1、1,动物疫病采样,保存 及送样技术,湖北省动物疫病预防控制中心 宋 念 华 2008 . 7,2,动物疫病采样,保存及送样技术,湖北省动物疫病预防控制中心 宋 念 华 2008 . 7,3,随着畜牧业的发展,科技进步以及国际贸易的日益频繁，动物传染病也在发生变化。,湖北动物疫病控制中心,有些传染病临床症状和剖检变化越来越不典型； 有些传染病的临床症状和剖检变化比较相似； 有的传染病也不能仅凭特征性病变确诊 。,4,同时由于人们观念的转变，衡量免疫状况，制定合理免疫程序,进行疫病监控,掌握疫病动态等都要根据监测数据来确定。兽医实验室的工作显得越来越重要。而在动物疫病诊断、监测中，采样方法、采样部
2、位、采样数量和样品质量直接决定诊断监测结果的准确性和监测结论的科学性。因此，对采样人员采样方法、技术都有特定的要求。,湖北动物疫病控制中心,5,主要内容,采样一般原则 采样器械物品的准备 实验采样时机、部位和数量 采样方法 采样时注意事项 采样实例 运输保存 采样和运输过程中生物安全,湖北动物疫病控制中心,6,采样一般原则（1）,1. 凡是血液凝固不良,鼻孔流血的病,死动物，应耳尖采血涂片，首先排除炭疽，炭疽病死的动物严禁剖检。 2. 采样时应从胸腔到腹腔，先采实质器官做到无菌，避免外源性的污染，最后采污染的组织，如胃肠组织、粪便等。 3. 采取的病料必须有代表性，采取的组织器官应病变部位明显
3、。采取病料时应根据不同的疫病或检验目的，采其相应血样、活体组织、脏器、肠内容物、分泌物、排泄物或其他材料。病因不明时，应系统采集病料。,湖北动物疫病控制中心,7,采样一般原则（2）,4. 病料应在使用治疗药物前采取，用药后会影响病料中微生物的检出。死亡动物的内脏病料采取，最迟不超过死后6小时(尤其在夏季)，否则，尸体腐败，难以采到合格的病料。 5. 血液样品在采集前一般禁食8小时。采集血样时，应根据采样对象、检验目的及所需血量确定采血方法与采血部位。 6. 采样时应对环境的影响，防止污染环境和疫病传播，做好环境消毒和废弃物的处理，同时做好个人防护，预防人畜共患病感染。,湖北动物疫病控制中心,8
4、,采样器械物品的准备（1）,（一）器 械 1. 采样箱、保温箱或保温瓶、解剖刀、剪刀、镊子、酒精灯、酒精棉、碘酒棉、一次性注射器等。 2. 样品容器包括小瓶、玻片、平皿、离心管及易封口样品袋、塑料包装袋等。 3. 试管架、铝盒、瓶塞、无菌棉拭子、胶布、封口膜、封条、冰袋等。 4.个人防护用品 口罩、防护镜、一次性防护服、手套、鞋套、帽子等注意：采样刀剪等器具和样品容器须无菌。,湖北动物疫病控制中心,9,采样器械物品的准备（2）,（二）采样记录用品不干胶标签、签字笔、记号笔、采样单等。 （三）保存液阿氏液(A1severs)、30甘油盐水缓冲液、肉汤、PBS液、双抗。,湖北动物疫病控制中心,10
5、,采样时机和数量,根据实验目的采取不同的样本类型，如组织、血清等；送检的样本数应满足送检目的的需要；采集的样本应具有一定的代表性。1.诊断时 样本最好发病初期（未用药），临床症状明显期采集5只(头)以上病死和发病动物的有病变的器官组织、血清和抗凝血各10份。,湖北动物疫病控制中心,11,采样时机和数量,2.免疫效果监测时 动物免疫后14-20天，随机采集同群动物血清样品30份。3.疫情监测或流行病学调查时 采集血清、各种拭子、体液、粪尿或皮毛样品等，采样数量可根据动物年龄、季节、周边疫情情况估算其感染率，然后计算应采样品数量。,湖北动物疫病控制中心,12,采集方法及技术要求,湖北动物疫病控制中
