1、动 物 遗 传 学 实 验 指 导动物遗传育种教研组2006 年 5 月实 验 室 守 则一、必须以严肃认真的科学态度从事各项实验，不得高声喧哗，更不得嘻笑打闹。二、必须严格执行操作程序和按规定的步骤进行各项实验，不得随意取舍、变动。三、必须按正规要求锻炼基本功，不断培养和提高实验室的动手能力，不得以任何借口拒绝教师的正确指导。四、必须爱护仪器， 节约原材料，保持 试剂的纯净度，遇到损坏情况发生，要报告指导教师，如损坏仪器设备，除口头报告外，还应根据情况折价赔偿。五、课前必须认真预习有关实习内容，课后要认真分析实验结果，按时交出实验报告。六、进入实验室后，各组学生按规定位置入座，清点好每次所分
2、 配的仪器、用品、试剂，用完后须洗净( 不能洗涤者例外 )如数归还原处，如有短缺情况，应由该组 同学共同负责。2006 年 5 月动物遗传学实验课考核制度一、总则：实验课考核成绩占该门课程总成绩的 30，若实验课考核成绩达不到 60 分，则不能参加该门课程的期终考试。二、考核内容及成绩计分方法：1.平时作业、测验、 课堂表现考核(40 分)平时 作业：实验报告应独立、按时完成，缺交一次扣 10 分，抄袭他人作业者及被抄者一律记 0 分。平时测验：实验操作或回答提问抽查不符要求，每次扣 10 分。考勤： 迟到或早退每次扣 5 分，旷课一次扣 10 分并交学工组老师处理。课堂 纪律：参照实验室守则
3、，违反纪律每次扣 10 分并交学工组老师处理。卫生： 课堂乱涂画者，每次扣 10 分并清除之；课后卫生不符要求擅自离去者，每人每次扣 10 分。2.期终考核(60 分) ：采取抽签、口试形式，考核内容包括：实验 内容有关问题。实验 操作。动物遗传育种教研室2006 年 5 月 目 录实验一 果蝇的饲养和观察(1)实验二 单因子试验(3：1 分离试验 )(4)实验三 两对因子的自由组合(6)实验四 伴性遗传(6)实验五 三点测交(基因定位 )(7)实验六 粗糙链孢霉的分离与培养(9)实验七 果蝇唾腺染色体的观察和制片(11)实验八 骨髓细胞染色体涂片法(13)实验九 外周血淋巴细胞培养和染色体标
4、本制备(15)实验十 染色体显带标本的制备与识别(17)实验十一 人群中 P、T、C 味盲基因频率的分析 (18)实验十二 遗传力和重复率的估算(20)实验十三 遗传相关的估算(23)实验十四 动物组织中总 DNA 的提取与纯度鉴定（26）实验十五 PCR 扩增（27）1图 1 果蝇的生活史实验一 果蝇的饲养和观察一、实验目的了解实验材料果蝇，学会果蝇的饲料制备、果蝇的性别和突变性状鉴别，为以后实验打下基础。二、经典的遗传实验材料果蝇果蝇(fruit fly)，属于节肢动物门有气管亚门昆虫纲双翅目果蝇属，果蝇属共有 900 多个品种，通常用作遗传实验材料的是黑腹果蝇(Drosophila me
5、lanogaster)。(一)生活史：1. 果蝇的生活周期。卵幼虫蛹成虫卵2. 生活周期长短与温度的关系（见表 1-1）：一般温度在30以上能使果蝇不育或死亡，低温能使果蝇生活周期延长，生活力下降，饲养果蝇的最适温度 2025。表 1-1 生活周期长短与饲养温度的关系温度 10 15 20 25卵幼虫 8 天 5 天幼虫成虫 57 天 18 天 6 天 4 天3. 果蝇的繁育只要温度适宜又有充足的食物，果蝇就能进行正常繁育，果蝇以酵母菌为食，因此实验室内凡能发酵的基质，均可作为果蝇饲料。常用的有玉米饲料、香蕉饲料、米粉饲料三种(见表 l2)，果蝇一般在恒温箱内培养，野生型果蝇生活力很强，突变型
6、生活力较弱，在培养中要防止霉菌污染，须精心管理才行。表 1-2 三种果蝇饲料的配方配料 水（ml） 琼脂（g） 蔗糖（g） 香蕉浆 （g） 玉米粉 （g） 米粉（g） 麸皮（g） 酵母粉 （g） 丙酸（g）玉米饲料 150 1.5 13 - 17 - - 1.4 1米粉饲料 100 2 10 - - 8 8 1.4 12香蕉饲料 50 1.6 - 50 - - - 1.4 0.5-14. 果蝇性别及突变性状果蝇的每一个体细胞染色体只有 4 对，三对为常染色体，一对为性染色体(XY ，XX) 。在幼虫期雌雄不易区别，在成虫期区别相当容易。雄果蝇个体一般较雌体为小。腹部环纹五条，腹尖颜色深( 从背
