1、第 14 卷第 1 期2002 年 3 月 北 方 工 业 大 学 学 报J. NOR TH CH INA UN IV. O F T ECH. V o l. 14 N o. 1M ar. 2002高效液相色谱柱的稀匀浆填充方法赵继红 1) 梁 宇 2) 梁泽斌 1, 2)(1) 北方工业大学基础科学学院 , 100041, 北京石景山2) 中国科学院研究生院 , 100039, 北京 )摘 要 介绍一种改进的高效液相色谱柱的装填方法稀匀浆装填方法 . 该方法使用无毒、低粘度的稀匀浆溶液和较长的合适结构的匀浆罐 . 在高于 70 M Pa 的压力和 50m l m in 匀浆输送流量下 , 装填
2、 5Lm OD S 填料的反相色谱柱和 SiO 2 硅胶的正相色谱柱都获得良好的结果 .柱效可达到 60 000 m 以上 ; 峰对称性好 , S I= 1 1. 25; 寿命长 , 经过 500 次进样柱效和峰对称性无明显变化 .关键词 稀匀浆 ; 液相色谱柱 ; 装填方法分类号 O 657. 8液相色谱法的成功得益于高效液相色谱柱制备技术的进步 . 现已经有多种 H PL C 柱的填充方法 : 平衡密度法、平衡粘度法、动态搅拌法和匀浆法等 1, 2 . 从溶液中悬浮颗粒的沉降理论知道 , 为了实现固定相的均匀填充 , 在填充色谱柱的过程中必须防止颗粒的分级沉降 . 防止颗粒分级沉降的方法有
3、 : 调整合适的溶剂密度 , 增加溶剂的粘度 , 均匀被固定相的颗粒度 . 使溶液中的颗粒密度接近于溶剂密度 , 颗粒物的沉降速度趋向于零 . 这便是平衡密度法装填法的依据 , 它可以避免由于颗粒度分布较大而引起在填充过程中的颗粒分级沉降 . 因此 , 用平衡密度法填充颗粒度分布较大的色谱柱也能得到较好的效果 . 但是 , 平衡密度法需要采用具有较大密度的卤代烃 , 卤代烃的吸附将导致色谱峰的不对称性增加 . 而且卤代烃的毒性较大 , 对操作者的健康极为不利 . 随着工艺技术的进步 , 固定相颗粒的均匀性已经得到保证 . 高密度匀浆法采用四氯化碳、三氯甲烷或采用与一定比例的二氧六环混合作为溶剂
4、 , 装填效果与遗留问题与平衡密度法类似 . 从实践结果看 , 用平衡粘度法装填色谱柱不容易得到高柱效 , 而且色谱峰的对称性也差 . 3 本文提出一种改进的高效液相色谱柱填充方法稀匀浆填充方法 . 其根据是 , 颗粒沉降速度与其半径的平方成正比 , 被填充的固定相颗粒度减小时 , 颗粒沉降的速度明显变慢 . 若固定相的颗粒度比较均匀 , 采用低密度溶剂制备匀浆 , 当匀浆中的颗粒还没有明显分级沉降之前 ,用高压将固定相匀浆高速压入色谱柱中 , 迅速形成色谱柱床层 . 这样可以保证固定相填料在柱中的均匀性 , 从而得到高柱效 . 这样的装填方法要求有足够高装填压力以及装柱流量 , 并且有严格的
5、装柱程序 .1 实验部分主要仪器设备 : VA R IAN L C - 5000 型高效液相色谱仪 , 配备 UV - 254nm 检测器 , 池体积 8Ll. 自制装柱系统及匀浆罐 , 色谱柱管 5 4. 6收稿日期 : 2001 11 27第一作者简介 : 赵继红 , 讲师 . 研究方向 : 天然物质化学 . 1995-2004 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved. 150, 所用的溶剂及药品均为分析纯 , 北京化工厂生产 . 色谱固定相为天津试剂二厂生产 . 所有溶剂在使用前均由本实验室做进一步的提纯处
6、理 . 纯水由市售化学分析用纯水经在酸性条件下加高锰酸钾进行双重蒸镏后制得 . 装柱流程如图 1 所示 .1. 1 反相色谱柱的装填与色谱柱评价将清洗干燥的空色谱柱管卸下入口接头 ,接到与匀浆罐出口相连的预柱上 , 用无水乙醇作为匀浆顶替液 . 称取 2. 5g 固定相 YW G -C18- 5Lm , 与含丙酮 反向匀浆剂体积比 = 95 5 的匀浆溶剂 55 m l, 一同加入到三角烧瓶中 ,使固定相颗粒完全湿润 . 将三角烧瓶置于超声波发生器内作用 10m in, 立即倒入匀浆罐中 , 加盖密封后立即打开气动高压液体泵的进气阀门 , 启动高压泵 , 匀浆压力立即升高到 70M Pa,匀浆
7、液以 30 m l m in 进入色谱柱管 . 这样 , 保证色谱柱床层在 50s 内完全形成 . 流出的匀浆液超过 100 m l 后 , 关闭进气阀 , 使匀浆罐自然降到常压 . 静止 10m in, 卸下柱子 , 安装好色谱柱柱接头 , 待测色谱柱性能 .色谱柱评价使用的流动相为 M eOH H 2O= 80 20 (V V ) , 流速 1m l m in. 标准样品为150 ppm 联苯 , 0. 1% 苦味酸的甲醇溶液 , 1LlR heddyne 定量阀进样 . 评价色谱柱寿命的样品为苯、萘、联苯 , 进样 500 次 .1. 2 正相色谱柱的装填与色谱柱评价将清洗干燥的空色谱柱
