1、石蜡切片免疫组化步骤1.石蜡切片放置在 60恒温箱中烘烤 120分钟。2.脱蜡和水化：二甲苯(20min)二甲苯(20min)无水乙醇(10min)95%乙醇(10min)90乙醇(10min)80%(10min)4.抗原修复：柠檬酸钠缓冲液 95度，10 分钟. (枸橼酸三钠 3g枸橼酸 0.4g 然后加水到 950 毫升左右，然后用 NaOH 或 HCI 调 pH 值 6.0，最后定容在 1000ml)5. PBS浸洗 2次各 5min6.加 3%H2O2孵育 5min(室温或 37度，避光)。肝组织过氧化物酶含量高。需增加浓度或增长时间。蒸馏水洗 2minx3次8.pbs-曲拉通通透（p
2、v 法不需要）9.与二抗种属一致的血清封闭非特异位点。（pv 法不需要）9.滴加一抗 4过夜10.PBS浸洗 3次各 5min11.滴加二抗室温或 37孵育 30min12.PBS洗 3次各 5min15.DAB显色 520min，自来水充分涮洗16.苏木素复染 23min，自来水充分涮洗17.氨水反蓝，过蓝可用盐酸酒精分化 2s，自来水充分涮洗. 用稀氨水返蓝，自来水里加几滴稀氨水，就行了，返蓝时间 5 分钟左右，就很好看了 ;淡氨水有人用 50ml 自来水三四滴的氢氧化铵；18.脱水、透明 80%(5min)90%(5min)95%(5min)100%(5min) 100%(5min)二甲
3、苯(10min)二甲苯(10min)19.封片：中性树脂，加盖玻片(组织部位切勿残留小气泡)，自然晾干二、操作流程1、脱蜡和水化脱蜡前，应将组织芯片放在 60恒温箱中烘烤 2h 以上， 然后按以下流程进行：二甲苯（1h）、二甲苯（30min）、100%酒精（30min）、95% 酒精（15min）、70%酒精（15min）、50%酒精（15min）、蒸馏水（15min）2、3%H2O2，室温封闭 510 分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。3、甩去 H2O2，蒸馏水洗 2min3 次。4、抗原热修复：将切片置于装有抗原修复液的玻璃容器中（耐高温），进入微波炉内，容器内液体温度达到 95100后断
4、电，连续三次。5、PBS 冲洗 5min3 次。6、5%BSA 封闭液 20min，甩去。7、用 0.1mol/L PBS 稀释一抗 100 倍，滴加后 4过夜。8、 PBS 冲洗 2min3 次，滴加二抗 37 20min，PBS 冲洗 2min3 次，滴加 SABC 37 20min，PBS 冲洗 5min4 次，显色剂显色。9、自来水冲洗，封片，观察。注意：如果需要做双标记法，则在操作完步骤 8 后，重复步骤 38 即可. 评分法。通过在光学显微镜下对组织切片分别按染色程度（03 分为阴性着色、淡黄色、浅褐色、深褐色）、阳性范围进行评分（14 分为 025%、2650%、5175%、76
5、100% ），最终可以分数相加，再进行比较。1. 1、方法操纵不难，最大的易处是出现非常后果时怎样处理?这就需要把握免疫组化实行道理，每步晓得为何这样做，这样你才敢斗胆地变革先前的不合错误的方法步骤。如抗体孵育条件次要是抗体浓度、温度、时间，这三者通常为互相成反比的(相对)，此中浓度是最重要的先决条件，温度决定反应的速率、时间决定反应的量。就拿温度来讲，可以有 4度、室温、37 度，我保举 4度最好，反应最暖和，背景较浅；而 37度反应速度较快，时间较短；室温我不太倡导，除非你每次都把情况温度掌握在必然的范畴，不然，尽可能选择前两者。2、免疫组化最大的上风是定位和定性。比拟于其他蛋白检测方法，
6、免疫组化具有定性灵活度高、定位较直接正确，是定位检测分析尾选方法。特别对于有些因子的转位研究十分有效。3、免疫组化结果定量分析的条件是高质量的染色切片。免疫组化结果也能定量分析，但必须是背景染色浅而特异性染色较深的情况下，分析最为准确，这种原则可能也是我们平常审稿时鉴定研究结果的必备条件。4、免疫组化实验一定要设置阳性对照和阴性对照。阳性对比通常为用必定表达这种抗原的切片来做；阴性对照一般是用 PBS或非一抗替换一抗来进行反应，其他步骤均一致。前者是解除方法和实验体系有无问题；后者是扫除有无一抗外的非特异性染色。5、免疫组化的应用普遍，是当前实验研究的最重要方法之一。现在发 SCI论文时，显着
