1、 1 第六节 免疫胶体金技术(Immune colloidal gold technique)一、概况（一） 原理 免疫胶体金技术是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术。胶体金是由氯金酸（HAuCl 4）在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，称为胶体金。胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。胶体金除了与蛋白质结合以外，还可以与许多其它生物大分子结合，如SPA、PHA、ConA 等。根据胶体金的一些物理性状，如高电
2、子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，因而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。（二） 胶体金的制备 根据不同的还原剂可以制备大小不同的胶体金颗粒。常用来制备胶体金颗粒的方法如下。1枸橼酸三钠还原法（1）10nm 胶体金粒的制备：取 0.01HAuCl 4 水溶液 100ml，加入 1枸橼酸三钠水溶液 3ml，加热煮沸 30min，冷却至 4，溶液呈红色。（2）15nm 胶体金颗粒的制备：取 0.01HAuCl 4 水溶液 100ml，加入 1枸橼酸三钠水溶液 2ml，加热煮沸 15min30min，直至颜色变红。冷却后加入0.1Mol/L K
3、2CO30.5ml，混匀即可。（3）15nm、18nm20nm、30nm 或 50nm 胶体金颗粒的制备：取0.01HAuCl 4 水溶液 100ml，加热煮沸。根据需要迅速加入 1枸橼酸三钠水溶 2 液 4ml、2.5ml、1ml 或 0.75ml，继续煮沸约 5min，出现橙红色。这样制成的胶体金颗粒则分别为 15nm、18 20nm、30nm 和 50nm。2鞣酸枸橼酸钠还原法A 液：1HAuCl 4 水溶液 1ml 加入 79ml 双馏水中混匀。B 液：1枸橼酸三钠 4ml，1鞣酸 0.7ml，0.1Mol/L K 2CO3 液 0.2ml，混合，加入双馏水至 20ml。将 A 液、B
4、 液分别加热至 60，在电磁搅拌下迅速将 B 液加入 A 液中，溶液变蓝，继续加热搅拌至溶液变成亮红色。此法制得的金颗粒的直径为 5nm。如需要制备其它直径的金颗粒，则按表 15-1 所列的数字调整鞣酸及 K2CO3 的用量。表 15-1 鞣酸枸橼酸钠还原法试剂配制表3制备高质量胶体金的注意事项（1）玻璃器皿必须彻底清洗，最好是经过硅化处理的玻璃器皿，或用第一次配制的胶体金稳定的玻璃器皿，再用双馏水冲洗后使用。否则影响生物大分子与金颗粒结合和活化后金颗粒的稳定性，不能获得预期大小的金颗粒。（2）试剂配制必须保持严格的纯净，所有试剂都必须使用双馏水或三馏水并去离子后配制，或者在临用前将配好的试剂
5、经超滤或微孔滤膜（0.45m）过滤，以除去其中的聚合物和其它可能混入的杂质。（3）配制胶体金溶液的 pH 以中性（pH7.2 ）较好。（4）氯金酸的质量要求上乘，杂质少。最好是进口的。（5）氯金酸配成 1水溶液在 4可保持数月稳定，由于氯金酸易潮解，因此在配制时，最好将整个小包装一次性溶解。（三） 胶体金标记蛋白的制备 胶体金对蛋白的吸附主要取决于 pH 值，在接近蛋白质的等电点或偏碱的条件下，二者容易形成牢固的结合物。如果胶体金的 pH 值低于蛋白质的等电点时，则会聚集而失去结合能力。除此以外胶体金颗粒的大小、离子强度、蛋白质的分子量等都影响胶体金与蛋白质的结合。1待标记蛋白溶液的制备 将待
6、标记蛋白预先对 0.005Mol/L pH7.0 NaCl 溶A 液 B 液金粒直径（nm） 1HAuCl4双馏水 1枸橼酸三 钠 0.1Mol/L K2CO31鞣酸 双馏水5 1 79 4 0.20 0.70 15.1010 1 79 4 0.025 0.10 15.87515 1 79 4 0.0025 0.01 15.9875 3 液中 4透析过夜，以除去多余的盐离子，然后 100 000g4离心 1h，去除聚合物。2待标胶体金溶液的准备 以 0.1Mol/L K2CO3 或 0.1Mol/L HCl 调胶体金液的 pH 值。标记 IgG 时，调至 9.0；标记 McAb 时,调至 8.
