1、高 效 液 相 色 谱 直 接 衍 生 化 法 测 定 血 清 游 离 脂 肪 酸 组 成 论 著刁 宏 斌 1 王 顺 2 赵 新 峰 3 郑 晓 辉 3 马 爱 群 2(陕 西 省 华 阴 市 黄 工 集 团 医 院 陕 西 华 阴 714200; 2西 安 交 通 大 学 第 一 附 属 医 院 心 内 科 ,环 境 与 疾 病 相 关 基 因 教 育 部 重 点 实 验 室 ,心 血 管 离 子 通 道 病 研 究 室 陕 西 西 安 710061;3西 安 交 通 大 学 中 草 药 现 代 化 研 究 及 工 程 中 心 陕 西 西 安 710049)【 摘 要 】 目 的 脂 肪
2、 酸 摄 入 和 代 谢 在 高 血 压 的 发 病 和 进 展 中 发 挥 作 用 ,但 血 清 游 离 脂 肪 酸 ( FFA )组 成 测 定 方 法 尚未 统 一 ,本 研 究 探 讨 高 效 液 相 色 谱 直 接 衍 生 化 法 测 定 空 腹 血 清 游 离 脂 肪 酸 组 成 的 可 靠 性 。 方 法 社 区 筛 选 出 原 发 性 高血 压 患 者 103例 ,其 中 肥 胖 患 者 65例 ,非 肥 胖 患 者 38例 ,和 血 压 正 常 个 体 128例 ,其 中 肥 胖 个 体 70例 ,非 肥 胖 者 58例 ,年 龄 35 59岁 ,各 组 饮 食 习 惯 相
3、近 。 采 空 腹 静 脉 血 离 心 取 上 清 分 成 两 个 1. 5 m l,用 75%的 乙 醇 60 下 除 去 血 清 中 与FFA结 合 的 白 蛋 白 ,无 需 常 规 的 分 离 步 骤 ,应 用 2 -硝 基 苯 肼 盐 酸 盐 (2 - NPH HCl)作 为 衍 生 试 剂 ,在 1 - 乙 基 - 3 - (3-二 甲 基 氨 丙 基 碳 化 二 亚 胺 )盐 酸 盐 (1 - EDC HCl)的 催 化 下 ,直 接 衍 生 血 清 中 的 FFA,形 成 不 挥 发 的 能 在 紫 外 - 可 见光 区 产 生 吸 收 的 脂 肪 酸 的 肼 盐 衍 生 化 物
4、 ,再 用 磷 酸 缓 冲 液 酸 化 增 加 各 种 脂 肪 酸 的 分 离 度 ,衍 生 化 的 脂 肪 酸 用 正 己 烷 萃取 法 与 其 它 的 酰 肼 和 干 扰 成 分 分 离 出 来 ,氮 气 吹 干 后 甲 醇 定 容 ,应 用 C18反 向 色 谱 柱 进 样 30 m in内 洗 脱 分 析 测 定 。 结果 共 测 定 血 清 中 主 要 的 9种 脂 肪 酸 ,从 C16: 0到 C22: 6,未 鉴 定 的 峰 少 于 总 量 的 1%。 脂 肪 酸 组 成 以 个 体 脂 肪 酸 浓 度表 示 ,浓 度 单 位 mol/L。 应 用 C17: 0作 内 标 ,各
5、脂 肪 酸 测 定 的 线 性 范 围 为 2. 6 200. 0 mol/L,回 收 率 在 87. 8% 120.5%之 间 ,重 复 性 检 验 变 异 系 数 10% ,相 关 系 数 为 0. 973 0. 999,批 内 RSD范 围 为 2. 78% 12. 90% ,批 间 RSD范 围 为为 0. 95% 15. 4%。 与 血 压 正 常 个 体 比 较 ,原 发 性 高 血 压 患 者 血 清 游 离 多 不 饱 和 脂 肪 酸 ( PUFA )水 平 降 低 ( P = 0.004) ,饱 和 脂 肪 酸 ( SFA)水 平 有 增 高 趋 势 ( P = 0. 06)
6、 , P /S比 值 降 低 ( P = 0. 000)。 结 论 高 效 液 相 色 谱 直 接 衍 生 化 法测 定 空 腹 血 清 FFA组 成 重 复 性 、 准 确 性 良 好 ,可 作 为 血 清 游 离 脂 肪 酸 组 成 常 规 检 测 的 有 用 的 工 具 。【 关 键 词 】 高 效 液 相 色 谱 直 接 衍 生 化 法 游 离 脂 肪 酸 组 成H igh - performance liqu id chroma tograph ic ana lysis of serum free fa tty acid com position s by d irect deriv
7、a tiza tion m ethod. D IAO Hong -bin, WANG Shun, ZHAO X in - feng, et al. The F irst A ffiliated Hospital, School of M edicine of X ian J iaotong U niversity, X ian, Shaanxi, China.【 Abstract】 O bjective Fatty acids intake and metabolism may p lay a role in the pathogenesis of essential hypertension
