1、Western Transfer and Immunostaining生物化學實驗 S2-1S2 免疫轉印法莊 榮 輝膠體電泳 可以把蛋白質依照分子量大小分開，若膠體內的蛋白質色帶能轉印到尼龍膜，則這些蛋白質可繼續以其專一性抗體來偵測，成為更強大的解析工具。2.1 背景知識膠體電泳的原理與前面 P3 實驗完全一樣，而蛋白質轉印也是相同的機制，只是轉個方向，把膠片上的色帶印到尼龍膜。2.1.1 蛋白質轉印膠體電泳的解析力雖然很高，可以把複雜的蛋白質混合物分離開來，但是不能方便地鑑別這些色帶的身分；原因之一，是因為膠體本身易脆，不容易進一步操作，因此要先把這些色帶轉移到尼龍薄膜上，再繼續以其它方法
2、檢定之；而最常用的方法，便是以抗體對尼龍膜上的蛋白質色帶進行免疫偵測。圖 S2-1 蛋白質轉印及免疫染色的原理機制B三 三三三ComasieBluSting三三PonceauStig三三三三三三三A三三三+Filter Papr-GelNitroclus三三三三 E免疫轉印法 S2S2-2 Biochemistry Laboratory早期蛋白質轉印法是使用 硝化纖維紙 (nitrocellulose)，蛋白質可吸附在紙上的硝基，不易脫落。後來改用尼龍材質的薄膜 (如 PVDF)，上面有各種修飾基團，可強力地吸引住蛋白質，但降低非專一性的吸附，使結果更為可靠。轉印膜在轉印後的空白部份，通常都要
3、以無關的蛋白質覆蓋起來，以免後面操作所用到的抗體等物質，吸附到轉印膜上去。通常都使用脫脂奶粉，我們則比較常用明膠，隨人喜好而定。轉印時，要小心分子量較小的蛋白質，可能會穿過轉印膜而損失；可在轉印緩衝液中添加甲醇 (1030%)，以增加轉印膜對蛋白質的吸附力量。反之，也有商品標榜在一次轉印後，可以同時印出十張相同的轉印膜，減少膠片消耗與轉印時間；這在蛋白質體學的應用上，有相當大的吸引力，因為同一張二次元電泳的轉印膜，可能要進行很多種不同的偵測反應，因此需要很多張相同的轉印膜。另外，注意有些在轉印以後要分離色點，然後進行胺基酸定序，若是使用Edman degradation 反應的定序儀，則轉印緩
4、衝液中避免使用帶有-NH 2 基團的成份 (如 Tris, Gly)，以免干擾 Edman degradation。有時候，可以把酵素轉印到膜上，然後直接在上面進行催化反應，若能產生不溶性的生成物，原地凝集在轉印膜上，則可做為酵素的檢定之用。例如磷酸脢 (phosphatase) 或過氧化氫脢 (peroxidase)，都可直接在轉印後呈色。當然，若使用 SDS 膠體電泳，則必須在轉印後，使酵素充分回復原態及活性。2.1.2 免疫染色膠體電泳的高解析力，加上抗體的高專一性，結合成為一個極為強大的分析工具。因此，一直到目前，電泳轉印加上免疫染色的流程，都是所有生物科技相關實驗室所必備。一次抗體有
5、時可以買到商品，但通常都極為昂貴；較不常見的抗原，則必須自行製備抗體，那就要先準備好純質抗原。 抗原與佐劑 (adjuvant) 混合成乳劑後，進行動物免疫，通常使用大白兔或小白鼠。每兩週免疫一次，如此進行追加免疫約四到六次，試採血檢測血清效價，若血清稀釋 1,000 到 10,000 倍，仍然可在轉印膜上染出抗原的色帶，則免疫可謂成功，即可進行採血，製得抗血清，其中即含有所要的專一性抗體。專一性抗體會像巡弋飛彈一樣，自動去找出抗原色帶，並且與此色帶緊密結合，然後再利用 二次抗體 (即第一次所用抗體的抗體，可以買到 ) 與上述抗體結合。 圖 S2-2 說明此一設計，抗體上面標有 2 者即為二次