8、管卸下入口接头 ,接到与匀浆罐出口相连的预柱上 , 用经本实验室纯化处理的正己烷作为匀浆顶替液 . 称取2. 2g 固定相 YW G - 80 (SiO 2 ) - 5Lm 置于100m l 磨口三角瓶中 , 放入干燥器内在 100下干燥 12h. 与含有己烷 正向匀浆剂体积比 =72 28 的匀浆溶剂 55 m l, 一同加入到三角烧瓶中 , 使固定相颗粒完全湿润 . 将三角烧瓶置于超声波发生器内作用 10m in, 立即倒入匀浆罐中 ,加盖密封后立即打开气动高压液体泵的进气阀门 , 启动高压泵 , 匀浆压力立即升高到 70M Pa,匀浆液以 30 m l m in 进入色谱柱管 , 当流出
9、的匀浆液超过 100 m l 后 , 关闭进气阀 , 使匀浆罐自然降到常压 . 静止 10m in, 卸下柱子 , 安装好色谱柱柱接头 , 待测色谱柱性能 .色谱柱评价使用的流动相为正己烷 , 流速1m l m in. 标准样品为 150 ppm 联苯 , 0. 1% 四氯乙烯的己烷溶液 , 1Ll R heddyne 定量阀进样 . 评价色谱柱寿命的样品为苯、萘、联苯、菲 ,进样 500 次 .2 结果与讨论色谱柱的评价以柱效 (理论塔板数 N 和塔板高度 H )、不对称因子 (S I )、渗透系数 (K F )表示 . 渗透系数以达西 (D arcy)公式计算 .2. 1 反相色谱柱在 C
10、18 柱上 , 样品中的苦味酸可以认为是非滞留组分 , 用来测定柱的死时间 t0. 柱效与不对称因子 (S I ) 以联苯色谱峰进行计算 , 结果列于表 1. 评价指标为前后的理论塔板数和不对称因子的变化 .表 1 反相色谱柱的测定结果序号 流动相流量V (m l m in) N(1 m ) H(Lm ) L(mm m in) S I K F1 0. 20 62 200 16. 08 0. 384 1. 12 0. 30 63 300 15. 80 0. 577 1. 1 2. 53 0. 50 63 800 15. 68 0. 962 1. 1 2. 24 0. 70 64 900 15.
11、42 1. 35 1. 1 2. 15 1. 00 64 500 15. 50 1. 92 1. 1 2. 16 1. 40 62 700 15. 96 2. 69 1. 15 2. 17 2. 00 59 000 16. 96 3. 85 1. 15 2. 18 3. 00 53 100 18. 85 5. 77 1. 2 2. 19 4. 00 47 500 21. 07 7. 69 1. 2 2. 010 5. 00 42 700 23. 43 9. 62 1. 22. 2 正相色谱柱在硅胶柱上 , 四氯乙烯可以认为是非滞留组分 , 其保留值用来确定色谱柱的死时间 t0. 柱效与不对称因
12、子根据联苯色谱峰进行确定 . 结果列于表 2. 评价指标为前后的理论塔板数和23 北 方 工 业 大 学 学 报 第 14 卷 1995-2004 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved.不对称因子的变化 .表 2 正相色谱柱的测定结果序号 流动相流量V (m l m in) N(1 m ) H(Lm ) L(mm m in) S I K F1 0. 20 63 500 15. 75 0. 187 1. 0 2. 52 0. 41 67 400 14. 84 0. 384 1. 0 2. 33 0. 61 69
13、300 14. 43 0. 571 1. 1 2. 14 0. 81 70 500 14. 18 0. 758 1. 1 2. 15 1. 0 70 200 14. 24 0. 935 1. 1 2. 16 1. 2 68 300 14. 65 1. 123 1. 1 2. 17 1. 6 61 600 16. 23 1. 590 1. 1 2. 18 2. 0 55 900 17. 88 1. 871 1. 15 2. 19 3. 1 43 900 22. 79 2. 90 1. 2 2. 110 4. 1 35 100 28. 48 3. 84 1. 25 2. 02. 3 讨论按照悬浮颗
14、粒在液相中的沉降公式 , 可以得到在低粘度稀匀浆中 , 不同直径颗粒的沉降时间与颗粒直径的关系 , 此关系与实验测定结果符合 , 如图 4 所示 . 由此可以确定 , 为了使色谱柱床层在固定相填料颗粒没有明显分级沉降之前形成 , 以保证固定相在床层内的均匀性 ,10Lm 的填料应在 25s 内完成装填过程 , 而 5Lm填料允许在 100s 内完成装填操作 . 这说明稀匀浆装填方法更适合于小颗粒度的填料装填 . 而且 , 装柱泵必须能提供足够高的装柱压力和流量 , 将稀匀浆迅速压入色谱柱管中 , 快速形成完整的柱床层 . 本工作要求在 50s 内完成对 5Lm颗粒填料的装柱过程 , 就此完全可
15、以保证装填过程中填料没有分级沉降 . 另外 , 假如在装填过程中稀匀浆产生湍流流动 , 会使匀浆中的均匀的颗粒分布变得紊乱 , 不能保证床层的均匀 , 从而导致柱效降低 . 本工作采用适当结构的匀浆罐避免了产生激烈的湍流 .液相色谱固定相填料是硅胶或高分子胶类绝缘物质 , 小颗粒填料具有极大的比表面积和表面能 , 在溶液中的溶液聚集 , 使匀浆变得不均匀 , 极大地影响了填充床层的均匀性和质密性 .因此 , 在制备匀浆时 , 必须使匀浆在装柱前固定相颗粒稳定地完全均匀分散 . 为此 , 文献报道了采用加入一定量的电解质 , 例如 : 氨水、乙酸钠、有机酸等 , 或者加入某些分散剂 , 如 :