7、觉得仅靠量化的数据来发文章很难，加一些形态学数据或图片，老外十分接待，多是怕你学术造假吧。固然也不能做假阳性或假阴性结果。6、免疫组化技术掌握与否的审定尺度是同统统片或不同切片中不同抗原均从摸索浓度或条件而做出良好的染色切片。我在日常平凡带教中就发现很多研究生把我已经摸索很成生的反应条件、浓度、方法步骤，反复使用于同一性子的切片和同一种抗体，做出来后就感觉本人已经把握了免疫组化方法，调换一种抗体后，竟然连二抗的种属来源都拿错了。失利常常促进你去思测验验原理和过程，乐成有时也加速你自负。1、观点战经常使用办法先容1、界说用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某些化学成分的漫衍和含量进行组织和细
8、胞原位定性、定位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学(immunohistochemistry)技术或免疫细胞化学(immunocytochemistry)技术。2、原理按照抗原抗体反应和化学显色道理，组织切片或细胞标本中的抗本来和一抗结合，再操纵一抗与标识表记标帜生物素、荧光素等的二抗进行反应，前者再用符号辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(AKP)等的抗生物素(如链霉亲和素等)结合，最后通过呈色反应或荧光来显现细胞或组织中化学身分，在光学显微镜或荧鲜明微镜下可清楚瞥见细胞内产生的抗原抗体反应产品，从而可以在细胞爬片或组织切片上原位肯定某些化学成分的散布和含量。3、分类1)按标记物质的种类
9、，如荧光染料、放射性同位素、酶(主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶)、铁蛋白、胶体金等，可分为免疫荧光法、放射免疫法、免疫酶标法和免疫金银法等。2)按染色步骤可分为直接法(又称一步法)和间接法(二步、三步或多步法)。与直接法相比，间接法的灵敏度提高了许多。3)按结合方式可分为抗原-抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶(PAP)法；亲和毗连，如蛋白素-生物素-过氧化物酶复合物(ABC)法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶保持(SP)法等，个中SP法是比较常用的方法；聚合物链接，如即用型二步法，此方法尤其适合于内源性生物素含量高的组织抗原检测。4、现在几种常用免疫组化方法简朴引见1)免疫荧光方法是最早
10、成立的免疫组织化学技术。它哄骗抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下考察。当抗原抗体复合物中的荧光素受激起光的照耀后即会收回一定波长的荧光，从而可肯定组织中某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简洁，所以在临床病理诊断、查验中利用较广。2)免疫酶标方法免疫酶标方法是继免疫荧光后，于 60年月成长起来的技术。基来源根基理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后到场酶的底物，天生有色的不溶性产品或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞轮廓和细胞内的各类抗原成分进行定位研究。免疫酶标技术
11、是今朝最常用的技术。本方法与免疫荧光技术相比的主要长处是：定位精确，比照度好，染色标本可持久留存，合适于光、电镜研究等。免疫酶标方法的开展十分敏捷，已经衍生出了多种标记方法，且随着方法的精益求精和立异，其特异性和敏捷度都在不息提高，使用也愈来愈便当。今朝在病理诊断中广为使用的有 ABC法、SP 三步法、即用型二步法检测系统等。3)免疫胶体金技术免疫胶体金技术是以胶体金这样一种特别的金属颗粒作为标记物。胶体金是指金的水溶胶，它能疾速而不变地吸附蛋白，对蛋白的生物学活性则没有显著的影响。是以，用胶体金标记一抗、二抗或其他能特异性结合免疫球蛋白的分子(如葡萄球菌 A蛋白)等作为探针，就能对组织或细胞
12、内的抗原进行定性、定位，甚至定量研究。由于胶体金有不同巨细的颗粒，且胶体金的电子密度高，所以避免疫胶体金技术分外得当于免疫电镜的单标记或多标记定位研究。由于胶体金本身呈浓至深白色，因此也适合进行光镜窥察。如运用银加强的免疫金银法例更便于光镜视察。5、被检测的物资组织或细胞中但凡能作为抗原或半抗原，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。6、特性1)特异性强。免疫学的根本原理决定抗原与抗体之间的结合具有高度特异性，因此，免疫组化从理论上讲也是组织细胞中抗原的特定显示，如角蛋白(keratin)显示上皮成分，LCA 显示淋巴细胞成分。只有当