6、心,13,禽的采样方法,1. 翅静脉采血 ： 在翅下静脉处消毒，手持采血针，从无血管处向翅静脉丛刺入，见有血液回流，即把针芯向外拉使血液流入采血针。采血完毕用干棉球按压止血。,湖北动物疫病控制中心,2. 家禽喉拭子和泄殖腔拭子采集方法 取无菌棉签，插入鸡喉头内或泄殖腔转动3圈，取出，插入离心管中(双抗PBS)，盖紧瓶盖，做好标记。密封低温保存。,14,禽的采样方法,湖北动物疫病控制中心,3. 羽毛采集方法 拔取受检鸡含羽髓丰满的翅羽或身上其他部位大羽，将含有羽髓的羽根部分按编号分别剪下收集于小试管内，于每管内滴加蒸馏水23滴(羽髓丰满时也可不加)，用玻璃棒将羽根挤压于试管底，使羽髓浸出液流至管
7、口，用滴管将其吸出。,15,猪的采血方法,1. 耳缘静脉采血 2. 前腔静脉采血 (1)站立保定：保定器保定让猪头仰起，露出右腋窝，从右侧向心脏方向刺人，回抽见有回血时，即把针芯向外拉使血液流入采血针。 (2)仰卧保定：把前肢向后方拉直。一般用装有20号针头的注射器采血，其穿刺部位在胸骨端与耳基部连线上胸骨端旁开2厘米的凹陷处，向后内方与地面呈60度角。角刺入23厘米，当进入约2厘米时可一边刺入一边回抽针管内芯；刺人血管时即可见血进入针管内，采血完毕，局部消毒。,湖北动物疫病控制中心,16,猪活体的样品采集,1.扁桃体采取方法 从活体采取扁桃体样品时，应使用专用扁桃体采集器：先用开口器开口，可
8、以看到突起的扁桃体，把采样钩放在扁桃体上，快速扣动扳机取出扁桃体放离心管中，冷藏送检。 2.鼻腔拭子、咽拭子采集方法 应用灭菌的棉拭子采集鼻腔、咽喉的分泌物，蘸取分泌物后，立即将拭子浸入保存液中，密封低温保存。一般每支拭子需保存液1毫升。,湖北动物疫病控制中心,17,猪活体的样品采集,3. 肛拭子采集方法 用灭菌棉拭子插入肛门或泄殖腔内采集其内容物和分泌物后，立即将拭子浸入保存液中，密封低温保存。一般每支拭子需保存液1毫升。,湖北动物疫病控制中心,18,牛、羊采血方法,牛、羊颈静脉采血 将动物保定，稍抬头颈，于颈静脉沟上13与中13交界部剪毛消毒，一手拇指按压采血部位下方颈静脉沟血管，促使颈静
9、脉怒张，另一手执针头，与皮肤呈45度角。角由下向上方刺入，血液顺器壁流人容器内，防止气泡产生。待血量达到要求后，拔下针头，用消毒棉球按压针眼，轻按止血。,湖北动物疫病控制中心,19,脓 汁,做病原菌检验的，应在药物未治疗前采取。采集已破口脓灶脓汁，宜用棉拭子蘸取，剪去露出部分，盖紧瓶盖，做好标记；未破口脓灶，用注射器抽取脓汁，密封低温保存。,湖北动物疫病控制中心,20,乳 汁,乳房先用消毒药水洗净(取乳者的手亦应事先消毒)，并把乳房附近的毛刷湿，最初所挤的34把乳汁弃去，然后再采集10毫升左右乳汁于灭菌试管中。进行血清学检验的乳汁不应冻结、加热或强烈震动。,湖北动物疫病控制中心,21,粪便样品
10、的采集（1）,1. 用于病毒检验样品 分离病毒的粪便必须新鲜。少量采集时，以灭菌的棉拭子从直肠深处或泄殖腔黏膜上蘸取粪便，并立即投入灭菌的试管内密封，或在试管内加入少量pH7.4的保护液再密封；须采集较多量的粪便时，可将动物肛门周围消毒后，用器械或用戴上胶手套的手伸入直肠内取粪便，也可用压舌板插入直肠，轻轻用力下压，刺激排粪，收集粪便。所收集的粪便装入灭菌的容器内，经密封并贴上标签，立即冷藏或冷冻送实验室。,湖北动物疫病控制中心,22,粪便样品的采集（2）,2. 用于细菌检验的粪便样品采集 做细菌检验的粪便，最好是在动物使用抗菌药物之前，从直肠或泄殖腔内采集新鲜粪便。采样方法与供病毒检验的方法