7、面看第三条环纹后呈黑色 )，在第一对脚的跗节前端表面有黑色鬃毛流梳，称为性梳(Sex combs)；雌蝇个体较大，腹部环纹七条，前肢跗节无性梳。实验中选用的果蝇突变性状大多数肉眼可见，或用放大镜可见，如红眼、白眼；长翅、痕迹翅；灰体、黑檀体等。另有些性状则要在解剖镜下鉴定，如焦刚毛与直刚毛等。突变性状的基因符号及所在染色体上位座见表 l3。凡与野生型果蝇一致的性状都标以基因符号(+)。从上叙各点可见，果蝇具有：饲养容易，世代间隔短，染色体数少，唾腺染色体制作容易，雌雄好鉴别，突变性状多，而且多数是形态突变，便于观察等特点，是理想的遗传实验材料。表 1-3 实验中使用的果蝇突变品系影 响 部 位
8、 突 变 性 状 基 因 符 号 染 色 体 上 位 座翅 痕 迹 翅 Vg II R 67.0眼 色 白 眼 W X 1.5刚 毛 焦 刚 毛 Sn3 X 21.0翅 形 小 翅 m X36.1体 色 黑 檀 体 e III R 70.7三、实验用具和药品、用料恒温箱、解剖镜、培养瓶、棉花、纱布、剪刀、麻醉瓶、干燥箱、灭菌锅、白瓷板、铝锅、电炉、玻璃棒、200 毫升量筒、1000 毫升和 250 毫升烧杯、酒精灯、镊子、角匙、毛笔、滤纸。丙酸(或乳酸) 、乙醚、煤油、75酒精、琼脂、蔗糖、米粉、麸皮、酵母粉 (片)四、操作步骤(一)米粉饲料制备( 每组制取一份 200 毫升水样的米粉饲料)取
9、 100 毫升水加入剪碎的琼脂加热溶解加入用另 100 毫升水调成的米粉、麸皮、蔗糖糊、调匀加热煮至熟透加入酵母粉、丙酸充分调匀分装培养瓶，盖上棉塞冷却后用酒精棉擦干瓶内积水，插入滤纸片盖上棉塞即可。附：制备前培养瓶、滤纸(用酒精浸湿 )、100 毫升烧杯干燥灭菌、棉花、纱布高压蒸汽消毒。培养瓶棉塞在饲料制成前做完。(二)性别和突变性状的鉴别3在实验前用酒精棉将镊子、白瓷板擦净，毛笔尖用手指(酒精棉擦过) 揉软，切记要保持毛笔和麻醉瓶干燥。将原种瓶振动使果蝇震落瓶底，去棉塞套上麻醉瓶 将果蝇转入麻醉瓶，盖或 震 落利 用 果 蝇 趋 光 性上棉塞在麻醉瓶棉塞里端滴上 2-3 滴乙醚将麻醉了的果
10、蝇倒入白瓷板( 或表玻璃)在放大镜下或解剖镜下观察其眼睛颜色、翅形、体色、刚毛、腹部环纹及雄蝇的性梳，鉴别雌雄及各种突变性状分别装入培养瓶贴上标签。五、实验要求(一)果蝇饲料干湿适宜不起块、煮熟透、不受污染，分装培养瓶后一周内不起霉不长杂菌。(二)熟练地鉴别雌雄和各突变品系，接种时不混种，保持存活。实验二 单因子试验(3:1 分离试验)一、实验目的通过果蝇单因子杂交试验验证分离规律。二、实验材料及说明果蝇 灰体(+ +)黑檀体(ee)或长翅(+ +)痕迹翅(VgVg)三、实验仪器和用品解剖镜、放大镜、米粉培养基用料、培养瓶、麻醉瓶、乙醚、恒温箱、白瓷板(或表玻璃） 、毛笔、酒精棉、棉花塞、电炉
11、、铝锅、250 毫升烧杯、100 毫升烧杯、标签、浆糊、死蝇收集瓶(装煤油)、镊子、200 毫升量筒。四、实验步骤(一)确定杂交组合( 用正反交比较)(二)选取处女蝇和雄蝇为保证产生的后代均为杂交个体，雌绳必须是处女蝇，可将原种瓶中的果蝇全部倒人死蝇收集瓶内( 一个也不留)，在此后 8 个小时内由蛹羽化的雌绳即是处女蝇。选用处女蝇和雄蝇各 34 对。4(三)杂交(正反交) 用某品种的处女蝇与另一个杂交亲本的雄绳杂交(放入同一个培养瓶) 用该品种的雄蝇与另一杂交亲本的处女蝇作反交(放入另一个培养瓶中 )，贴上标签，每瓶须保证有 56 对以上。在恒温箱培养。注意：麻醉后的果蝇用毛笔扫人培养瓶时，瓶