13、组织细胞中存在交叉抗原时，才会出现交叉反应。2)敏感性高。在利用免疫组化的肇端阶段，由于手艺上的限定，只有直接法、直接法等敏感性不高的手艺，当时的抗体只能稀释几倍、几十倍；而今因为 ABC法或 SP三步法的出现，使抗体稀释上千倍、上万倍乃至上亿倍仍可在组织细胞中与抗原结合，这样高敏感性的抗体抗原反应，使免疫组化方法愈来愈便利地运用于通例病理诊断事情。3)定位正确、形状与功用相结合。该技能通过抗原抗体反应及呈色反应，可在组织和细胞中进行抗原的精确定位，因此可同时对差别抗原在统一组织或细胞中进行定位调查，这样就能够进行形态与功效相结合的研究，对病理学范畴展开深切研究是非常成心义的。7、从蛋白程度检
14、测角度，免疫组化技术与 Western blotting、ELISA 的异同1)Western blotting：蛋白质免疫印迹，也是操纵抗体抗原反应原理，结合化学发光等技术来检查组织或细胞样品内蛋白含量的检测方法。与免疫组化技术相比，定量可能越发准确；当然Western blotting也可定性和定位(通过提取膜蛋白或核蛋白、胞浆蛋白离别检测其中抗原含量，进而间接反应它们的定位)，但敏感性远远低于免疫组化技术。2)ELISA：酶联免疫吸附实验，也是使用抗体-抗原-抗原结合反应原理来检查体液或组织匀浆中蛋白含量的检测。与免疫组化技术相比，定量最正确，是排泄性蛋白检测首选方法之一。实验流程简介1
15、、SP 三步法1)石蜡切片，常规脱蜡至水。2)0.3%或 3%H2O2去离子水(无色液体)孵育 10-30分钟，以灭活内源性过氧化物酶活性。3)蒸馏水冲洗，PBS 浸泡 5分钟4)候选步调：采取抗原建复：微波(发起 30分钟内 4次中水)、高压、酶修复要领。天然热却，再用 3分钟3 次.5)血清封闭：室温 15-30分钟，尽量与二抗来历分歧。倾往，勿洗。6)滴加适当比例稀释的一抗，37孵育 23小时或 4过夜(最好复温)。PBS 冲洗，3 分钟5 次。7)滴加生物素标志的二抗，室温或 37孵育 30分钟-1h。8)PBS冲洗，3 分钟5 次。9)滴加 SP(链霉亲和素-过氧化物酶)，室温或 3
16、7孵育 30分钟-1h。10)PBS冲洗，3 分钟5 次。11)显色剂显色(DAB 等)。12)自来水充裕冲洗。13)可进止复染，脱水，通明。14)选择适当的封片剂封片。2、即用型二步法1)脱蜡、水化组织切片。2)根据所应用的一抗的非凡要求，对组织切片进行预处置。3)0.3%或 3%H2O2去离子水孵育 5分钟-30 分钟，以阻断内源性过氧化物酶，PBS 或 TBS冲洗。4)滴加一抗，室温或 37孵育 3060分钟，或 4留宿，PBS 或TBS浸洗 3分钟5 次。5)滴加 enhangcer加强剂，37 度 30min，PBS 或 TBS浸洗 3分钟5次。6)滴加通用型 IgG抗体-Fab 段
17、-HRP 多聚体，室温/37孵育 30分钟-1h，PBS/TBS 冲洗，3 分钟5 次。7)应用 DAB溶液显色。8)蒸馏水冲洗、复染、脱水、透明、封片。3、免疫荧光技术(略)枢纽环节分解(较前有所更新)1、酶免疫组化的环节环节1)标本固定：固定的目的是防止标本从玻片上脱落；除去防碍抗原-抗体结合的类脂，使抗原抗体结合物易于取得杰出的染色结果；固定的标本易于保存。固定剂的选择一般用 4%多聚甲醛，但睾丸组织、眼可能要选用 Bouins液或 mDF液效果较好。2)脱水、石蜡包埋和制片：脱水用梯度乙醇(由低到高)充分脱水、对组织要完全浸蜡、切片时刀片要干净和厉害。否则，容易裂片和脱片等。3)脱蜡和
18、水化：这是为了前面的抗体等试剂可以或许充实与组织中抗原等结合反映。脱蜡可以先 60度 20min，然后当即二甲苯1-3别离 10min(这个时间是由二甲苯新颖水平和室温等综开决议的)，但当天造好的切片一般先 60度 3-4h。水化用梯度乙醇(由高到低)。若脱蜡和 shui化不全易出现局灶性回响反映和浸洗不齐，而产生非特异性后台着色。4)抗原修复：因为组织中部门抗原在甲醛或多散甲醛牢固进程中，发作了蛋白之间交联及醛基的封闭感化，从而落空抗原性；通过抗原修复，使得细胞内抗原决意族从头表露，进步抗原检测率。常用的修复方法从强到弱一般分为三种，高压修复、微波修复、胰酶修复。修复液也分为多少种(详细的可