8、, but the methods ofdeterm ining serum free fatty acid ( FFA) compositions have not been unified. The aim of this study was to investigate the validity of high perform2ance liquid chromatogram in by direct derivatization method. M ethods Subjects aged between 35 and 59 years from communities includi
9、ng 103 es2sential hypertensives and 128 normotensiveswere selected. Fasting blood (12 hours) was collected, separated and dispensed into two 1. 5 - m l ali2quots. Serum FFA was dissolved in ethanol (75% , v/v). W ithout commonly used isolation step s, fatty acids in serum were directly derivatized b
10、ytreatment with 2 - nitrophenylhydrazine hydrochloride in the p resence of 1 - ethyl - 3 - ( 3 - dimethylam inop ropyl) carbodiim ide hydrochloride ( 1- EDC HCl) , which p roduces their non - volatile hydrazine derivatives. The derivatized fatty acids were separated from other acid hydrazidesand int
11、erfering components by a simp le solvent extraction (which were extracted into n - hexane) , and were eluted isocratically on a reversed -phase C18 column within 30 m in. Results A total of 9 serum fatty acids from C16: 0 to C22: 6 were determ ined. U sing margaric acid (C17: 0) asinternal standard,
12、 each fatty acid could be quantitated with linearity over the range of 2. 6 200 mol/L. Analytical recoveries ranged from 87.8% to 120. 51% and coefficients of variation were less than 10%. Compared with normotensives, hypertensives had lower levels of serum polyun2saturated fatty acids ( PUFA s, P =
13、 0. 004) ) , and polyunsaturated / saturated fatty acids ratio ( P /S ratio, P = 0. 000) , which were in good agree2ment with those in other reports. Conclusion The analytical results showed good recovery and rep roducibility using each internal standard. Due toits excellent selectivity and sensitiv