12、壁要干燥，培养瓶要横放，待果蝇醒后方可竖起，以免果蝇沾在培养基或湿的瓶壁上造成死亡。麻醉时宜轻度，过重果蝇双翅与身体外展 450 角表示已死亡。 (四)观察果蝇从产卵孵化幼虫蛹的变化，待见第一个蛹出现时 (7、8 天后)将亲本全部倒出处死。(五)待 F1 代成虫果蝇出来后(13 天后) 进行观察并作好记录(接种后 20 天内为安全期) 。(六)选取 F1 代果蛹 56 对移人另一新配培养基的培养瓶中进行自交。(七)待有蛹出现即倒出 F1 代果蝇。(八)对 F2 代果蝇进行观察和统计(F 1 代接种后 20 天内为安全期 )，凡已观察记录过的果蝇立即处死。 (九)整理记录资料作适合性检验并作出统
13、计推断。(十)做好实验小结。五、作业写好实验报告附：观察记录表（正反交分别记录）试验编号 开始日期 P 表型（基因型）表型（基因型）F1 表型（基因型）F2 表型（基因型）：表型（基因型）理论比例 ：F1 记录表果 蝇 数 目表型统 计日 期5F2 记录表果蝇数目总 计百分数实验三 两对因子的自由组合一、试验目的通过果蝇的两因子杂交试验，验证自由组合规律。二、实验材料及说明果蝇 灰体长翅( + + + + ) 黑檀体痕迹翅(eeVgVg)或黑檀体长翅(ee + +)灰体痕迹翅(+ + Vg Vg)三、实验仪器和用品与单因子试验同。四、实验步骤与单因子试验同。总 计百分数表型统 计日 期6五、作
14、业写好实验报告。附：观察记录表与单因子的类同。 实验四 伴 性 遗 传一、实验目的了解果蝇伴性遗传的规律，比较正反交在 F1 及 F2 代之间的差异。二、实验材料及说明果蝇 雌红眼(x +x+ )雄白眼(x w y) 雄白眼(x wxw） 雌红眼(x + y)三、实验仪器和用品与单因子试验同。四、实验步骤 附：观察记录与单因子的类同。实验五 三点测交(基因定位)7一、实验目的通过观察和分析在同一对染色体上由 2 对和 3 对基因所分别控制的相应性状的重组表现来验证连锁及交换规律，并利用此规律进行基因定位及计算并发率和干涉。二、实验材料果蝇 选取焦刚毛(Sn 3)白眼(W) 小翅(m) 的果蝇的
15、贞蝇( )，野生型的雄蝇(+ + + )。三、原理焦刚毛、白眼、小翅是 X 染色体上三个隐性突变基因分别控制的性状，对应的野生型相对性状为直刚毛、红眼、长翅。利用三隐性纯种贞蝇与野生型雄蝇杂交，F 1 代必会雄为三隐性个体，雌为杂合子，再自交，由于存在着交换，F 2 代必会产生一些重组类型，可能有 6 种，如右图所示，经统计分析，即可达到实验目的。P： F1 F2 三点测交图示四、实验器材和用品与单因子试验同。 五、实验步骤与单因子试验同。六、作业写好实验报告，画出基因的排列顺序和相对距离简图并计算并发率和干涉。附：观察记录表WSn3mWSn3m + + + WSn3m+ + + WSn3m
16、+ + + WSn3m W + + +Sn3m 8 种表型+ + m WSn3 + Sn3 + W+m）WSn3mWSn3m8F2 表型统计表观察日期及数目 合计表型月 日 月 日 月 日+ + +W Sn3 mW + + Sn3 m+ + mW Sn3 + Sn3 +W + m 三点测交重组值计算表基因间重组表型 实际值 比例W-Sn3 Sn3-m W-m+ + +W Sn3 mW + + Sn3 m+ + mW Sn3 + Sn3 +W + m实验六 粗糙链孢霉的分离与交换一、实验目的通过对链孢霉杂交所产生的子囊孢子的观察，可以直接地了解基因分离和交换规律，进而计算出基因与着丝粒间的距离，
17、作为遗传图距。二、实验原理遗传实验常用的粗糙链孢霉(Neurospora a crassa)属于真菌门子囊纲的脉孢菌，也常被称为红色面包霉。营养体是单倍体(n=7) ，由多核菌丝构成，生殖方式有无性和有性两种。孢子或菌丝片段9在培养基上可萌发生长菌丝，发育成菌丝体，这是无性生殖。由两种不同接合型结合产生有性孢子的过程称为有性生殖，有性生殖有两种方式：在一个未受精的营养体菌丝上产生灰白色的原子囊果。若另一接合型的分生孢子落在这原子囊果的受精丝上，就形成合子。不同接合型菌丝中的核融合成合子，产生子囊果。二倍体的合子经过一次成熟分裂，产生四个单倍体核 (n)，每个核又进行一次有性有丝分裂，形成 8