6、抗體，後面連結著標誌酵素 (E)；標誌酵素多使用上述的磷酸脢或者過氧化氫脢，兩者在加入基質後，都可生成具有強烈呈色的沈澱。免疫轉印法 S2生物化學實驗 S2-3使用二次抗體與酵素的連結體，雖然增多一次操作動作，但也提升了整個反應的專一性，因為多加一次專一性篩選步驟，而且自由的一次抗體效價較高。同時也較方便，因為各種一次抗體都可直接使用，然後用二次抗體與酵素連結體即可，不須各種一次抗體都得去做酵素標誌。2.1.3 實驗大綱本實驗分成三個部份(1) SDS-PAGE 膠體電泳、(2) 蛋白質轉印、(3) 免疫染色。樣本為前面實驗的 trypsin 及胰臟抽取液，並使用 CHOM 為負對照組，然後以
7、抗 trypsin 的抗體為探針，進行專一性的偵測。圖 S2-3 蛋白質轉印及免疫染色操作流程E2圖 S2-2 免疫染色的設計轉印膜不相關蛋白質一次抗體二次抗體酵素連結免疫轉印法 S2S2-4 Biochemistry Laboratory2.2 膠體電泳兩組鑄造兩片平板 SDS 電泳膠片，分別進行各組 trypsin 樣本的分析，接著並進行蛋白質轉印，則請依照下節 2.3 實驗步驟操作。2.2.1 儀器用具a) 鑄膠套件 (含電泳玻片及氧化鋁片)。b) 間隔條 (spacer, 0.75 mm) 及樣本梳 (comb, 10 well)。c) 垂直迷你電泳槽 (Hoefer SE-250 平
8、板式垂直電泳槽)。d) 電源供應器 (Pharmacia Biotech EPS 200)。e) 微量針管 (Hamilton 80465) 或電泳樣本專用吸管頭。f) 染色脫色方盒。2.2.2 藥品試劑所用藥品與原態電泳類似，但是多了 (e) SDS 及 (f) 樣本溶液，整個系統都要加入 SDS；同時有標準分子量的蛋白質 (k)，可供比對樣本的分子量。a) A 液 (T 30%, C 2.6%)： 注意！本溶液有毒性！丙烯醯胺溶液 acrylamide 14.6 gBis (N,N-methylene-bis-acrylamide) 0.4 g加水至 50 mL，若難溶則稍微加熱助溶之，儲
9、存於 4。b) B 液 (分離膠體緩衝液)：Tris 18.2 gTEMED (N,N,N,N-tetramethyl-ethylenediamine) 0.36 mL用 60 mL 水溶解後，以 HCl 調 pH 至 8.8 後加水至 100 mL，儲存於 4。c) C 液 (焦集膠體緩衝液)：Tris 0.6 gTEMED 40 L用 8 mL 水溶解後，以 HCl 調 pH 至 6.8 後加水至 10 mL，儲存於 4。d) 通用電泳緩衝液 (5)：Tris 90 mM5 54.5 gEDTA2Na 2.5 mM5 4.7 gBoric acid 80 mM5 24.8 g加水 800
10、mL 溶解，以 NaOH 調 pH 至 8.4 後，加水至 1000 mL，室溫保存。使用前要以蒸餾水稀釋五倍，並且加 SDS 成為 0.1%。e) APS 溶液 (ammonium persulfate, 10%)：免疫轉印法 S2生物化學實驗 S2-5取 0.1 g 溶於 1 mL 水，要確實溶解完全；使用前新鮮配置，過夜者不再用。f) 10% SDS 水溶液。g) 異丙醇。h) SDS 樣本溶液 (2)：Tris (250 mM) 0.3 gEDTA2Na (4 mM) 14.9 mgSDS (4%) 0.4 g-Mercaptoethanol (10%) 1 mL加二次水 8 mL 溶