19、以查阅相干材料，年夜量的：中性的、高 pH的等)。我们实行室一般用微波修复中火6min*4次，效果不错。留意微波修复后天然冷却 30min阁下(只要你感觉修复液的温度达室温便可)。5)细胞通透：目标是使抗体可以或许充分地进入胞内进行结合反应。一般用 Triton X-100、蛋白酶 k等通透液。如 Triton X-100可以消融细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂质而使抗体及大分子构造的物质进入胞浆和胞核内，故在细胞免疫组化时尤为保举使用，这样抗体就可以顺遂进入胞内与相应抗原结合。在免疫组织化学(10um 厚切片)和免疫细胞化学中一般用 Triton X-100作为细胞通透剂，在膜上打孔。同时也
20、是一种去污剂，一般在 PBS中插足后终浓度是 0.05%即可，而前者末浓度是 0.5%-1%。石蜡切片 4um左左可以欠亨透，因为细胞曾经被切开了。6)灭活内源性过氧化物酶和生物素：在传统的 ABC法和 SP法中，免疫组化反应结果容易支到内源性过氧化物酶和生物素的干扰，必须用过氧化氢和卵白素等进行灭活。灭活内源性 POD一般 3%过氧化氢灭活时间短点，可以 10min左右，而 0.3%过氧化氢则可以适当延长封闭时间，一般 1030min；用甲醇配置过氧化氢比双蒸水或 PBS可能好在回护抗原和固定组织作用，过氧化氢孵育时间过长易引起脱片；现用现配，配好后 4度避光保存。不过，目下当今已有“第二代
21、即用型免疫组化试剂盒“避免内源性生物素的干扰，引荐使用。7)血清封闭：组织切片上有盈余的位点可以与一抗非特异性结合，造成后绝结果的假阳性；封闭血清一般是和二抗同一来历的，血清中动物本身的抗体，预先能和组织中有交叉反应的位点发生结合；也能够用小牛血清、BSA、羊血清等，但不克不及与一抗来源一致。一般室温 10-30min。但也要防止封闭过分8)一抗和二抗浓度和孵育时间：一抗孵育条件在免疫组化反应中最重要，包罗孵育时间、温度和抗体浓度。一抗孵育温度有几种：4度、室温、37 度，其中 4度效果最佳；孵育时间：这与温度、抗体浓度有关，一般 37度 1-2h，而 4度过夜和从冰箱拿出后 37度复温 45
22、min。具体条件还要摸索。二抗孵育条件：二抗一般室温或 37度 30min-1h，具体时间需要摸索，而浓度一般有工作液，若是浓缩液还要摸索浓度。但在免疫组化中我们一般先把二抗浓度和孵育时间先定下，然后去摸索一抗浓度和孵育时间。建议一抗反应在 4度最佳，反应温文，但时间最好超过 1624h。9)抗体稀释液：其实许多实验室抗体稀释液就用一般 PBS即可，但专用的抗体稀释液中除 PBS成分外，还加了叠氮化钠防腐剂、BSA稳定剂等组份，反抗体的多次收受接管行使较好。正因为这种原因，我一向用国产的公用抗体稀释液，一段时间在更换新抗体稀释液时实验结果出现了阴性结果(提醒可能一抗没有结合)，最后从抗体浓度和
23、孵育时间、封闭时间等原因排除后，发现是新抗体稀释液的 PH值偏酸，而使抗原抗体反应不佳，终而出现假阴性结果。10)切片清洗(浸洗、冲洗和漂洗)：为了防止一抗、二抗等试剂残留而引起非特异性染色，以是适本地增强清洗(延长时间和增屡次数)尤其重要，我一般在一抗孵育前的洗濯是 3min*3次，而一抗孵育后的清洗均为 5次*5min。留意：单独冲洗，防止交叉反应造成污染。温顺冲洗，防止切片的脱落。我喜好用浸洗方法；冲洗的时间要充足，才气完全洗来结合的物资。PBS 的 PH和离子强度的运用和要供。这方面我有惨重教导，其时我买的抗体稀释液偏酸，成绩配景一片黄(未见特异性染色)，建议 PH在 7.4-7.6浓
24、度是0.01M。(中性及弱硷性条件(PH7-8)有益于免疫复合物的形成，而酸性条件则有利于剖析；低离子强度有利于免疫复合物的形成，而高离子强度则有利于合成)11)DAB显色：背景的深浅和特异性染色的深浅都可以由 DAB孵育条件决定。DAB 显色时间不是固定的，首要由显微镜下节制显色时间，到出现特异性染色较强而本底着色较浅时即可冲洗；DAB显色时间很短(如几秒或几十秒)就出现很深的棕褐色，这极可能说明你的抗体浓度太高或抗体孵育时间过长，需要下调抗体浓度或缩短你的抗体孵育时间；另外，若很短时间就出现背景很深，还有可能你前面的封闭非特异性蛋白不全，需要延长封闭时间；DAB显色时间很长(如跨越十几分钟