18、个子囊孢子，并以一定的顺序排列，在子囊中，许多子囊又被包在黑色的子囊果中。若两个亲代菌丝有某一遗传性状的差异，那么经杂交所形成的每一子囊，必有四个子囊孢子属于一种类型，另外四个子囊孢子属于另一种类型。成熟的子囊孢子在适合的条件下可发育成菌丝，形成新一代。子囊孢子性状的分离比严格按 1：1 而且有一定的顺序。因此可以直接观察到分离和交换现象。 三、实验材料：粗糙链孢霉 1.野生型(+)2.赖氨酸缺陷型(Lys -)。四、实验设备：用具及材料 1. 设备：冰箱、恒温箱、普通显微镜。 2. 用具：尖头镊子、弯头针、接种针、载玻片、盖玻片、试管、三角烧瓶等。3. 药品：5的次氯酸钠。4. 培养基：(1
19、)基本培养基(野生型可生长，缺陷型不能生长 )：蔗糖10g，CaCl 2O0.1g、NaClO0.1g、NH 4NO31g、酒石酸铵 5g、生物素4ug、MgSO 47H2O0.5g、KH 2PO4 1g，微量元素溶液 1 毫升。将上述成分溶于 1000 毫升蒸馏水中，PH：5.5-6.5 ，即可。若需配制固体培养基，则再加 2琼脂即成。 (2)补充培养基：即在普通培养基上补加一种或多种生长物质如氨基酸、核酸、维生素等。氨基酸用量一般是 100 毫升基本培养基中 1-2mg。本实验所用补充培养基只要在基本培养基中加入适量赖氨酸。Lys -菌株就能生长。(3)麦芽汁培养基(可以代替补充培养基 )
20、：8 波美(一种糖浓度单位，用波美计测定) 麦芽汁两份，蒸馏水一份，再加 2琼脂即可。 (4)马铃薯培养基(也可代替补充培养基 )：将马铃薯洗净去皮、切碎，称取 200g 加水 1000 毫升，煮熟，用纱布过滤，取滤液加 2琼脂，20g 蔗糖煮融即可。也可将马铃薯切成黄豆大小碎块，在10+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 每支试管中放 3-4 粒，再加入融化好的琼脂，蔗糖。上述各种培养基都需在分装试管加上棉塞后，在 8 磅压力下灭菌 30 分钟，取出摆成斜面。 (5)杂交培养基：将玉米粒在水中浸泡 24 小时后凉干，每一试管放 2-3 粒
21、，加入少量融化好的琼脂，再放入一小片经多次折迭的滤纸(长度 3-4cm)，加上棉塞，8 磅压力下灭菌 30 分钟。五、实验步骤 1. 菌种活化：把野生型和 Lys-菌种从冰箱中取出，分别接种在两支试管的斜面上 (上述(2)(3) (4)培养基均可 )，28C 温箱培养 1-2 周，见有棕黑色的子囊果出现为止。2. 杂交：将这两菌种接种在一个玉米琼脂培养基上。野生型赖氨酸缺陷型(Lys +Lys-)。接种二支。28C 温箱培养 12 周，见有棕黑色的子囊出现为止。3. 在普通低倍显微镜或双筒解剖镜下观察子囊孢子分离与交换现象。将 5的次氯酸钠倒人小培养皿 1/3 左右。用镊子将试管中的折迭滤纸小
22、心拿出，浸泡在次氯酸钠溶液中。用镊子挑出大的成熟的子囊果放在载玻片上，盖上盖玻片然后压片。在显微镜下观察，计数(观察若干子囊果，记录每个完整的子囊类型) 。8 个子囊孢子中四个黑色的是野生型(+)。四个白色的是赖氨酸缺陷型 (1ys-)有 6 种排列顺序：发生分离但无交换 发生分离而且有交换4. 计算交换值。五、作业写好实验报告。附：观察记录表格：子囊类型 观 察 数 11合计实验七 果蝇唾腺染色体的观察和制片一、实验目的掌握剖离果蝇幼虫唾腺和制备唾腺染色体玻片标本的方法，观察唾腺染色体的形态并识别不同的染色体。二、实验原理 果蝇幼虫在成长中要经过两次蜕皮，可以分为三期，在幼虫成长中唾液细胞很