11、相同。粪便样品较少时，可投入无菌缓冲盐水或肉汤试管内；较多量的粪便则可装入灭菌容器内，贴上标签后冷藏送实验室。,湖北动物疫病控制中心,23,粪便样品的采集（3）,3. 用于寄生虫检验的粪便样品采集 粪便样品应选自新排出的粪便或直接从直肠内采得，以保持虫体或虫体节片及虫卵的固有形态，一般寄生虫检验所用粪便量较多，需采取519克新鲜粪便，大家畜一般不少于60克，并应从粪便的内外各层采取。粪便样品以冷藏不冻结状态保存。,湖北动物疫病控制中心,24,采样注意事项（1）,采集前应准备好经消毒的器械和容器。 死因不明的动物尸体，在解剖前，必须做血液涂片，染色镜检，排除炭疽后方能解剖取样。 病料的采取，须于
12、动物死后6小时以内进行。 采样时必须做到无菌操作采取，病料要尽可能齐全，除了内脏、血清、淋巴结和局部病变组织外，还应采取脑组织。尽快冷冻保存。,湖北动物疫病控制中心,注意事项,25,采样注意事项（2）,天气炎热或不能马上送检的用作细菌检验的材料，可用30%甘油缓冲盐水保存；作病毒检验的材料，可用50%甘油缓冲盐水保存，并做到低温保存传递。 注意个人卫生防护，在采样中必须穿戴工作服和手套。 采样后要及时对尸体进行无害化处理，被污染的场地进行彻底消毒。,湖北动物疫病控制中心,注意事项,26,采 样 实 例,湖北动物疫病控制中心,27,口蹄疫采样（1）,样品的选择用于病毒分离、鉴定的样品以发病动物(
13、牛、羊或猪)未破裂的水泡皮和水泡液为最好。样品的采集和保存样品采集部位可用清水清洗(切忌使用酒精、碘酒等消毒剂消毒、擦拭)，剪取病畜的新鲜水泡皮35克放入灭菌小瓶中，加适量50甘油磷酸盐缓冲液(pH7.4)，加盖密封；也可采用无菌器具采集水泡液至少1毫升，装入灭菌小瓶中(可加适量抗菌素)，加盖密封。尽快冷冻保存。,湖北动物疫病控制中心,28,口蹄疫采样（2）,血清样品在发病和扑杀时均应无菌操作采集10份以上的血清，每头血清不少于1mL。无菌分离血清装入1.5mL离心管中，加盖密封后冷藏保存，通过检测抗体，做出追溯性诊断。,湖北动物疫病控制中心,29,口蹄疫采样（3）,牛、羊O-P液(咽食道分泌
14、物)的采集方法被检动物在采样前禁食(可饮少量水)12小时，以免胃内容物反流污染O-P液。采样探杯在使用前经装有0.2柠檬酸或2氢氧化钠溶液的塑料桶中浸泡5分钟，再用与动物体温一致的清水冲洗探杯后使用，每采完一头动物，探杯要重复进行消毒并充分清洗。,湖北动物疫病控制中心,30,口蹄疫采样（4）,牛、羊O-P液(咽食道分泌物)的采集方法采样时动物应站立保定，将探杯随吞咽动作送人食道上部1015厘米处，轻轻来回抽动23次，然后将探杯拉出。取出810毫升O-P液，倒入含有等量细胞培养液(0.5水解乳蛋白-Earle液)或磷酸缓冲液(0.04摩升、pH7.4)的灭菌广口瓶中，充分摇匀加盖封口，放冷藏箱及
15、时送检，未能及时送检应置于-30冷冻保存。,湖北动物疫病控制中心,31,禽流感采样（1）,组织样品 应采集组织样品。取死亡不久的5只病死禽采样，病死禽数不足5只时，取发病禽补齐5只。 每只禽采集肠管及肠内容物 1 份；肺和气管样品 1 份；肝、脾、肾、脑等各 1 份并分别采集。上述每个样品取样重量为 15g-20g，放于样品袋或平皿中，如果重量不够可取全部脏器（如脾脏）。 不同禽只脏器不能混样，同一禽只不同脏器不应混样。,湖北动物疫病控制中心,32,禽流感采样（2),拭子样品 取5只病禽采样，每只采集泄殖腔拭子和喉气管拭子各 1 个，将样品端剪下分别置于含有抗生素 PBS 的（加1.0mL-1