25、)才出现阳性染色，一方面可能说明你的抗体浓度太低或孵育时间太短(最好一抗 4度过夜)；另一方面就是封闭时间过长。12)复染：目的是形成细胞轮廓，从而更好地对目标蛋白进行定位，常常用苏木素复染(胞核染料)。注意苏木素复染时间要看当时的室温、溶液的新旧、目标抗原的定位等情况，一般数秒-数分钟，胞浆蛋白可以适事先间长一点，而胞核蛋白则要短。不过这个如果染色不睬想可以弥补的。方法是：染色深则分化时间稍长些即可；染色浅则再置于苏木素中染色即可。盐酸酒精是分化，氨水是返兰。作用不同。片子复染完后流水振洗，然后置于盐酸酒精中数秒(一定动作要快)后拿出流水振洗，在放入氨水中返兰即可。13)封片：为了历久保存，
26、我们一般用中性树胶等封片，避免产生机泡，方法是直接在载玻片组织上滴一滴封片液，然后一手拿住盖片某一拐角，而另一手拿对面的谁人拐角，接近封片液近真个拐角先降低，直至接触到液体时为止；当发现液体接触面在接续弥散时，则可以迟缓降低另一拐角，这样一般不会产生气泡。2、免疫荧光方法中的重要环节1)冰冻切片制备：建议用新陈组织，否则组织细胞内部布局粉碎，易使抗原弥散。选用洁净尖利的刀片、组织必定要冷冻适度等，防止裂片和脱片宽重。2)组织切片固定：切好片风干后立刻用冰丙酮等固定液进行固定5-10min，尤其要较长时间保存的白片，一定要实时固定和适当保存。3)血清封闭：为防止内源性非特异性蛋白抗原的结合，需要
27、在一抗孵育前先用血清(与二抗起原同等)封闭，削弱背景着色。血清封闭的时间是可以调整的，一般 10-30min。4)一抗孵育条件：在免疫组化反应中最重要，包孕孵育时间和抗体浓度。一抗孵育温度有几种：4 度、室温、37 度，个中 4度效果最佳；孵育时间：这与温度、抗体浓度有闭，一般 37度 1-2h，而 4度过夜和从冰箱拿出后 37度复温 45min。具体条件还要试探。5)二抗孵育条件：二抗一般室温或 37度 30min-1h，具体时间需要摸索，而浓度一般有工作液，如果稀释液还要摸索浓度，切纪要避光反应。但在免疫荧光中我们一般先把二抗浓度和孵育时间先定下，然后去摸索一抗浓度和孵育时间。最后，荧光素
28、标记的二抗跟着生存时间的延长，可能后有大量的游离荧光素残留，需要注重配制时小包装和并进行适当的离古道热肠。6)复染：目标是形成细胞表面，从而更好地对方针蛋白进行定位。一般常用 DAPI复染。7)封片：为了恒久保存，我们一般用缓冲苦油等封片，此外还有专门的抗荧光萃灭封片液。避免产活力泡，方法是直接在载玻片组织上滴一滴封片液，然后一手拿住盖片某一拐角，而另一脚拿劈面的阿谁拐角，靠近封片液远真个拐角先降低，直至接触到液体时为止；当发现液体打仗面在不休弥散时，则可以迟缓降低另一拐角，这样一般不会产气愤泡。8)切片清洗：为了防止一抗、二抗等试剂残留而引起非特异性染色，所以适当地加强清洗(延长时间和增加次
29、数)尤为重要，我一般在一抗孵育前的清洗是 3min*3次，而一抗孵育后的清洗均为5次*5min。注意(1)单独冲洗，防止交叉反应造成污染。(2)温柔冲洗，防止切片的脱落。我喜欢用浸洗方式；(3)冲洗的时间要足够，才能彻底洗去结合的物质。(4)PBS 的 PH和离子强度的使用和要求。这方面我有惨痛教训，当时我买的抗体稀释液偏酸，结果背景一片黄(未见特异性染色)，建议 PH在7.4-7.6浓度是 0.01M。(中性及弱硷性条件(PH7-8)有利于免疫复合物的形成，而酸性条件则有利于分解；低离子强度有利于免疫复合物的形成，而高离子强度则有利于分解)9)摄影：有条件的话最好当即拍照，若不能实时照相，也
30、要封好片和用指甲油封固，连结避光和干度。使用荧光显微镜注意严酷依照荧光显微镜出厂说明书要求进行操作，不要随便改动法式；应在暗室中进行查抄；防止紫外线对眼睛的侵害，在调整光源时应戴上防护眼镜；搜检时间每次以 12h为好，凌驾 90min，超高压汞灯发光强度逐步降落，荧光削弱；标本受紫外线映照 35min后，荧光也明明减弱或退色；激起光长时间的照耀，会发生荧光的衰加和淬灭现象；所以最多不得超过 23h；荧鲜明微镜光源寿命有限，标本应集合搜检，以节流时间，庇护光源。天热时，应加风扇散热降温，新换灯胆应从最先就记实使用时间。灯燃烧后欲再启用时，须待灯光充分冷却后才能点燃。一天中应避免数次扑灭光源。封闭
31、汞灯最少在开启 15-30分钟后；标本染色后立即观测，因时间暂了荧光会逐步减弱。若将标本放在聚乙烯塑料袋中 4保存，可延缓荧光减弱时间，防止封裱剂蒸发；使用的玻片等载体，都必须厚度匀称，无显明的自觉荧光，如果使用油镜，还必须包管镜油为无荧光镜油；电源最好装稳压器，否则电压不稳不但会降低汞灯的寿命，也会影响镜检的效果。3、免疫组化和免疫荧光成果阐明：见第一场实验讲座。案例一 DAB染色后切片着色一片黄/背景深背景：奥运会时代我们课题组研究生都在实验室做实验，许多从北京采办的试剂买不到，对我们的许多实验产生了很大的影响。我以前一向用中杉金桥的 SP三步法染色试剂盒，效果不错，在奥运会时期我筹办做同