23、少分裂而核内染色丝却反复进行复制并且不缠卷折迭，因此当幼虫长到第三期时，唾腺的细胞核非常大，唾腺染色体要比其体细胞染色体大 200 倍以上，并且总是处于有丝分裂前期便于观察。根据其同源染色体配对的形态还可以观察到重复、缺失、倒位、易位等染色体畸变，果蝇唾腺染色体是研究染色体畸变的好材料。唾腺染色体上有明显的横纹，其相对大小和排列是恒定的，可以作为识别唾腺染色体的标志。果蝇三龄(期) 幼虫的唾腺剖离方便。三龄幼虫呈半透明状，头部有一黑点，即神经节。唾腺在神经节下面两侧(见附图)，在解剖镜下解剖针可将其拉出。唾腺呈两个半透明的棒状物，中间有一根细丝相连，便于制片。三、实验材料果蝇的三龄幼虫。四、实
24、验用具和用品 双筒解剖镜、显微镜、尖头镊子、解剖针、载玻片、盖玻片、生理盐水、5醋酸洋红染液、12滤纸、1NHCI、蒸馏水。附图：果蝇的幼虫五、实验步骤： (一)从培养瓶中挑选一条肥大的三龄幼虫放在载玻片上，加 1 滴生理盐水(勿使干燥)置于解剖镜下。(二)双手各握一支解剖针，一支针压住幼虫尾部 1/3 处，另一支针按住幼虫头部向前把头部自身体拉开。腺体随即而出，腺体位于食道两侧，中间是神经球。低倍镜下可见腺体由两层细胞规则排列而成。腺体拉出后，用针剔除脂肪。(三)除去幼虫的其它部分 用滤纸吸去生理盐水。在腺体上滴上一滴 1N HCl(使组织疏松)，2-3分钟。 (四)用滤纸吸去盐酸，滴一滴蒸
25、馏水，吸干再滴一滴；反复将腺体冲洗数次。(五)吸去蒸馏水，加上一滴醋酸洋红(或醋酸地衣红) 染色 30 分钟以上( 勿使干)。(六)用镊子加盖玻片，压片。使唾腺染色体破膜而出。镜检。六、作业绘制你所看到的清晰的唾腺染色体简图。挑最好的一块玻片标本贴上标签，写上标本名称、本人姓名、所在班、年、月、日与简图一起交上。 实验八 骨髓细胞染色体涂片法13一、意义和目的 小型哺乳动物骨髓细胞染色体标本制作在检测环境诱型剂方面有其独特的优点：方法简便；时间短、易于掌握；不需要特殊的细胞培养，一般实验室均可进行，更重要的是它能反映完整机体受环境的影响及受损程度，而优于其他染色制作法。被广泛地应用于进化遗传、
26、动物分类以及医学的研究。本实验的目的是学会掌握小型哺乳动物骨髓细胞染色体标本的直接制作方法并进行染色观察。 二、实验原理骨髓细胞具有高度分裂能力。在秋水仙素的毒害作用下，有丝分裂到了中期，纺缍丝不能出现，使众多的骨髓细胞的有丝分裂都停止在中期，正适于染色体观察。经低渗使细胞胀大，固定液使蛋白质变性， ；细胞膜变脆，铺于冰冷的载玻片上细胞膜破裂，染色体分散在一定范围，经染色在显微镜下就可清楚地观察到骨髓细胞染色体的分裂相。三、实验材料和用品 (一)材料：小白鼠(2n ：40)。(二)用具：显微镜、恒温水浴锅、冰箱、离心机、移液管、离心管、固定板、橡皮头吸管、天平、5 毫升和 1 毫升针管、注射针
27、、解剖剪、尖头镊子、酒精棉花、小培养皿、酒精灯、量简(20、50 、200 毫升)、烧杯(150 、50 毫升) 、载玻片(冷冻保存 )、盖玻片、定时钟、电吹风、染色缸。(三)药品：0.1秋水仙素。2.2柠檬酸钠(或 0.075NKCl)。甲醇、冰醋酸、磷酸缓冲液、姬姆萨母液、中性树胶、蒸馏水，0.85生理盐水。四、实验步骤(一)在取芦骨前 23 小时，在小白鼠腹腔内注射 0.1秋水仙素溶液，用量见附表。(二)处死小白鼠、固定、迅速取出两侧股骨、胫骨，刮净肌腱；放人小培养皿，立即用 0.85生理盐水冲洗干净。(三)剪掉股、胫骨两端膨大的关节头，使其露出骨髓腔，用吸有 5ml 的 0.85生理盐
28、水的注射器，从股、胫骨一端插入注射针头，将骨髓反复冲洗于小培养皿中，然后用吸管小心将全部冲洗液吸人离心管(尽量不吸残渣)，两侧后脚的冲洗液各吸人一个离心管，编组、号。(四)低渗：将所得的细胞悬液经 1000 转分离心 5 分钟，吸去上清液 4.5ml，加0.075NKCl2ml，立即将细胞团吹散打匀，再加 0.075NKCl 至 5ml，置 37水浴锅或恒温箱中低渗25 分钟。若在常温下低渗 30 分钟。14(五)离心：8001000 转分离心 5 分钟，用吸管小心弃去上清液。(六)固定：小心加入新配制的甲醇冰醋酸(3：1) 的固定液到原高度，5 分钟后用吸管将细胞(沉淀物 )翻转，再过 10