14、ity, the p resent method can serve as a useful tool for routine determ inations of FFA compositions in serum.【 Key words】 H igh performance liquid chromatogram in; Derivatization method; Free fatty acid compositions该 研 究 受 “ 西 安 交 通 大 学 博 士 论 文 基 金 ” 资 助 ,编 号 : DFXJTU2004 - 13肥 胖 尤 其 是 腹 型 肥 胖 的 流 行
15、 使 心 血 管 疾 病 下 降 的趋 势 中 断 ,原 因 之 一 是 肥 胖 者 升 高 的 血 清 游 离 脂 肪 酸 浓度 与 心 血 管 疾 病 的 危 险 因 素 如 高 血 压 、 糖 尿 病 密 切 相关 。 近 来 人 们 发 现 ,肥 胖 者 血 清 游 离 脂 肪 酸 谱 的 改 变 同样 发 挥 重 要 的 作 用 。 故 同 时 定 性 和 定 量 分 析 血 清 各 种脂 肪 酸 具 有 重 要 的 临 床 和 研 究 价 值 。 目 前 大 多 数 测 定脂 肪 酸 的 方 法 是 通 过 测 定 脂 肪 酸 甲 基 酯 的 气 相 色 谱 法 。与 气 相 色
16、谱 法 相 比 ,通 过 柱 前 衍 生 高 效 液 相 色 谱 法( high - performance liquid chromatography, HPLC)具 有 更高 的 精 密 度 、 灵 敏 度 和 选 择 性 。 该 方 法 为 1985年 日 本的 M iwa最 早 提 出 1 ,之 后 不 断 的 被 改 进 2 - 3 。 本 实 验室 在 参 考 前 人 的 经 验 的 基 础 上 ,又 做 了 一 些 改 进 ,并 被证 明 该 方 法 重 现 性 、 可 靠 性 良 好 。1 材 料 与 方 法1. 1 药 品 和 试 剂 2 - 硝 基 苯 肼 盐 酸 盐 (
17、2 - NPH HCl) 色 谱 纯 ,吉 尔 生 化 (上 海 )有 限 公 司 ; 1 - 乙 基 - 3- (3 -二 甲 基 氨 丙 基 碳 化 二 亚 胺 )盐 酸 盐 ( EDC HCl)色 谱 纯 ,吉 尔 生 化 (上 海 )有 限 公 司 ; 9种 脂 肪 酸 标 准品 和 内 标 C17: 0标 准 品 (光 谱 纯 , Sigma公 司 ) ;甲 醇 (色谱 纯 )、 乙 腈 (色 谱 纯 )、 吡 啶 (分 析 纯 )、 磷 酸 (分 析 纯 )、盐 酸 (分 析 纯 )、 纯 净 水 等 。1. 2 仪 器 Agilent 1100系 列 高 效 液 相 色 谱 仪
18、(包 括 2套 单 元 输 液 泵 , VWD紫 外 检 测 器 , DAD二 极 管 阵 列 检 测器 ) , 7725 i手 动 进 样 器 , Agilent六 通 切 换 阀 ,基 因 公 司Maximer超 纯 水 机 , Agilent 4. 02工 作 站 系 统 。1. 3 色 谱 条 件 ZORBA SB C18反 相 色 谱 柱 (5 m,214 Journal of Clinical and Experim ental M edicine Vol. 9, N o. 6 M ar. 2010150 mm 4. 6 mm i. d. ) ;流 速 0. 6 m l/m in
19、(0 15 m in)、1. 0 mL /m in (15 30 m in) ;柱 压 (40 180 mmHg) ;流 动相 A为 超 纯 水 (pH 4. 54) ,流 动 相 B为 乙 腈 (pH 4. 54) ,两 者 比 例 15 85;柱 温 30 ;检 测 波 长 406 nm、 234nm及 312 nm。1. 4 试 剂 配 制 2 - NPH HCl酸 溶 液 (20 mmol/L )用40 mM的 盐 酸 - 乙 醇 (3 1)配 成 ; 2 - NPH HCl水 溶液 (20 mmol/L)溶 于 纯 水 配 成 水 溶 液 ; 1 - EDC HCl工作 液 (125
20、 mmol/L)配 制 :取 3. 25 m l的 吡 啶 加 无 水 乙 醇定 容 至 25 m l,配 成 13%溶 液 ,称 取 1. 2226 g 1 - EDCHCl加 无 水 乙 醇 定 容 至 25 m l,配 成 250 mmol/L浓 度 溶液 ,两 者 混 合 ; 15%的 氢 氧 化 钾 液 用 甲 醇 水 ( 4 1)作溶 剂 。 内 标 和 各 标 准 品 溶 液 均 溶 于 无 水 乙 醇 中 ( 200 M ) ;缓 冲 液 的 配 制 : 0. 033 M磷 酸 缓 冲 液 (pH = 6. 4)- 0. 5 M 盐 酸 溶 液 ( 3. 8 0. 4) ;流