11、解，調 pH 至 6.8 之後，再加水至 10 mL。i) 追蹤染料：Bromophenol Blue (BPB) 1 mg 加 5 mL 水及 5 mL 甘油。j) CBR 染色液：Coomassie Brilliant Blue R-250 1.5 g 加 250 mL 水後再加 250 mL甲醇及 50 mL 醋酸，過濾去掉不溶物，置於排煙櫃中公用。要回收。k) 脫色液：甲醇 (20%) 及醋酸 (10%) 的水溶液，置於排煙櫃中公用。l) 標準蛋白質組合：預先染色之低分子量標準 (Novex SeeBlue Pre-stained Standard)Protein Molecular
12、mass (D)Myosin 250,000Bovine serum albumin 98,000Glutamate dehydrogenase 64,000Alcohol dehydrogenase 50,000Carbonic anhydrase 36,000Myoglobin 30,000Lysozyme 16,000Aprotinin 6,000Insulin B chain 4,0002.2.3 鑄膠 (SDS-PAGE)表 S2-1 各種膠體溶液的濃度 (單位 mL)分離膠体 7.5% 10.0% 12.5% 15.0% 焦集膠體 4%A 液 2.5 3.4 4.2 5.0 A 液
13、 0.7B 液 2.5 2.5 2.5 2.5 C 液 1.3水 4.8 3.9 3.1 2.3 水 2.810% SDS 0.1 0.1 0.1 0.1 10% SDS 0.1APS 0.1 0.1 0.1 0.1 APS 0.1Total 10.0 10.0 10.0 10.0 Total 5.0免疫轉印法 S2S2-6 Biochemistry Laboratory分離膠體每支約需 23 mL，故一組配製 10 mL 即可。1) 將電泳玻片及氧化鋁片清洗淨後擦乾，再以玻璃清潔劑擦拭乾淨，選擇所需厚度間隔條 (spacer) 組裝於鑄膠套件，本課程由助教事先準備架好。2) 依照表 S2-1
14、 所列的各溶液比例，選擇所需的分離膠體濃度，本次實驗使用 12.5% 膠體。配置膠體溶液時，其中 APS 溶液必須最後加入，小心混合均勻，以避免氣泡產生，然後以微量吸管小心注入鑄膠套件。3) 膠體約佔玻片的 2/3 至 3/4 高度，加完後儘快在膠體液面上方小心加入 100 L異丙醇，以壓平膠體液面。4) 約 30 min 至 1 h 後 (天冷須更久)，凝膠完成，倒出上層的異丙醇。5) 配製焦集膠體溶液，先準備好所需之樣本梳 (comb)，加入溶液後立刻插入，整個過程必須在 5 min 完成，約 30 min 可完成凝膠。6) 拆下膠片並清理，將多餘的凝膠去除，鑄好的膠片可置封口袋中於 4保
15、存，但要加入少量蒸餾水防止膠片乾裂，使用期限約兩週。一組使用一片。2.2.4 電泳1) 若膠片是在 4中保存，須先取出回復室溫。同時將稀釋成一倍的 SDS 通用電泳緩衝液，倒入電泳槽底部。然後把膠片以 45 度架到電泳槽上，避免附著氣泡；當電泳夾夾妥後，在電泳玻片組合的上方槽內，加入 SDS 電泳緩衝液。M T T C P P C T T M圖 S2-4 添加樣本的配置方式T 為 trypsin (可能有不同動物來源的樣本)， C 為 CHOM，P 為胰臟抽取液， M 為標準蛋白質。跑完電泳後由中央切開，右上角各切角做記號 (箭頭虛線)；一半進行 CBR 染色，另一半則馬上進行轉印，請接續 2
16、.3 免疫轉印法。免疫轉印法 S2生物化學實驗 S2-7 膠片一定要等回復室溫後才能架到電泳槽，否則玻片會因熱漲而撐破。2) 電泳前先以微量針管清洗各樣本槽，避免有凝膠不完全的殘餘物留在槽內。3) 樣本處理：取 trypsin 樣本 20 L，因其中含甲酸溶液，先加入 2 L 1 N NaOH中和之，再加入 20 L SDS 樣本溶液，及 20 L 追蹤染料 BPB 均勻混合，在沸水浴煮沸 10 min 後放冷。 CHOM 取 20 L 如法處理，但不須中和。請在鑄膠的空檔時，處理好樣本。4) 取適量的樣本 (約 1015 L)，依圖 S2-4 配置，以微量針管小心注入樣本槽，避免氣泡陷入。另