32、批实验分不同批次酶免疫组化实验，第一批组化实验结果很好，抗体浓度感受比较符合(Santa Cruz 公司 1：200)，等做第二批时发现封闭血清不够了，为了保证实验顺遂进行，我又从祸州迈新顶了一个 SP试剂盒，同时抗体稀释液也不够了，我又从新从专士德公司买了一小瓶 10ml。从第二批实验开端，组化实验结果不断显示强背景着色，特异性染色很难分辨。问题及其解答：产生组织切片非特异性染色的原因有哪些?如何解决?1、抗体孵育时间过长、抗体浓度高易增加背景着色。这可通过缩短一抗/二抗孵育时间、稀释抗体来控制。这是最重要的一条。2、一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色，建议试用单克隆抗体看看。3、内源性过氧
33、化物酶和生物素在肝脏、肾脏等组织含量很高(含血细胞多的组织)，需要通过延长灭活时间和增加灭活剂浓度来降低背景染色；4、非特异性组分与抗体结合，这需要通过延长二抗来源的动物免疫血清封闭时间和适当增加浓度来加强封闭效果；5、DAB 孵育时间过长或浓度太高；6、PBS 冲洗不充分，残留抗体结果加强着色，在一抗/二抗/SP孵育后的浸洗尤为重要；7、标本染色过程中经常出现干片，这容易增强非特异性着色。我的实践解决方案：以上的剖析可能对付初学者仍是不简单的，上面我就把我的清扫尝试的具体过程与各人进行分享、交换和会商。1、起首清除抗体孵育条件。一般来讲，着色效果的黑白与抗体的孵育条件是稀弗成分的，由于用 S
34、P法已做出来过一次且效果不错，因而对于一样组织的同一抗原进行分析，这种因素可以先清扫。2、其次，DAB 孵育时候是不是太少?做出去那一次我是孵育8min，厥后也是 8-10min，我零丁做了一次尝试来解除该身分。成果孵育 2、5min 时先泛起布景，而特异性染色较浅，故那没有契合常理，普通先出现特同性染色，然后跟着工夫的耽误，会呈现非特同性后台着色。3、最后，血清封闭的问题?从前我一般孵育 15-30min，所以我单独做了一次实验用血清封闭室温 1h，其它条件同做出来的那一次，结果也一样背景着色很深。4、此外，我在改良的同时，也对 PBS清洗不竭地延长时间和增加次数，乃至完全参照试剂盒仿单来进
35、行操作(我之前一般一抗4度过夜且室温复温 45min、二抗 37度 30min、SP 反应 37度30min)，和过氧化氢灭活加强等等均未起到效果。我沉着地分析了一下整个实验流程，与第一次做出来比拟，只有两个处所做了窜改：因血清不敷而改换了不同厂家试剂盒、因抗体稀释液用完而从头买了抗体稀释液。5、我用 PBS替换一抗稀释液(我之前借收受接管抗体，自我以为抗体稀释液中含防腐剂和蛋白不变剂)，别的步调和组织切片完整与第一次做出来的一致(包罗血清也是老试剂盒内残剩的一点)，古迹出现了：成效很好。-由于抗原抗体反应除温度、抗原/抗体浓度中，然后就是 PH值，因而我测了新抗体稀释液、老抗体稀释液和 PB
36、S的 PH值，了局是前者偏酸性(6、0)，然后二者均在 7、5 阁下。6、看来重要祸端是抗体稀释液的 PH值出问题了，因而我又用PBS替换抗体稀释液和新试剂盒内的试剂对组织切片做了免疫组化，效果照旧没有做出来：背景很深。这实把我搞惨了。莫非另有什么缘故原由吗?通过细心分析：一抗必然是结合上去了(老 SP试剂盒结果很好)，题目是二抗没有结合上去也差池(因为最后背景很深，这阐明二抗可能也结合上去了)，DAB 孵育时间此刻只用1、5min 也是背景深而特异性染色浅，那我又思疑封闭血清了。7、我做了两张切片：一张用老试剂盒内还剩下一点的血清而另一张用新试剂盒内的封闭血清，别的试剂(二抗、SP)均用新试
37、剂盒供给的，结果是前一张效果很好，尔后一张能够看到特异性染色，但背景太深，拍照效果欠安。-看来封闭血清也是功会罪魁之一。结果分析表现：抗体稀释液的 PH值偏低和封闭血清的 shi效导致了我的免疫组化结果的不佳，看大师在今后的组化实验中也要注意这两个不太惹人注意的要害问题。-凄惨的教训，值得引觉得鉴。案例二 DAB染色后切片着色呈阳性后果背景：实在免疫组化在 DAB染色后一般有四种情形：阳性染色效果很好、阴性染色、非特异性染色很深、阴阳脸(染色不平均)。而阴性染色是很多初学者常常碰到的头痛问题。我身旁有个研讨生同窗在我们真验室初度涉入免疫组化，传闻步骤不难，跟我背面做了几回以后，就本身起头做了，