29、15 分钟后用吸管将细胞块轻轻打匀，再静置片刻。(七)以 8001000 转分转速，离心 5 分钟，弃去上清液，染色体分散不理想时可重复固定，再加入固定液约 l 毫升，用吸管小心吸成均匀细胞悬液，以备制片。(八)取于净无油冰水中的载玻片倾斜成 30，在上 1 乃处下滴细胞悬液 23 滴，并同时微微吹气， ，使细胞破裂染色体分散，并在载玻片一边编号标记。(九)阴干或酒精灯微微烤干，用 Giemsa 染色 1015 分钟(染色半标本)。(十)将染色液倒人培养皿，用细小自来水冲洗载玻片，再用蒸馏水冲洗一遍，阴干或用酒精灯微微烤干。(十一)镜检(十二)选取好的涂片标本用中性树脂封好，贴上标签长期保存。
30、五、作业写好实验报告，绘制 12 个图相清晰，染色体数目准确，形态典型的细胞图。并要求每组交2 片染色的成功制片和其余未染色的制片，粘好标签，写明制片名称、班级、组别、年、月、日。 附 2：睾丸制片在秋水仙素处理过的雄鼠身上在取股骨、胫骨的同时，取睾丸放入小培养皿，用手术剪剪碎。用 2.2%柠檬酸钠（或 0.075NKCI）冲洗，方法与骨髓细胞类制片同，不过在注意，离心速度宜慢些以便清险精子，染色时间要稍长些。实验九 外周血淋巴细胞培养和染色体标本制备一、意义和目的外周血淋巴细胞培养是研究人和哺乳动物染色体的一个较为简便而可靠的方法。它不必损害个体，只需采取少量的血液经过 2-3 天的离体培养
31、就可制备含有大量细胞染色体的标本，近十多年来已成为研究人和哺乳动物染色体用得较普遍的方法之一。本实验目的是要求学生掌握制作哺乳动物外周血淋巴细胞染色体标本的方法，学会这样一种科15学研究的实验室手段，并进行染色体观察。二、实验原理 哺乳动物外周血淋巴细胞虽然有核，但在正常情况下是不能进行有丝分裂的。离体培养在一定量的植物凝聚素(PHA)刺激下外周血淋巴细胞转化为淋巴母细胞，再进行有丝分裂。有丝分裂中的淋巴细胞受到一定剂量的秋水仙素(化学诱变剂) 毒害作用，使有丝分裂到了中期就被迫中止。经低渗、固定、铺片就可以制得大量染色体标本。三、实验材料和用品(一)材料：猪血( 或人血*)。(二)设备用具：
32、显微镜、恒温箱、恒温水浴锅、冰箱、离心机、离心管、试管架、5 毫升和 1 毫升注射器、滴管、酒精灯、量筒(25、50、 200 毫升) 、烧杯(150、500 毫升) 、培养瓶、胶，布、酒精棉、载玻片、盖玻片、定时钟、电吹风、染色缸、无菌操作箱(或超净工作台) 。(三)药品：RPMI 1640 培养液 (或用 TCl99 培养液)、小牛血清( 或猪血清) 、青霉素、肝素(1000IU/m1)、5NailCO 3、秋水仙素(20ug/ml)、生理盐水、0.075NKCI 、PH7.4 磷酸缓冲液、Giemsa 原液、甲醇、冰醋酸。四、实验步骤 (一)综合培养液的配制和分装-将冰箱中保存的血清、P
33、HA、肝素、RPMl 1640 培养液取出 37C 水浴融化。在无菌条件下按比例配制，用 5调 PH 至 7.00.2，再分装培养瓶，每瓶 5ml。RPMll640 培养液 80小牛血清(或猪血清) 20PHA 2肝素 0.5青霉素 100IU毫升培养基链霉素 100IU/毫升培养基(二)采猪血、接种： 用 5ml 注射器吸取肝素 0.5ml，采静脉血至 5ml 混匀，用注射针插入培养瓶的橡皮塞，每瓶接16种 0.3-0.4ml 肝素混合猪血，轻轻摇匀( 采血和接种过程，用具均须无菌或酒精棉擦试)。 (三)培养： 置 38.2恒温箱中培养 56 小时(四)秋水仙素处理；在恒温箱中培养中止前 3