17、外，也注入標準蛋白質 (M) 5 L，作為分子量之參考。5) 蓋上電泳槽的蓋子，確認正負電極裝置正確 (由負極往正極跑)，連接上電源供應器，定電壓以 100150 V 進行電泳。6) 在電泳過程中，特別觀察標準蛋白質中各個色帶的泳動情形。6) 待追蹤染料跑出膠片後，關掉電源，取出膠片，並將膠體平均切成兩半，各以解剖刀截去右上角做記號7) 一半進行蛋白質染色，另一半馬上浸入轉印緩衝液平衡 2030 min，繼續進行轉印，參考下節 2.3 步驟。2.2.4 染色及脫色1) 將電泳膠片浸入 CBR 染色液中，染色液用量只要覆蓋過膠片即可，一定要蓋上蓋子，置於平台震盪器上搖盪 30 min。2) 倒出
18、染色液，用自來水沖洗後加入 脫色液，脫色液也一樣蓋過膠片即可；約 10 min 可換新脫色液，一直重複到背景呈現透明為止。3) 若蛋白質濃度較低，染色時間可加長 (1 h) 以增加色帶深度。4) 脫色完成的膠片，可以用玻璃紙三明治乾燥之，經護貝後可永久保存。2.3 蛋白質轉印 首先以迷你平板膠體電泳對樣本蛋白質進行分離，然後轉印到尼龍膜上去。2.3.1 儀器設備a) 平板迷你電泳槽 (Hoefer, Mighty Small SE-250) 及所有附件。b) 電泳轉印槽 (Hoefer, TE-22) 及海綿、卡夾各兩片。c) 電源供應器 (可達 500 mA)。d) 震盪器及塑膠染色方皿。免
19、疫轉印法 S2S2-8 Biochemistry Laboratory2.3.2 藥品試劑a) SDS-PAGE 膠體，由電泳實驗所得之一半 SDS-PAGE 膠片。b) 轉印膜 (Millipore Immobilon, PVDF)、甲醇少許。c) 濾紙 (Whatman 3 mm) 兩張。d) 轉印緩衝液 (blotting buffer, 10)：Tris 30.3 gGlycine 144 g加水至 800 mL，pH 調至 8.3 後，加水至 1,000 mL。 SDS-PAGE 轉印時，轉印緩衝液中須加有 10% (v/v) 甲醇。 e) PBST (PBS 加 0.05% Twe
20、en)f) Urea-PBST：Urea (6 M) 36 g加入 PBST 加熱溶解後，以 PBST 添加至 100 mL。2.3.3 實驗步驟：蛋白質轉印1) SDS-PAGE 電泳膠片接續 2.2 節電泳，其中一半進行 CBR 染色，另一半則保留在本實驗作為轉印之用，電泳後切半馬上浸入轉印緩衝液平衡 15 min。2) 轉印膜 PVDF 要裁得比膠片稍大，因膠片平衡後體積會略膨漲。PVDF 為疏水性，必須先以 100% 甲醇短暫溼潤後，再浸入轉印緩衝液 (1) 中備用。3) 取兩張稍大的濾紙，於轉印緩衝液中浸潤備用。取出轉印卡夾，先墊一張多孔性海綿，鋪上一張濾紙，再小心鋪上膠片，勿陷入任
21、何氣泡，鋪上轉印膜，再蓋上一層濾紙及海綿，再把整個三明治卡夾裝好。可參考圖 S2-1 的組合。4) 置入已裝有轉印緩衝液 (1) 的轉印槽中，注意 PVDF 那面朝正極，膠片面朝負極。儘量除去附在卡夾外面的氣泡，氣泡的存在將使轉印效率變差。5) 於 4中以 400 mA 進行轉印，轉印槽 內要加以攪拌，以免溫度過高或不均，轉印 60 min 後中止。6) 取出轉印膜，浸在尿素 (urea-PBST) 中過夜，次日換成 PBST，等到次週繼續免疫染色；尿素可洗去蛋白質分子上的 SDS，同時可將一部份蛋白質分子恢復成原態，以增加抗體的確認機率。7) 在電泳樣本中若含有 pre-stained 標準