21、动 相 的 配 制 :用 二 元梯 度 泵 ,取 乙 腈 以 及 超 纯 水 ,均 用 稀 盐 酸 ( 0. 1M )调 pH值 至 4. 54,滤 膜 (孔 径 0. 45 m )过 滤 。 流 动 相 比 例 为乙 腈 水 = 85 15。1. 5 内 标 或 混 标 脂 肪 酸 衍 生 化 取 二 十 碳 五 烯 酸( EPA)、 二 十 二 碳 六 烯 酸 (DHA )、 二 十 碳 四 烯 酸 (AA )、软 脂 酸 ( PA )及 硬 脂 酸 ( SA )标 准 品 溶 液 各 50 l混 合 ,加 入 50 l内 标 液 ,加 2 - NPH HCl水 溶 液 100 l和200
22、 l 1 - EDC HCl 工 作 液 , 混 匀 ; 或 取 亚 麻 酸(ALA)、 棕 榈 油 酸 ( PoA )、 亚 油 酸 (LA )及 油 酸 (OA )标准 品 溶 液 各 50 l混 合 ,或 总 体 积 相 同 的 乙 醇 作 空 白 对照 ,按 上 述 过 程 处 理 。 60 水 浴 恒 温 20 m in。 加 入 50 l氢 氧 化 钾 液 , 60 水 浴 恒 温 15 m in。 流 水 冷 却 后 加 入磷 酸 缓 冲 液 2 m l,正 己 烷 1. 5 m l,震 荡 30 s。 3 000转 离心 5 m in,提 取 上 清 液 ,氮 气 吹 干 。
23、加 50 l甲 醇 溶 解 ,4 保 存 准 备 上 样 。1. 6 样 品 收 集 和 脂 肪 酸 的 衍 生 化 社 区 筛 选 出 原 发 性高 血 压 患 者 103例 (男 性 70例 ,女 性 33例 ) ,其 中 肥 胖患 者 65例 ,非 肥 胖 患 者 38例 ,和 血 压 正 常 个 体 128例(男 性 76例 ,女 性 52例 ) ,其 中 肥 胖 个 体 70例 ,非 肥 胖者 58人 ,年 龄 35 59岁 ,各 组 饮 食 习 惯 相 近 。 采 血 前 3d内 禁 食 含 高 脂 肪 食 物 ,晨 起 空 腹 休 息 10 m in坐 位 量 血压 ,之 后 采
24、 静 脉 血 。 静 脉 血 37 水 浴 40 m in,后 3 000转 离 心 10 m in。 取 上 清 ,置 - 45 低 温 冰 箱 保 存 待 用 。血 清 解 冻 ,混 匀 。 取 50 l血 清 ,加 50 l内 标 液 ,再 加100 l的 无 水 乙 醇 ,震 荡 混 匀 ,从 白 蛋 白 中 提 取 游 离 脂肪 酸 。 加 100 l的 2 - NPH HCl酸 溶 液 ,加 200 l 1- EDC HCl工 作 液 ,混 匀 ,放 入 60 水 浴 恒 温 20 m in。加 入 50 l氢 氧 化 钾 , 60 水 浴 恒 温 15 m in。 流 水 冷 却
25、后 加 入 磷 酸 缓 冲 液 2 m l稀 释 ,正 己 烷 1. 5 m l震 荡 30 s萃 取 脂 肪 酸 衍 生 化 物 。 3 000转 离 心 5 m in,提 取 上 清液 ,氮 气 吹 干 。 加 50 l甲 醇 溶 解 , 4 冷 藏 冰 箱 储 存 , 1周 内 上 样 。2 结 果2. 1 脂 肪 酸 标 准 品 的 分 离 将 9种 脂 肪 酸 标 准 品 和 内标 正 十 七 酸 标 准 品 配 成 接 近 血 清 中 相 应 脂 肪 酸 浓 度 的标 准 溶 液 ,衍 生 化 后 在 经 色 谱 分 离 。 在 上 述 色 谱 条 件 下10种 脂 肪 酸 在 2
26、5 m in内 基 本 分 离 ,它 们 各 自 的 保 留 时间 见 表 1。表 1 血 清 中 9种 游 离 脂 肪 酸 的 保 留 时 间 测 定 结 果脂 肪 酸 保 留 时 间 (m in)EPA (C20: 5 n3, n = 9) 7. 567 0. 034ALA (C18: 3 n3, n = 9) 7. 952 0. 010DHA (C22: 6 n3, n = 9) 9. 035 0. 005PoA (C16: 1 n3, n = 9) 9. 486 0. 005AA (C20: 4 n6, n = 9) 9. 900 0. 007LA (C18: 2 n6, n = 9)
27、 10. 511 0. 010PA (C16: 0, n = 9) 13. 625 0. 011OA (C18: 1 n9, n = 9) 14. 692 0. 009SA (C18: 0, n = 9) 22. 059 0. 0212. 2 人 血 清 游 离 脂 肪 酸 的 分 离 和 鉴 定 分 离 9种 脂 肪酸 ,从 C16 0到 C22 6,未 鉴 定 的 峰 少 于 总 量 的 1%。见 图 1。图 1 血 清 中 9种 游 离 脂 肪 酸 的 色 谱 图 (C17: 0为 内 标 )注 : 1, LnA (18: 3 n3) ; 2, PoA (16: 1 n9) ; 3, L