16、.3mLPBS）小塑料离心管中，封好口，贴好标签。 喉气管拭子采集方法：将棉拭子插入口腔至咽的后部直达喉气管，轻轻擦拭并慢慢旋转，沾上气管分泌物。 泄殖腔拭子采集方法：将棉拭子插入泄殖腔约 1.5-2cm,旋转后沾上粪便。,湖北动物疫病控制中心,33,禽流感采样(3）,粪便样品小珍禽采泄殖腔拭子容易造成伤害，可只采集5个新鲜粪便样品（每个样品 1 g-2 g ），置于内含有抗生素 PBS （加 1mL-1.5mLPBS）的离心管中，封好口，贴好标签。保存粪便和泄殖腔拭子的 PBS 中抗生素浓度提高 5 倍。,湖北动物疫病控制中心,34,禽流感采样（4）,血清样品采集10只病禽的血样，心脏或翅静
17、脉采血，每只病禽采血样2mL-3mL，盛于西林瓶中或10mL 离心管中，经离心或自然放置析出血清后，将血清移到1.5ml小塑料离心管中，盖紧瓶塞，封好口，贴好标签。不同禽只的血样不能混合。,湖北动物疫病控制中心,35,高致病性猪兰耳病采样,实质脏器样品：无菌采集濒死猪扁桃体、肺、脑、心、肝、脾、肾、淋巴结及其他可见病变的组织10-20克以上，放入无菌容器内。每块组织最好单独放在1个容器内（也可置于自封袋中），用记号笔注明日期、组织脏器和动物名称。注意防止组织间相互污染，及时置于低温条件下保存。 血清样品：采集的血液2-5mL，在室温下静置2h-4h（防止曝晒），待血液凝固后分离血清。若需长时间
18、保存，则将血清置-20以下保存，但要尽量避免反复冻融。 胚胎样本：选取完整、无腐败的胚胎送检动物主要疫病病原监测取样样品.doc,湖北动物疫病控制中心,36,做好样本记录,样品记录应伴随样品送到实验室，且应包括以下内容：畜禽主的姓名和养殖场的地址，场（圈、户）里饲养的畜禽品种及其数量，被感染的畜禽种类，首发和继发病例的日期及造成的损失；出现临床症状的畜禽只数量、死亡畜禽只数量及其年龄，临床症状及其持续时间，死亡情况和时间，基本病理变化，免疫和用药情况等；送检样品清单和说明，包括病料的种类、保存方法，要求做何种检测，送检者的姓名、地址、邮编和电话，送检日期等。,湖北动物疫病控制中心,37,做好流
19、行病学调查和疫情报告,发病的范围、数量、死亡情况 临床、解剖症状 发病畜禽的大小、畜别、品种、来源等 各种疫苗免疫情况注射时间、剂量，疫苗使用的厂家、批号 发病时用药情况等等,湖北动物疫病控制中心,尽可能把情况摸的详细清楚！,38,采样完毕后，应根据不同疫病的要求填写好采样登记表、流行病学调查表和疫情报告。,湖北动物疫病控制中心,采样登记表,流行病调查表,39,运输及保存（1）,采用正确的送检及保存方法。根据实验目的和病原体的特性来选择保存方法，并做到低温保存传递。天气炎热或不能马上送检的用作细菌检验的材料，可用30%甘油缓冲盐水保存；作病毒检验的材料，可用50%甘油缓冲盐水保存；用于分离血清
20、的血液材料应放于常温1-2小时待血清自然析出后，分离血清低温保存。,湖北动物疫病控制中心,40,运输及保存（2）,一般是将所采集的样品要以最快最直接的途径送往实验室。如果样品能在采集后24小时内送抵实验室，则可放在4左右的容器中运送。在24小时内不能送到实验室时，可将样品冷冻，并维持低温状态运送；运输前将样品玻璃容器装入金属套筒中，套筒应填充防震材料，加盖密封，与采样记录一同装入专用运输容器中。专用运输容器应隔热坚固，内装适当冷冻剂和防震材料。外包装上要加贴生物安全警示标志。,湖北动物疫病控制中心,41,生物危害级（图标）,湖北动物疫病控制中心,42,送样内外包装,湖北动物疫病控制中心,43,