16、二氧六环等 4, 5 , 降低填料颗粒的表面能 , 增加抗聚集的能力 . 本研究一方面采用稀匀浆加大分散填料颗粒之间的距离 , 减少颗粒的聚集可能 , 另一方面 , 在配制稀匀浆时加入一定比例的匀浆剂 , 进一步防止匀浆中填料颗粒的聚集 . 实验结果获得高柱效的正相和反相柱说明 , 所采取的方法是成功的 .3 结论高效液相色谱柱的稀匀浆装填方法 , 具有可以使用低粘度、无毒廉价的试剂等优点 . 在装填时 , 在固定相颗粒机械强度允许的条件下尽量采用高填充压力 , 与细长匀浆罐配合 , 并尽量减小顶替液的压力波动 . 当装填 5Lm 固定相时 , 柱床层形成的时间应小于 1m in.用稀匀浆填充
17、国产 5Lm OD S 反相色谱柱33第 1 期 赵继红 梁 宇 梁泽斌 : 高效液相色谱柱的稀匀浆填充方法 1995-2004 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved.和 SiO 2 类正相色谱柱均能获得良好的柱效 , 色谱峰具有良好的对称性 , 柱效最高可达 65000 m , 在通用流动相流速的范围内 , 对称因子为 1.0 1. 25. 色谱柱性能稳定 , 经过 500 次连续进样后柱效和峰对称性没有明显变化 .参 考 文 献1 M ajo rs R E. J. C. Ch rom atogr. Sci.
18、 , 1980, (18):4872 T redric M R. C. Ch rom atogr. Sci. , 1980, (18):3943 B rendsen G E, R egouw R , D e Galan L. A nal.Chem. , 51, 1091, 19794 M erein M , Guiochen G. Ch rom atograph ia, 1987,(10): 1945 L ieo JC, Pozo JL. C. Ch rom atogr. Sci. , 1982(20): 14D iluted Hom ogena te Slurry-pack ing M et
19、hodfor Column s of H igh Performance L iquid Chroma tographyZhao J ihong1) L iang Yu2) L iang Zeb in1, 2)(1) Co llege of Fund. Sci. ,N o rth Ch ina U niv. of T ech. 100041, Beijing, Ch ina)2) Graduate Schoo l A cadem ia Sinica, 100039 , Beijing, Ch ina)Abstract T he im p roved pack ing m ethod of co
20、 lum n s of h igh perfo rm ance liqu id ch rom atograp 2hy, o r the dilu ted hom ogenate slu rry2pack ing m ethod is in troduced. A non2tox ic slu rry so lven t w ithlow 2visco sity, and a longer2shape slu rry reservo ir are u sed. T he excellen t perfo rm ance H PL Cco lum n s packed w ith 5Lm OD S
21、 bonded stationary phases in reverse phase o r SiO 2 silica gelstationary phases in righ t phase are ob tained. T he co lum n s perfo rm ance is good, w ith a h igh N 60000 m , the symm etry of ch rom atograph ic peak s is excellen t S I= 1 1. 25; the life is longer, afteranalysis of 500 sam p les,
22、the co lum n s perfo rm ance and the symm etry of peak s are steady. T h ispack ing m ethod is fu lly rep roducib le and efficien t to get h igh perfo rm ance H PL C co lum n s.Key W ords dilu ted hom ogenate slu rry; H PL C co lum n; pack ing m ethod43 北 方 工 业 大 学 学 报 第 14 卷 1995-2004 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved.
