时间对不皂化物提
11、取率的影响在图 3-1 中可以看出在不同皂化时间对南瓜种籽中不皂化物质提取率的影响的单因素实验中，皂化时间较短时，南瓜籽组织中的结合态的活性物质还没有完全与 KOH-乙醇溶液反应中，收率不高，但是随着皂化时间的加长，到 1.5h，不皂化物的提取率显著的上升，并达到最高值。但是超过 1.5h 收率开始缓慢下降，原因是随着皂化时间的加长，提取出的不皂化物容易在长时间皂化条件下发生包裹，影响了不皂化物的提出，最后确定皂化时间选择 1.5h 为宜。3.1.2 不同皂化温度对南瓜种籽中不皂化物质提取率的影响不同皂化温度对南瓜种籽中不皂化物质提取率的影响见图 3-2：0.000.200.400.600.8
12、01.001.201.401.601.8030 40 50 60 70 80 90皂 化 温 度 （ ）不皂化物提取率（%）图 3-2 不同皂化温度中对皂化物提取率的影响在图 3-2 中可以看出在不同皂化温度对南瓜种籽中不皂化物质提取率的影响的单因素实验中，在皂化温度很低时，南瓜籽脂萃取物与 KOH-乙醇溶液不能充分反应，甚至没有发生反应，所以提取出不皂化物含量少，但是随着皂化温度的升高，到 70，不皂化物的含量显著的上升，并达到最高值。但是超过 70含量开始下降，最后确定皂化温度选择60为宜。VI3.1.3 不同液料比对南瓜种籽中不皂化物质提取率的影响不同液料比对南瓜种籽中不皂化物质提取率的
13、影响见图 3-3： 0.000.100.200.300.400.500.600.700.800.905 10 15 20 25液 料 比 （ mL/g）不皂化物提取率（%）图 3-3 不同液料比对不皂化物提取率的影响在图 3-3 中可以看出在不同液料比对南瓜种籽中不皂化物质提取率的影响的单因素实验中，从 5：1 开始不皂化物质提取量开始升高，10:1 时达到最高值，之后随着液料比的增大，提取量逐渐减小，是因为当南瓜籽脂提取物与碱已经充分接触，继续增加液料比会降低溶液浓度，从而提取率降低，所以液料比选择 10:1 为宜。3.1.4 不同 KOH-乙醇溶液浓度对不皂化物质提取率的影响不同 KOH-
14、乙醇溶液浓度对南瓜种籽中不皂化物质提取率的影响见图 3-4：0.000.200.400.600.801.001.201.400.5 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0KOH-乙 醇 浓 度 （ mol/L）不皂化物提取率（%）图 3-4 不同 KOH-乙醇溶液浓度对不皂化物提取率的影响在图 3-4 中可以看出在不同 KOH-乙醇溶液浓度对南瓜种籽中不皂化物质提取率的影响的单因素实验中，当 KOH-乙醇浓度较低时，皂化反应不完全，因而提取率随着浓度的增大而增高，当浓度达到 2mol/L 时达到最高，之后再增大碱的浓度，提取率缓慢降低，因而确定 KOH-乙醇溶液浓度为 2mol/L 为宜。VI
15、I3.2 响应面法确定不皂化物最佳酸解工艺参数响应面的优化完整的设计为表 1 所列的由南瓜籽中不皂化物提取的单因素实验统计计算出的 29 个组合，其中包括由南瓜籽中提取不皂化物质的单因素实验确定的五个重复的中心点（见表 2）和其他 24 组结果（见表 2） 。表中 A 为皂化时间、 B 为皂化温度、C 为液料比和 D 为 KOH-乙醇溶液浓度。表 1. 设计实验测试的因素和水平因素 Low level (1) Medium level (0) High level (+1)皂化时间（A,h） 1.0 1.5 2.0皂化温度（B, ） 60 70 80液料比 （C , mL / g） 5:1 1
16、0:1 15:1KOH-乙醇溶液浓度 （D，mol/L） 1.0 2.0 3.03.2.1 响应面法确定不皂化物最佳皂化工艺参数结果分析根据调查区域内的独立变量的函数，不皂化物产量的数学模型是由下面的公式表示：不皂化物质提取率=+1.37-0.010* A-8.775E-003* B-7.092E-003* C+0.023* D-0.015* A * B-0.040* A * C+0.017 * A * D+0.024* B * C-7.100E-003* B * D+5.000E-004* C * D-0.096* A2-0.078* B2-0.055* C2-0.18* D2 (1)决定系