7、2；标记亲和层析抗体时，调至 7.6；标记 SPA 时，调至 5.96.2；标记 ConA 时，调至 8.0；标记亲和素时，调至 910。由于胶体金溶液可能损坏 pH 计的电板，因此，在调节 pH 时，采用精密 pH试纸测定为宜。3胶体金与标记蛋白用量之比的确定（1）根据待标记蛋白的要求，将胶体金调好 pH 之后，分装 10 管，每管1ml。（2）将标记蛋白（以 IgG 为例）以 0.005Mol/L pH9.0 硼酸盐缓冲液做系列稀释为 5g/ml50g/ml，分别取 1ml，加入上列金胶溶液中，混匀。对照管只加1ml 稀释液。（3）5min 后，在上述各管中加入 0.1ml 10NaCl
8、溶液，混匀后静置 2h，观察结果。（4）结果观察，对照管（未加蛋白质）和加入蛋白质的量不足以稳定胶体金的各管，均呈现出由红变蓝的聚沉现象；而加入蛋白量达到或超过最低稳定量的各管仍保持红色不变。以稳定 1ml 胶体金溶液红色不变的最低蛋白质用量，即为该标记蛋白质的最低用量，在实际工作中，可适当增加 1020。4胶体金与蛋白质（IgG）的结合 将胶体金和 IgG 溶液分别以 0.1Mol/L K2CO3 调 pH 至 9.0，电磁搅拌 IgG 溶液，加入胶体金溶液，继续搅拌 10min，加入一定量的稳定剂以防止抗体蛋白与胶体金聚合发生沉淀。常用稳定剂是 5胎牛血清（BSA ）和 1聚乙二醇（分子量
9、 20KD） 。加入的量： 5BSA 使溶液终浓度为 1；1聚乙二醇加至总溶液的 110。5胶体金标记蛋白的纯化（1）超速离心法：根据胶体金颗粒的大小，标记蛋白的种类及稳定剂的不同选用不同的离心速度和离心时间。用 BSA 做稳定剂的胶体金 羊抗兔 IgG 结合物可先低速离心（20nm 金胶粒用 1 200r/min，5nm 金胶粒用 1 800r/min）20min，弃去凝聚的沉淀。然后将 5nm胶体金结合物用 6 000g，4离心 1h；20nm40nm 胶体金结合物， 14 000g，4离心 1h。仔细吸出上清，沉淀物用含 1BSA 的 PB 液（含 0.02NaN 3） ，将沉淀重悬为原
10、体积的 110，4保存。如在结合物内加 50甘油可贮存于-18保存一年以上。 4 为了得到颗粒均一的免疫金试剂，可将上述初步纯化的结合物再进一步用1030蔗糖或甘油进行密度梯度离心,分带收集不同梯度的胶体金与蛋白的结合物。（2）凝胶过滤法：此法只适用于以 BSA 作稳定剂的胶体金蛋白结合物的纯化。将胶体金蛋白结合物装入透析袋，在硅胶中脱水浓缩至原体积的15110。再经 1 500r/min 离心 20min。取上清加至 Sephacryl S-400（丙烯葡聚糖凝胶 S-400）层析柱分别纯化。层析柱为 0.8 cm20cm，加样量为床体积的110，以 0.02Mol/L PBS 液洗脱（内含
11、 0.1BSA ，0.05 NaN 3，pH8.2 者用 IgG标记物） ，流速为 8ml/h。按红色深浅分管收集洗脱液。一般先滤出的液体为微黄色，有时略混浊，内含大颗粒聚合物等杂质。继之为纯化的胶体金蛋白结合物，随浓度的增加而红色逐渐加深，清亮透明，最后洗脱出略带黄色的为标记的蛋白组分。将纯化的胶体金蛋白结合物过滤除菌、分装,4保存。最终可得到7080的产量。6胶体金蛋白结合物的质量鉴定（1）胶体金颗粒平均直径的测量：用支持膜的镍网（铜网也可）蘸取金标蛋白试剂，自然干燥后直接在透射电镜下观察。或用醋酸铀复染后观察。计算 100个金颗粒的平均直径。（2）胶体金溶液的 OD520nm 值测定：胶