22、蛋白質，則可作為轉印效率之參考。免疫轉印法 S2生物化學實驗 S2-92.4 免疫染色 轉印膜上的蛋白質繼續用抗體偵測，首先用一次抗體去結合抗原色帶，再加入二次抗體與酵素的結合體，最後抗原色帶將會被標上酵素，以酵素反應呈色之。2.4.1 儀器設備a) 平台震盪器。2.4.2 藥品試劑a) 明膠-NET：Gelatin 0.25% 2.5 gNaCl 0.15 M 8.75 gEDTA2Na 5 mM 1.8 gTween 20 0.05% 0.5 mLTris 50 mM 6.05 g加水 800 mL 並加熱至明膠溶解，調 pH 至 8.0，再加水至 1,000 mL。b) 一次抗體： (小
23、白鼠抗豬的 trypsin 抗體)通常要免疫大白兔或小白鼠以製備一次抗體，一般抗體的使用濃度在 1 : 1,000至 1 : 5,000 之間，視抗體效價而定，使用前以上述明膠-NET 稀釋之。 c) 二次抗體-HRP 連結體：通常都可以購得上述一次抗體的二次抗體，並且連結有標誌酵素 (horse radish peroxidase, HRP) 或標誌物 (如螢光物或 biotin)；其使用濃度請依照廠商建議，也稀釋在明膠-NET 中。d) HRP 呈色劑 DAB：Diaminobenzidine (DAB) 5 mgH2O2 30% 10 L用 100 mL PBS 溶解，必須新鮮製備，不可
24、放過夜；DAB 是致癌物質。e) HRP 螢光呈色劑：SuperSignal West Pico Substrate (Pierce)Luminol solution (含 enhancer) 0.5 mLPeroxide solution 0.5 mL上面兩種溶液以 1:1 混合後立刻使用，一整張轉印紙約需 1 mL。2.4.3 實驗步驟：1) 尿素洗過的轉印紙再以 15 mL PBST 洗兩次，每次 5 min。2) 加入 15 mL 一次抗體 (適當濃度溶於明膠-NET 中)，室溫下反應 1 h。免疫轉印法 S2S2-10 Biochemistry Laboratory 一般抗體的使用濃
25、度是在 1:1,000 至 1:5,000 之間，視抗體效價而定。3) 以 15 mL PBST 洗 3 次，每次約 10 min。4) 加入 15 mL 二次抗體-HRP 連結體，室溫下反應 1 h。5) 以 15 mL PBST 洗 3 次，每次約 10 min。6) 倒入 HRP 呈色劑 DAB 15 mL，褐色色帶應很快出現。7) 呈色約在 15 min 內完成，應當在背景開始加深前中止呈色。8) 倒去呈色液，並以蒸餾水清洗數次，取出晾乾後避光保存。 若使用螢光染色劑，則上面 6) 改加入 1 mL SuperSignal 呈色劑，並在螢光掃描儀中顯像至清晰色帶出現，弱一點的色帶，可能要呈色 10 min 以上。2.5 結果與報告a) 請以掃描或拍照記錄免疫染色結果，注意有幾條色帶呈現。b)免疫染色圖譜請與 CBR 染色結果詳細比對。c) 由結果可推論所用抗體的專一性如何。2.6 參考文獻莊榮輝 主編 (2000) 酵素化學實驗。台灣大學農化系。頁 155, 205, 217Nelson DL, Cox MM (2005) Lehninger Principles of Biochemistry (4th ed) p.180-182Roitt I, Brostoff J, Male D (2001) Immunology (6th ed) Chap. 4, 27