21、采样运输过程中生物安全,兽医生物安全有二方面的含义。 一是减少或消除兽医工作人员受到感染和污染的可能性，在采样、运输过程中，接触的动物或样品有可能带有人畜共患病原，如牛羊布鲁氏菌、狂犬病病毒等，时刻威胁着工作人员的健康。如果没有个人防护知识、必要的防护措施和良好的操作技术规范，很可能造成人员的感染。 二是采样、运输过程中的废弃物处理、无害化处理等，保护环境安全，否则都可能引起散毒。因此，必须高度重视动物采样过程的生物安全工作。,湖北动物疫病控制中心,44,采样生物安全隐患,1活体采样时动物的自身活动可能产生新的危害，如抓咬伤工作人员。 2工作人员操作不小心或正在使用的器材设备等引起，如刀片割破
22、、针头刺伤等。 3动物中也可能有隐性感染病，可污染环境，工作人员和其他有关人员不知不觉地吸入动物发散的气溶胶，都有可能造成严重后果。 4病死动物所带病原的复杂性、未知性，解剖采样过程中可能会对工作人员构成威胁，对环境造成污染(污水、血液)及对周围的动物构成威胁。,湖北动物疫病控制中心,45,采样的生物安全措施（1）,1重大动物疫病没有允许禁止采样，怀疑炭疽时首先采耳尖血涂片检查，确诊后禁止剖检。2采样人员必须是兽医技术人员。具备动物传染病感染、传播流行与预防的相关知识，熟练掌握各种动物的保定技术和各种采样技术。3采样协助人员培训：当相关工作人员在与动物接触时，应该学会避免不必要的风险，工作人员
23、应根据其工作地点具有的风险性接受相应的培训，所有的人员也都必须了解采样的动物可能带有疫病与人畜共患病，以及可能的感染与传播方式。工作过程中出现的异常情况处置，以及个人卫生和其他方面的知识。,湖北动物疫病控制中心,46,采样的生物安全措施（2）,4操作规范：可以做为一条规则的是，生物安全是建立在接受过培训的人员认真履行安全准则的基础上的。健康采样与免疫基本相近，但如果是病死动物的采样，感染和扩散的风险更大，防护、操作更要严格。同时还要保护样品质量和生物安全。(1)健康采样时遵守出入养殖场(户)的隔离消毒措施，防止通过包疫人员的活动造成疫病传播，由于各养殖场动物的免疫、抵抗力不同，可能在一个场有动
24、物隐性带毒不发病，一旦人为机械带入另一个养殖场，可能引起动物感染发病和流行。因此，出入养殖场必须更换隔离服和手套并做好胶靴消毒。如果是发病场更应严格。,湖北动物疫病控制中心,47,采样的生物安全措施（3）,(2)进入养殖场，首先观察动物是否健康，一是动物发生某些疫病时，可能产生对人的攻击行为，如奶牛狂犬病、疯牛病等。 (3)尽可能使用物理限制设备，保定动物，既保证人的安全，也保正样品的质量。 (4)做好采样器械的消毒，避免样品的交叉污染。 (5)对动物进行保定，做好人员防护，防止出现针刺伤风险。 (6)尖锐物品处理，注射用针头、刀片一旦使用完毕，必须立刻投人尖锐物品箱内以待处理。 (7)病死动
25、物要在隔离区(下铺塑料布)或实验室剖检、采样，采样后的动物尸体、废弃物等进行烧毁或深埋等无害化处理。 (8)采样结束，采样人员需更衣消毒，对采样的环境进行消毒清理。,湖北动物疫病控制中心,48,运输中生物安全,1.运输目的、用途和接受单位符合规定。 2.运输容器符合规定。 3.印有生物危险标识、警告用语和提示用语。 4.原则上通过陆路运输，水路也可；紧急情况下，可以通过民用航空运输。 5.经过省级以上兽医主管部门批准：省内的由省级批准；跨省或运往国外的，省级初审后，由农业部批准。 6.应当有不少于2人的专人护送，并采取防护措施。 7.发生被盗、被抢、丢失、泄露的，立即采取控制措施，在2小时内向有关部门报告。,湖北动物疫病控制中心,49,谢 谢,