34、 小时，用 12 号针头加秋水仙素(20ugm1)1 滴(使培养液最终浓度为 0.04-0.06ugm1)。轻轻摇匀在恒温箱继续培养 3 小时。 (五)收集细胞：用吸管轻轻将培养物打匀，移人离心管，离心 10 分钟(2500 转) ，弃去上清液。(六)低渗处理：加入 37预温的 0.075MKCI 低渗液 8ml，用吸管打匀置 37恒温处理 10-15 分钟，使红细胞破裂，白细胞膨胀。(七)预固定 加入新配的甲醇冰醋酸(3： 1)固定液 lml 左右，轻轻打匀。(八)离心(2000 转分)10 分钟，弃去上清液。 (九)第一次固定：沿管壁轻轻加入固定液 67ml，固定 10 分钟后，用吸管轻轻
35、把细胞块团打散打匀，再静置固定 20 分钟，离心(2000 转分 )10 分钟，弃去上清液。(十)第二次固定：加固定液 6ml，轻轻打匀，再固定 30 分钟，离心(2000 转份)10 分钟，弃去上清液。(十一)铺片：加固定液 0.5ml，细心轻轻将其打匀成细胞悬浮液。在冰箱预冷的载玻片上 13 处，向下每片滴加 23 滴细胞悬浮液，立即用嘴吹散，然后在酒精灯上微微烤干(或电吹风机吹干) ，作好标记。(十二)染色： (每管细胞悬浮液制成的片子中染三张，其余作好标记留待下次实验用，用Giemsa 染液(25PH7.4 磷酸缓冲液：1Giemsa 原液)染色 10 分钟左右。用自来水细流冲片，空气
36、干燥。(十三)镜检： 待干后，在显微镜下，先用低倍镜寻找染色体分散良好的中期相，再转换油镜观察。五、作业写好实验报告，绘制染色体镜相简图，每组交二张标本片。注：人外周血淋巴细胞培养及常规染色体标本的制备与猪的差别在于人的只能用小牛血清，培养温度为 37，培养时间 72 小时，离心速度 1500 转分，其余皆相同。17实验十 染色体 G显带标本的制备与识别一、意义和目的实验八和实验九所介绍的都是常规制片方法，在核型分析时只能区分染色体组号和识别个别染色体号以及明显的形态畸变，染色体显带技术的出现使染色体研究进入一个新阶段，它不但可以准确识别每条染色体的编号，还可检查出常规制片无法识别的染色体结构
37、畸变。 分带染色方法有多种，有 A带、C带、D带、G 带、N 一带、Q带、R带、T带，目前用得较多的是 C带、G带，这两种分带染色的方法，又有多种，本实验仅介绍 G显带技术中一种常用的胰蛋白消化法。本实验目的要求大家掌握这样一种染色体研究的实验室手段。二、实验材料和用品：(一)材料： 实验八、实验九制作的染色体白片各 8 张以上。(二)器具：恒温箱、恒温水浴锅、离心机、冰箱、移液枪、显微镜、酸度计、立式染色缸、镊子、温度计、滴管。(三)药品：2.5胰蛋白酶原液(冰箱保存 )，0.85NaCl、3Tris 溶液 (三羟甲基氨基甲烷)、0.4酚红，Giemsa 染色液 (现配)，PH7.4 磷酸缓
38、冲液。三、实验步骤：(一)染色体标本制作： 将编号的常规制片置 75-80 烤箱中烤片 2-3 小时，待自然冷却后放人 37恒温箱中待用。(二)胰蛋白酶消化液的配制( 使用浓度可酌情变动，本实验用 0.04)取 0.85NaCl 溶液 60ml，加入染色缸中再加入 2.5胰蛋白酶原液 lml，加 2-3 滴酚红作指示剂，用 3Tris 调至 PH6.4 左右，使消化液呈淡橙色即可，置 37恒温水浴锅内待用。 18(三)消化与染色：待胰蛋白酶消化液温度上升到 37时，取玻片标本浸没于消化液中，并不断轻轻摆动，消化处理约 90100 秒钟，取出玻片竖立于滤纸上吸去多余的消化液，Giemsa 染色
39、8-10 分钟，用自来水细流冲洗，空气干燥。(四)镜检观察(有条件则进行显微照相) 。19实验十一 人群中 P.T.C 味盲基因频率的分析一、实验目的：通过对人体 P.T.C (苯硫脲)的味觉调查，练习计算基因频率与基因型频率并加深对基因平衡定律及选择对改变基因频率影响的理解。 二、实验原理：人体对 P.T.C (苯硫脲Phenyl thiocarbamlde)尝味的能力是由一对等位基因(T t)所决定的遗传性状，T 对 t 为不完全显性。 苯硫脲是一种白色结晶状有机化合物，有（N=C=S）硫酰胺基而带苦味。在人群中味觉正常者(TT)能尝出的浓度为 175000016000000 的 P.T.