38、持续做了三次，结果均是阴性染色。很失望，不知是什么缘由招致的。问题及其解问：免疫组化染色呈阴性结果的原因有哪些?1、抗体浓度和质量问题和抗体来源选择毛病。不知抗体是入口的照样国产的工作液，怎样这么高稀释度也没能做出阳性结果?另外，不是抗体浓度越高就越易出现阳性结果，抗原抗体反应有前带和后带效应，必需探索最佳浓度。2、抗原修复不全，对甲醛固定的组织必需用充分抗原修复来翻开抗原表位，以利于与抗体结合；建议微波修复用高火 4次*6min尝尝。有人做过实验，这是最佳的时间和次数。若不可，还可高压修复。3、组织切片自己这种抗原含量低；4、血清封闭时间过长。5、DAB 孵育时间过短。6、细胞通透不全，抗体
39、已能充实进进胞内介入反应。7、入手下手做免疫组化，我建议你一定要首先做个阳性对照片，排除抗体等外的方法问题。我的现实办理计划：1、起首，破除组织切片内的抗原有没有丧失及其含量几多。免疫组化中两个最紧张的身分是抗原和抗体。(1)抗原有没有丢得首要看组织切片的奇怪水平，一般切片室温保留超越 3-6个月，可能切片内的抗原丢掉很严峻(有文献撑持)，此时可以通太重新用白腊块切片来进一步考证(蜡块需要高温留存)。(2)白腊切片在建造历程中大概果醛基对立原决定族的封闭，这需要通过抗原修复来充裕露出，从而删加抗原抗体结合反应，提高阳性率，我一般用 6min*4次中火微波抗原修复，用枸橼酸钠缓冲液。(3)组织切
40、片中自己抗原含量的几?这方面我有经验的，我做胎鼠睾丸间质细胞判定，用 1：200 一抗效果很好；但我用 1：200 一抗孵育成年睾丸间质细胞检测，几近呈阴性，后来证明是由于二者抗原含量相差甚近，则一抗也要适当进步浓度。2、其次，检查抗体有无选择错误和抗体孵育条件能否不适。(1)一抗选择单克隆抗体易出现阴性结果，因为灵敏度低但特异性好；一抗的 species reactivity中无检测组织的种属，这是比较常见的错误；一抗选择 rat，而二抗是抗 mouse/rabbit等均有可能出现阴性结果。(2)抗体孵育时间过短，容易导致阴性结果。一般一抗我建议 4度孵育过夜和 37度复温 45min；二抗
41、我一般 37度 30min。我不喜欢参照二抗染色试剂盒说明书。(3)抗体浓度过低。这是阴性结果的最可能原因。必须提高稀释度，我一般首次做一种新抗体，必须先用说明书建议的低浓度和高浓度做一次，然后决定是向高照样低标的目的摸索。一般先决定二抗的浓度(工作液就好办了，直接滴加)，重点摸索一抗的最适浓度。注意：免疫反应中存在前带和后带效应，这提醒不是浓度越高，阳性率就越高，反之亦然。(4)重要原因排除之后，也不要无视抗体的质量：原装抗体一般比较稳固，效果较好；而入口分装次之；工作液可能要注意质量问题。3、同时，DAB 的孵育时间可能要适当延长，在镜下察看，偶然可延长至 30min。但一般 3-10m
42、in最好，此时背景也较浅。可则，申明抗体浓度不适宜。4、最初，血浑封闭时间也可响应缩短。一般 10-30min，但这个时间可以调解，启闭主如果下降切片的整体配景着色。5、此外，细胞通透也不成轻忽。很多战友以为石蜡切片一般不需细胞通透，因为切片时可能已经把细胞切开了，但对于胞核蛋白，建议照旧通透一下，增进抗体等试剂充分进入到场反应。6、以上原因，都是针对现实中常见原因来进行分析的，条件是排除操作者的操作错误而引起阴性结果，这就需要新手仍是要设置阳性对照以排除方法的问题。还有抗体稀释液的 PH值过低等其它原因的滋扰。总之，要想把免疫组化做好，可能每个环节都很重要，但也存在主次之分，出现问题了，需要
43、通过先排除主要的，再顺次排除主要的-这是权衡你对免疫组化原理把握与否的枢纽地点。案例三石蜡切片免疫荧光染色呈阴性结果或非特异性结果背景：因实验需要，于 2008年 07月 04日初次做肝脏组织 ZO-1(一种胞膜蛋白，慎密毗邻蛋白)免疫荧光染色，以前我对酶免疫组化很是熟习，在园子内也有很多置顶贴和精髓帖，但免疫荧光一直还没做过(原理知道，但细节不太认识)。我先用石蜡切片做了 5次，结果不停不幻想(表示为未见特异性强染色)；近几日，我又切了冰冻切片，做了 2次，终究根基成功了。在这个过程中，我对免疫荧光染色技术有了全新的熟悉，而前些天发出免疫荧光乞助揭，答复的很少，所以有需要加强对免疫荧光方面的