28、A (18: 2 n6) ; 4,PA (16: 0) ; 5, OA (18: 1 n9) ; 6, SA (18: 0) ; 7, EPA (20: 5 n3) ; 8,AA (20: 4 n6) ; 9, DHA (22: 6 n3)2. 3 游 离 脂 肪 酸 的 测 定314临 床 和 实 验 医 学 杂 志 2010年 3月 第 9卷 第 6期2. 3. 1 线 性 范 围 将 9种 脂 肪 酸 标 准 液 稀 释 成 0. 123 mol/L, 0. 245 mol/L, 0. 491 mol/L, 0. 781 mol/L,1. 563 mol/L, 3. 125 mol/L,
29、 6. 25 mol/L, 12. 5 mol/L, 25 mol/L, 50 mol/L, 100 mol/L和 200 mol/L系列 浓 度 ,测 定 相 应 封 面 积 /内 标 面 积 ,上 述 操 作 在 不 同 日内 重 复 6次 ,求 出 6次 的 均 值 ,然 后 以 各 标 准 品 浓 度 对各 标 准 品 峰 面 积 /内 标 面 积 比 值 均 值 做 线 性 回 归 ,线 性范 围 为 2. 6 200 mol/L,相 关 系 数 为 0. 973 0. 999。2. 3. 2 精 密 度 取 一 份 正 常 人 血 清 标 本 ,分 别 作 批内 ( n = 15
30、)和 批 间 ( n = 6 )相 对 标 准 偏 差 ( RSD )测定 ,按 峰 面 积 / 内 标 面 积 计 算 ,批 内 RSD 范 围 为 2.78 % 12. 90 % ,批 间 RSD范 围 为 0. 95 % 15. 4 %。2. 3. 3 回 收 率 取 高 、 中 和 低 浓 度 的 三 个 样 本 ,每 一 样本 中 分 别 加 入 所 测 脂 肪 酸 标 准 液 (稀 释 10倍 ) 50 l、100 l,使 其 含 量 分 别 为 1 nmol、 2 nmol,测 得 的 平 均 加标 回 收 率 为 87. 8% 120. 5%。2. 3. 4 样 品 测 定 高
31、 血 压 患 者 和 正 常 血 压 对 照 组 的 空腹 血 清 FFA总 浓 度 和 其 个 体 脂 肪 酸 组 成 见 表 。 与 血 压正 常 个 体 比 较 ,原 发 性 高 血 压 患 者 血 清 游 离 多 不 饱 和 脂肪 酸 ( PUFA ) 水 平 降 低 ( P = 0. 004 ) , 饱 和 脂 肪 酸( SFA )水 平 有 增 高 趋 势 ( P = 0. 06) , P /S比 值 降 低 ( P= 0. 000)。3 讨 论高 效 液 相 色 谱 直 接 衍 生 化 法 测 定 空 腹 血 清 FFA组成 重 复 性 、 准 确 性 良 好 ,可 作 为 血
32、清 游 离 脂 肪 酸 组 成 常规 检 测 的 有 用 的 工 具 。 尽 管 高 效 液 相 色 谱 具 有 高 的 灵敏 度 ,但 进 样 量 不 要 少 于 20 l,以 避 免 准 确 性 和 精 密 度下 降 。 摸 索 色 谱 条 件 时 ,应 选 择 全 波 长 (190 600 nm )扫 描 ,这 样 可 以 筛 选 出 吸 光 度 和 分 离 度 俱 佳 的 吸 收 波 长作 面 积 计 算 。 应 用 光 谱 - 二 极 管 阵 列 做 出 各 脂 肪 酸 标准 品 的 吸 收 光 谱 ,可 鉴 定 样 品 中 峰 的 性 质 和 纯 度 ,避 免计 算 错 误 。 实
33、 验 中 在 血 清 微 量 脂 肪 酸 EPA、 DHA 及 AA的 分 离 度 上 还 有 待 进 一 步 改 善 ,从 而 提 高 这 三 种 脂 肪 酸的 精 密 度 和 准 确 度 。参 考 文 献 1 M iwa H, Yamamoto M, N ishida T, et al. H igh - performance liquidchromatographic analysis of serum long - chain fatty acids by direct deri2vatization method J . J Chromatogr, 1987, 416 (2) : 2