12、体金颗粒在波长 510nm550nm 之间出现最大吸收值峰。用 0.02Mol/L pH8.2 PBS 液（含 1BSA，0.02NaN 3）将胶体金蛋白试剂作 120 稀释，OD 5200.25 左右。一般应用液的 OD520 应为0.20.4。（3）金标记蛋白的特异性与敏感性测定：采用微孔滤膜免疫金银染色法（MF IGSSA） 。将可溶性抗原（或抗体）吸附于载体上（滤纸、硝酸纤维膜、微孔滤膜） ，用胶体金标记的抗体（或抗原）以直接或间接染色法并经银显影来检测相应的抗原或抗体，对金标记蛋白的特异性和敏感性进行鉴定。（四） 胶体金标记技术在免疫学中的应用 胶体金标记技术由于标记物的制备简便，方
13、法敏感、特异，不需要使用放射性同位素，或有潜在致癌物质的酶显色底物，也不要荧光显微镜，它的应用范围广，除应用于光镜或电镜的免疫组化法外，更广泛地应用于各种液相免疫测定和固相免疫分析以及流式细胞术等。1液相免疫测定：将胶体金与抗体结合，建立微量凝集试验检测相应的抗原，如间接血凝一样，用肉眼可直接观察到凝集颗粒。利用免疫学反应时金颗粒凝聚导致颜色减退的原理，建立均相溶胶颗粒免疫测定法（Sol particle immunoassay ,SPIA）已成功地应用于 PCG 的检测，直接应用分光光度计进行定量分析。 5 2金标记流式细胞术：胶体金可以明显改变红色激光的散射角，利用胶体金标记的羊抗鼠 Ig
14、 抗体应用于流式细胞术，分析不同类型细胞的表面抗原，结果胶体金标记的细胞在波长 632nm 时，90 度散射角可放大 10 倍以上，同时不影响细胞活性。而且与荧光素共同标记，彼此互不干扰。3胶体金固相免疫测定法（1）斑点免疫金银染色法（DotIGSIGSS ）是将斑点 ELISA 与免疫胶体金结合起来的一种方法。将蛋白质抗原直接点样在硝酸纤维膜上，与特异性抗体反应后，再滴加胶体金标记的第二抗体，结果在抗原抗体反应处发生金颗粒聚集，形成肉眼可见的红色斑点，此称为斑点免疫金染色法（DotIGS） 。此反应可通过银显影液增强，即斑点金银染色法（DotIGSIGSS ） 。（2）斑点金免疫渗滤测定法（
15、dot immunogold filtration assay,DIGFA）此法原理完全同斑点免疫金染色法，只是在硝酸纤维膜下垫有吸水性强的垫料，即为渗滤装置。在加抗原（抗体）后，迅速加抗体（抗原） ，再加金标记第二抗体，由于有渗滤装置，反应很快，在数分钟内即可显出颜色反应。此方法已成功地应用于人的免疫缺陷病病毒（HIV）的检查和人血清中甲胎蛋白的检测。二、 DotIGSS 检测牛结核血清抗体（一）材料与试剂1抗原 牛结核 PPD。2血清 待检血清、标准结核阳性血清和结核阴性血清。3硝酸纤维膜 孔径 0.45m。4氯化金（优质）50.2Mol/L PB 液60.05Mol/L TrisHCl
16、缓冲液7硝酸银显影液（现用现配）明胶（20g/L） 6.00ml对苯二酚（57.90g/L） 3.00ml硝酸银（25g/L） 0.20mlpH3.5 柠檬酸盐缓冲液 1.00ml对苯二酚和硝酸银溶液需避光保存，临用前将明胶加热溶解后，按上述比例 6 依次混合。pH3.5 柠檬酸盐缓冲液的配制：柠檬酸（C 6H8O7H2O） 25.50g柠檬酸三钠（C 6H5Na32H2O） 3.50g去离子水 加至 100.00ml溶解后即可使用。8定影液硫代硫酸钠（Na 2S2O3） 20.0g去离子水 加至 100.00ml溶解即可。9兔抗牛 IgG 抗体。（二）操作方法1胶体金的制备 试验用水均要求三