44、计议)，不当的地方敬请斧正。有人会问酶免疫组化做的好好的，为什么要做免疫荧光?其实，这也是我以前思虑的困难，如今我认为可能胞膜蛋白含量不高，用通俗免疫免疫组化可能做不出来，需要敏感的免疫荧光方法来进行蛋白检测(我是看许多外文文献都是这样做的，因此选择免疫荧光染色。)问题及其解答：如何降低非特异性荧光染色和避免阴性着色?1、非特异性染色产生原因及其解决方案：(1)游离荧光素残留在二抗中。一部门荧光素未与蛋白质结合，形成了聚合物和衍化物，而不克不及被透析除去。二抗设置装备摆设时用透析法或层析法别离荧光素符号的二抗和游离的二抗。购置高质量、高纯度的荧光素二抗。(2)抗体之外的血清蛋黑与荧光素连系构成
45、荧光素脲卵白，可与组织成份分离。(3)组织抗原封闭不全。撤除查抄的抗原之外，组织中还可能存在类属抗原(如 Forssman氏抗原)，可与组织中特异性抗原之外之之响应抗体结合。延长血清封闭时间。(4)从组织中难于提纯抗原性物质，所以制备的免疫血清中常常混同一些抗其他组织成分的抗体，乃至容易混合。(5)抗体分子上标志的荧光素份子太多，这类过量标识表记标帜的抗体分子带过量的阳离子，可吸附于一般组织上而显现非特异性染色。(6)荧光素不杂、标本流动不妥等。(7)一抗和二抗孵育前提和浓度分歧适。调剂一抗和二抗孵育条件和浓度至最好。(8)一抗和二抗孵育后的清洗不充分。增加清洗次数和延长清洗时间。2、阴性染色
46、产生的缘由有：(1)一抗和二抗浓度不适合或孵育前提不当。(2)荧光素提早阑珊。荧光本质量欠安或操纵过程当中出有留意躲光等避免荧光素阑珊的事项。(3)血清封闭时间过长。(4)抗体稀释液 PH值分歧适，影响抗原抗体反应。(5)组织切片不服、裂片或脱片很严重，易引起大块阴性着色。(6)组织标本不新颖或已冷冻组织制成的切片中抗原易弥集，易引发原本表达的部位阴性染色或弱着色。(7)荧光显微镜不会使用，引发波长选择错误。已有的常见免疫组化困难散锦1、石蜡切片和冰冻切片的比较?(1)要求做冰冻切片的纷歧定能做石蜡切片，这是明天我背一教员就教得出的结论。因为作石蜡切片时要高温烤片，可能会毁坏组织的抗原性，假如
47、组织的抗原性较不乱，则可作石蜡切片；然则要求做石蜡切片的，可作冰冻切片。(2)冰冻切片的劣点是能够较好的保存组织的抗原免疫活性，做免疫组化时不需抗原修复这一步。错误谬误是细胞内易形成冰晶而破损细胞布局，可能会使抗原弥散；切片厚度较石蜡的厚，做的片子没石蜡的标致。当你买一抗时，目次上都写着做什么样的切片，如果它写着只能做冰冻，就不能做石蜡，如写着两者都可，那就都能做。(3)石蜡切片的长处可以连结组织细胞的形态构造，且容易寄存在室温，而冰冻切片对照费事，一定要存在-80 度的低温冰箱中，特别是用来做原位杂交的的切片，为了防止 RNA降解，保留一向很重要。由于石蜡切片可以切到 4微米摆布，所以原位纯
48、交探针容易渗入到组织中去，轻易胜利，并且得到的色彩/形态都较冰冻切片好。2、一抗的选摘要点和技能是甚么?(1)单克隆和多克隆抗体的挑选。由一种克隆发生的特异性抗体叫做单克隆抗体。单克隆抗体能方针明白地取单一的特异抗原决议簇连系，就像导弹切确天射中目的一样。另外一方面，即便是统一个抗本决意簇，在机体内也能够由好几种克隆来发生抗体，构成好几种单克隆抗体稠浊物，称为多克隆抗体。正在抗原抗体反响中，一样平常单克隆抗体特异性强，但亲和力相对小，检测抗原活络度相对便低；而多克隆抗体特异性稍强，但抗体的亲和力强，活络度下，但易出现非特异性染色(能够经由过程封锁等制止)。(2)使用规模的选择。有的一抗只能用于
49、 Western blotting，或免疫组化、免疫荧光、免疫沉淀等；以至讲明石蜡切片或冰冻切片。(3)种属反应性的选择(species reactivity)。这一点很重要，表白这类抗体可能存在种属差异，且这种抗体合适检测哪一种种属动物体内的抗原。(4)种属起原，一般兔滥觞的多是多克隆；而小鼠泉源的多是单克隆，但也有别的。凭据此根源来选择相应的二抗。(5)出产厂家的选择。如 santa Cruz公司抗体一般 1ml，价钱2100元左右；而 chemicon公司一抗一般 100ul，价钱 2800元左右。这两个厂家的同一种抗体它的实际效价不乱是不同的，我一般用后者抗体做免疫组化效果较好，而前者做 Western blotting效果还可以。3、在甚么环境下利用 TritonX-100?(1)Triton X-100化学称号为聚乙二醇辛基苯基醚，是一种去污剂。在免疫组织化学(10um薄切片)和免疫细胞化学中一般用 Triton X-100作为细胞通透剂，在膜上挨孔。(2)其作用原理：Triton X-100可以消融细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂质而使抗体及大分子结构的物质进入胞浆和胞核内，故在细胞免疫组化时尤为推荐使用，这样抗体就能逆利进入