17、数（R 2=0.9969）表明，该模型充分代表所选择的参数之间的真正关系。调整的决定系数（adj-R 2=0.9938）表示式 1 是适合来表示不皂化物的响应面实验。高的 adj-R2 是更好的观察和预测值之间的相关程度的标准。同时，一个非常较低的值的变异系数（C.V.%）的 0.64 的精确度清楚地表明实验值的可靠性。在表 3 的数据表明，不皂化物的线性相关系数和二次项系数（A2，B2 ，C2，D2）是非常非常小的显着的 p 值（P 0.05）。表 3. 不皂化物提取率的回归模型的方差分析结果Source Sum of DF Mean F-value p-valueSquares Squar
18、eunsaponifiable matter (R2=0.9969 ;adj-R2=0.9938; C.V.%= 0.64)Model 0.27 14 0.019 322.98 A B C，即 KOH-乙醇溶液浓度皂化时间皂化温度液料比。最终确定在皂化时间为 1.49h、皂化温度为 69、液料比为 10:1 和 KOH-乙醇溶液浓度为2.06mol/L 时，不皂化物的理论得率最高为 1.37%，从而为不皂化物的分离纯化奠定基础，X同时也为南瓜籽资源的开发利用提供一定的理论依据。参考文献1 赵玉安, 王慧瑜, 曹辉. 南瓜的营养价值和功能特性. 食品研究与开发 , 2004, 2: 95-97.
19、2 江苏新医学院. 中药大辞典( 下)M. 上海: 上海科学技术出版社, 1986.3 魏 冰. 南瓜籽油的开发和利用研究J. 粮油加工, 2008(5): 6062.4 GB/T 5535.119985 JOSE MANUEL CORTS, RAQUEL SNCHEZ, JESS VILLN, AND ANA VZQUEZ，Analysis of Unsaponifiable Compounds of Edible Oils by Automated On-Line Coupling Reversed-Phase Liquid Chromatography-Gas Chromatograph
20、y Using the Through Oven Transfer Adsorption Desorption Interface，J. Agric. Food Chem. 2006, 54, 6963-69686 Rupali Dhara, Dipak K. Bhattacharyya and Mahua Ghosh，Dhara R, Bhattacharyya DK, Ghosh M. Analysis of sterol and other components present in unsaponifiable matters of mahua, sal and mango kerne
21、l oil. J Oleo Sci. 2010; 59(4):169-76. 7 Augusta Caligiani & Francesca Bonzanini &Gerardo Palla & Martina Cirlini & Renato Bruni，Characterization of a Potential Nutraceutical Ingredient: Pomegranate (Punica granatum L.) Seed Oil Unsaponifiable Fraction，Plant Foods Hum Nutr， Volume 65, Number 3 (2010
22、), 277-283.8 TAE MYOUNG JEONG, TOSHIHIRO ITOH, TOSHITAKE TAMURA, and TARO MATSUMOTO, Analysis of Sterol Fractions from Twenty Vegetables Oils,LIPIDS,1974,9（11）,921-9279 E. Ryan & K. Galvin & T. P. OConnor & A. R. Maguire &N. M. OBrien，Phytosterol, Squalene, Tocopherol Content and Fatty Acid Profile of Selected Seeds, Grains, and Legumes，Plant Foods Hum Nutr (2007) 62:859110 徐 莉, 王若兰, 曹晓博. 橄榄油抗氧化成分变化研究 J . 河南工业大学学报(自然科学版) , 2007, 28( 2) : 38.11 H. M. A. Mohamed& I. I. Awatif，The use of sesame oil unsaponifiable matter as a natural antioxidant，Food Chemistry, Vol. 62, No. 3, pp. 269-276, 1998