34、37 - 245. 2 乔 知 , 童 光 焕 . 高 效 液 相 色 谱 法 分 析 人 血 清 游 离 脂 肪 酸 谱 J . 中华 医 学 检 验 杂 志 , 1994, 17 (2) : 87 - 90. 3 M iwa H. H igh - performance liquid chromatography determ ination offree fatty acids and esterified fatty acids in biological materials as their 2- nitropherylhydrazides J . Analytica Chim ic
35、a Acta, 2002, 465: 237- 255.(收 稿 日 期 : 2009 - 12 - 23) (上 接 第 411页 )有 效 率 为 97. 4% ,与 多 潘 立 酮 治 疗 比 较 有 显 著 差 异 ,提示 依 托 必 利 促 进 胃 排 空 的 作 用 可 能 强 于 多 潘 立 酮 ,且 具有 良 好 的 耐 受 性 ,尚 未 有 严 重 不 良 反 应 报 道 。本 文 显 示 ,尽 管 FD引 起 腹 胀 的 原 因 复 杂 ,治 疗 方 式及 效 果 不 同 ,但 复 方 阿 嗪 米 特 肠 溶 片 联 合 强 效 的 新 型 促动 力 药 盐 酸 依 托 必
36、 利 片 治 疗 FD腹 胀 能 迅 速 缓 解 症 状 ,且 两 药 之 间 具 有 一 定 的 协 同 作 用 ,明 显 好 于 单 用 盐 酸 依托 必 利 片 治 疗 FD腹 胀 的 疗 效 。 较 邹 多 武 等 7 及 上 海市 泌 特 临 床 协 作 组 8 的 研 究 效 果 更 好 ,这 也 说 明 二 者 联合 治 疗 的 协 同 作 用 可 提 高 疗 效 ,是 治 疗 FD腹 胀 的 一 种可 行 的 有 效 方 法 。 但 由 于 本 研 究 中 未 采 用 严 格 双 盲 对照 ,不 能 完 全 客 观 地 反 映 两 药 联 用 治 疗 FD的 疗 效 ,尚 需多
37、 中 心 、 大 样 本 的 研 究 进 一 步 验 证 。参 考 文 献 1 Galm iche JP, Clouse RE, Balint A, et al. Functional esophageal disor2ders J . Gastroenterology, 2006, 130 (5) : 1459. 2 胡 品 津 , 刘 新 光 . 消 化 内 科 学 M . 北 京 :人 民 卫 生 出 版 社 , 2008:104. 3 Talley NJ. D rug treatment of functional dyspep sia J . Scand J Gastro2enter
38、ol, 1991, 182 ( Supp l) : 47 - 60. 4 Talley NJ. Dyspep sia management in the m illennium: the death of testand treat J . Gastroenterology, 2002, 122 (5) : 1521 - 1527. 5 谭 德 虎 , 刘 劲 松 . 功 能 性 消 化 不 良 的 药 物 治 疗 研 究 现 状 J . 临 床消 化 病 杂 志 , 2005, 17 (4) : 197 - 198. 6 许 大 波 , 柯 美 云 . 新 型 促 胃 肠 动 力 药 物 依
39、 托 必 利 J . 中 国 新 药 杂志 , 2002, 11 (6) : 437 - 439. 7 邹 多 武 , 许 国 铭 , 苏 暾 , 等 . 复 方 阿 嗪 米 特 治 疗 功 能 性 消 化 不 良 、慢 性 胆 囊 炎 、 胆 结 石 、 肝 硬 化 腹 胀 的 疗 效 观 察 J . 中 华 消 化 杂 志 ,2005, 25 (7) : 421 - 424. 8 上 海 市 泌 特 临 床 协 作 组 . 复 方 阿 嗪 米 特 肠 溶 片 治 疗 消 化 不 良 的 多中 心 、 随 机 、 双 盲 、 安 慰 剂 平 行 对 照 临 床 研 究 J . 胃 肠 病 学 , 2005,10 (2) : 83 - 87. 9 莫 剑 忠 , 李 定 国 , 姜 睛 寰 , 等 . 盐 酸 依 托 必 利 治 疗 功 能 性 消 化 不 良的 多 中 心 临 床 研 究 J . 中 国 新 药 杂 志 , 2003, 12 (6) : 467 - 469.(收 稿 日 期 : 2009 - 11 - 27) 414 Journal of Clinical and Experim ental M edicine Vol. 9, N o. 6 M ar. 2010