40、C 溶液中的苦味；杂合子(Tt)只能尝出1480001380000 的 P.T.C 溶液的苦味；基因型 tt 的人，只能尝出低于 124000 P.T.C 溶液的苦味，甚至对 P.T.C 的结晶物也尝不出苦味来，这类人在遗传学上被称为味盲。根据基因平衡规律，在人群中味觉基因(Tt) 的频率和基因型频率是保持平衡状态的而且始终保持不变。三、实验材料及方法(一) P.T.C 溶液的配制：原液：取 P.T.C 结晶 1.3g，加蒸馏水 100ml，时时摇晃，在室温(20左右)1 2 日即完全溶解。(二)将配制好的 14 种( 见附表) P.T.C 溶液，分装于消毒好的滴瓶中。(三)若干毫升蒸馏水和洗
41、净的滴管。(四)操作要求：1.受试者坐在椅子上，仰头张嘴，实验者用滴管先吸取第 14 号 P.T.C 溶液，滴 510 滴于舌根部，令受试者徐徐咽下品味，然后再用滴管自盛有蒸馏水的滴瓶中吸取蒸馏水，滴 510 滴于舌根部，令受试者徐徐咽下品味。2.询问受试者能否鉴别此种溶液的味道。如若不能鉴别或鉴别不准确(如认为 P.T.C 溶液味道是酸、咸、辣或说不出的其他药味)则再用稍浓的 13 号溶液重复尝试，直至能说明 P.T.C 的苦味为止。3.当受试者鉴别某一种溶液时，应当再用此号溶液重复尝味三次，三次结果相同，才算可靠。 4.测定过程中应将 P.T.C 溶液与蒸馏水反复交替使用，以免由于受试者的
42、猜想及其心理作用影响结果的准确性。205.作好测定结果记录。(五)分析并计算四、作业要求每个课小组测定 100 人以上，计算基因频率和基因型频率，再按全班 6 个课小组测定的全部结果计算基因频率和基因型频率，作比较分析，若将隐性基因的个体全部从测定群体中调出，下一代基因频率和基因型频率又将发生何种变化? 若将隐性基因的个体连续多代从测定群体中调出，问需要经过多少代才能使隐性基因频率达到原来的 1/10？写成实验报告。附表：原液和其他 13 种浓度的溶液稀释法及 P.T.C 含量表溶液号 稀释方法 稀释倍数 约含 P.T.C 的浓度 基因型阀值1 原 液 1 17502 原液 l00ml+水 l
43、00ml 2 115003 2 号原液 l00ml+水 l00ml 4 130004 3 号原液 l00ml+水 100ml 8 160005 4 号原液 l00ml+水 l00ml 16 1120006 5 号原液 l00ml+水 l00ml 32 1240007 6 号原液 l00ml+水 l00ml 64 1480008 7 号原液 l00ml+水 l00ml 128 1960009 8 号原液 l00ml+水 100ml 256 119000010 9 号原液 l00ml+水 l00ml 512 138000011 10 号原液 l00ml+水 l00ml 1024 1750000tt
44、Tt12 11 号原液 l00ml+水 l00ml 2048 1150000013 12 号原液 l00ml+水 100m1 4096 1300000014 13 号原液 l00ml+水 l00ml 8192 16000000TT经测定：TT：105 人； Tt:780 人; tt:126 人21实验十二 遗传力和重复率的估算一、意义和目的： 遗传力是数量遗传的核心。在育种工作中应用广泛，根据选择性状的遗传力大小可用来确定畜禽的繁育和选择方法，预测选择效果及估算育种值。重复率则是遗传力的上限，可作为遗传力估算是否正确的参考，根据所测性状的重复率大小可确定该性状需要度量的次数，也可用来估算畜禽的
45、育种值，当代可能生产力，以便充分挖掘生产潜力。本实验的目的是要求学会并掌握利用方差组分估计组内相关估算遗传力和重复率的方法。二、实验材料和方法：(一)材料：有关统计资料。(二)工具：计算器。(三)方法： 1.遗传力估测的方法常用的有两种，即子亲相关法和同胞相关法，这里仅介绍半同胞相关法。根据通径原理，半同胞间的表型相关应为： 221hrAp半同胞间的遗传相关： HSArh45.02求半同胞表型相关的基本公式： WBHSMSnr)1(0MSB： 组间均方（家系间）MSW：组内均方（半同胞之间）n0：家系平均半同胞数。遗传力的显著性测定采用 t 检验：2ht22)1()(12402(2)()( )
46、()(2 knrrt HSSrHSrhS HSSrdf 总 =N-1，df 组间 =K-1，df 组内 =df 总 df 组间 =N-K，按 df 组内 查 t 表，得 t0.01、t 0.05 值，比较作出统计推断。2.重复率的估算： WBeMSnSr)1(0MSB：个体间（组间）均方。MSW：个体内变量间（组内）均方。re：重复率。n0：每个个体平均度量的次数。重复率的显著性测定也用 t 检验 KNdff knrrtBTWeeee )1()(12,02由 dfW 查 t 表，求取临界 t 值，比较作出统计推断。注，组内相关系数的显著性检验也可查r 及 R 显著数值表来作出统计推断。三、实验步骤（一）整理资料。（二）分别计算各组的X、 X 2 和 CX 即 in2)(（三）累计求出X、 X2 和C X（四）计算平方和、自由度和均方。23)(1)(1,1,1 )()(220 2222NndfnKnfSMdfSNfnfKSnXCXSniBii WBTWiB BTWiXWiB （五）求出组内相关系数： WBMSnSr)1(0若是按家系分组的半同胞资料，求得的组内相关系数即半同胞的表型相关 。HSSrhr4,2)(若是按个体分组的重复度量值资料，求得的即重复率 er（六）再进行显著性检验，作出统计推断。（七）作出试验小结。四、作业：（一）宁乡种猪场，5 头宁乡种公猪的后代 6 月龄体