17、蒸馏水并过去离子柱，最终去离子水的电阻大于 100 万 。所有容器最终均用去离子水清洗。（1）采用鞣酸枸橼酸钠还原法制备A 液 1HAuCl 4 2.00ml去离子水 158.00mlB 液 1枸橼酸钠 8.00ml0.1Mol/L K 2CO3 0.20ml1鞣酸 0.20ml去离子水 31.60ml将 A 液和 B 液分别于 60水浴 30min，并不时搅拌，迅速将 B 液加入至 A液中，搅拌，颜色为深蓝色，继续加热至 100，5 min 10min，溶液颜色变为深红色，自然冷却后 4保存。（2）胶体金鉴定：外观呈深红色、晶莹透亮，迎着日光可见有光带。电镜观察胶体金粒子大小平均为 10nm
18、，颗粒大小一致，分布均匀。2胶体金与兔抗牛 IgG 用量比例的确定 每 ml 胶体金所需的最低稳定蛋白量是 30g，根据试剂用量增加 20，所以每 ml 胶体金所需的最低稳定兔抗牛IgG 量为 36g。3金标记兔抗牛 IgG 的制备 取所需量的兔抗牛 IgG，加入少许去离子水，用 0.1Mol/L K2CO3 溶液调 pH 值为 9.0（用精密 pH 试纸测定） ，同时胶体金溶液的 pH 值也调至 9.0。在磁力搅拌下，将 20ml 胶体金溶液加入至兔抗牛 IgG 中，继续搅拌 10min，加入 3.5ml 3的聚乙二醇（分子量 20 000）作为稳定剂，以使其最终浓度达到 0.05，再搅拌
19、15min 后，置 4冰箱保存备用。 7 4金标兔抗牛 IgG 的纯化 将金标记的兔抗牛 IgG 以 2 500r/min 离心15min，以除去胶体金的聚合物，取上清以 65 000g 离心 1h，可见离心物分为三层，上层为淡黄色，含有未结合的兔抗牛 IgG，下层为近黑色，是尚未结合的胶体金颗粒,最主要的中间层为红色，是结合良好的金标记的兔抗牛 IgG，倾去上层，收集中层液，用含 0.1BSA 的 0.01Mol/L pH8.2PB 混合至原体积的 110，过滤除菌，分装，4保存备用。5金标记兔抗牛 IgG 的鉴定（1）颗粒大小及均匀度鉴定：取少许金标记的兔抗牛 IgG，负染，电镜观察颗粒大
20、小及均匀度，并测量粒子直径大小。（2）活性鉴定：将牛 IgG 点样于硝酸纤维膜上，直接加金标兔抗牛 IgG 抗体，应显示出明显的粉红色斑点。6正式试验程序（1）点样 以打孔器将微孔滤膜制成直径 3mm 的膜片。将牛结核 PPD 用0.01Mol/LpH9.0PBS 液稀释为 40g/ml，用微量加样器加 1l 抗原于膜片中央，37烘干 10min。（2）封闭 将膜片置于 0.01Mol/L pH7.4 含 0.2BSA 的 PBST 液中，37作用 45min，其间振荡数次。取出后以蒸馏水洗涤 1 次，用滤纸吸干。（3）加待检血清 待检血清以 PBST 液做 1160 倍稀释。将膜片浸入其中，
21、37作用 1h，其间振荡数次。取出后，以 PBST 液洗涤后，滤纸吸干。此步同时设标准阳性血清和阴性血清对照。（4）加金标抗体 以 PBST 液将金标液作 110 稀释，将膜片浸入其中，37作用 2h，中间振荡数次。（5）银染 将膜片从金标液中取出，于去离子水洗涤 3 次，每次 3min。然后将膜片浸入暗室中的银染色液中，室温下作用 10min，移入定影液中，室温作用 5min。然后用去离子水冲洗，自然干燥后观察结果。（三）结果判定： ：呈棕褐色或黑色斑点，着色深，均匀一致，与背景反差大。 ：着色较深或着色很深，但背景色也较深。 ： 着色淡，或着色较深，但有背景色。 ： 没有着色，或与背景色没有反差。出现“+”以上，判为阳性结果，否则判为阴性结果。
