1、第二节 免疫分析方法及其应用,一 放射免疫分析法利用放射性核素可探测的灵敏性，精确性与抗原抗体反应的特异性相结合而创建的一类免疫测定技术。 基本类型和原理竞争性结合反应：放射免疫分析(RIA）-以放射核素标记抗原与反应系统中未标记的抗原竞争特异性抗体的基本原理来测定待检样品中抗原量的分析方法。 非竞争性结合反应：免疫放射分析(IRMA)用放射性核素标记的过量抗体非竞争结合抗原，经固相分离，测定待测样品中抗原量的分析方法。,2.常用的放射性核素 125I、131I、3H、14C。,3. 标记物的制备及鉴定标记物：是指通过直接或间接的化学反应将放射性核素连接到被标记分子上锁形成的化合物。 要求：高
2、比度、高纯度、完整的免疫活性、不能破坏抗原决定簇。 直接标记法（铬氨酸残基和组氨残基） 间接标记法（联接标记，引入添加基团） 标记物的纯化：采用分离的方法离子交换层析法。 标记物的鉴定：放射化学纯度、免疫活性、比放射性（计算法和自身置换法）。,4. 放射免疫分析 一、原理：,Ag + Ab AgAb + Ag + * Ag* AgAb + * Ag * Ag和 Ab量恒定， Ag的量为一个系列浓度。,竞争结合,抗原抗体复合物与标准抗原的关系,* AgAb复合物的量取决于Ag的量 Ag量越大， * AgAb量越少 Ag量越小， * AgAb量越大 测量* AgAb量或测量多余* Ag量可推算出A
3、g量,二. 标准曲线的建立,以* AgAb的放射性强度与* Ag的放射性强度的比值或以* AgAb的放射性强度与总放射性强度的比值作纵坐标，标准抗原浓度为横坐标做曲线，得到一条标准曲线。在同样条件下测定样品，计算出抗原抗体复合物的放射性强度与总放射性强度的比值，在标准曲线上找出待测抗原的量。,二、测量步骤,恒量的* Ag、Ab加入反应管中 加入待测样品、或标准品（已知浓度） 37或4 温育 加入分离剂分离结合及游离部分 测定以总放射性为分母，测定* AgAb 为分子，计算结合%，以结合率为纵坐标，浓度为坐标，制作标准曲线 待测样品的结合率从标准曲线上求出浓度,0 2 4 8 16 32 64
4、128,80 70 60 50 40 30 20 10,结 合%,浓 度,二. 免疫放射分析方法,单位点IRMA：先将过量的标记抗体与待测抗原进行反应，形成抗原抗体复合物，反应平衡后，用固相抗原结合反应液中剩余的游离标记抗体，然后进行分离，测定抗原抗体复合物的放射量。双位点IRMA：先用固相抗体与抗原反应，然后再用过量的标记抗体与已结合于固相抗原的另外一个抗原决定簇结合，形成抗体-抗原-标记抗体复合物，分离出剩余的标记抗体，测定固相上的放射性。,IRMA与RIA的比较,二. 荧光免疫分析方法,荧光免疫技术是以荧光素标记的特异性抗体或抗原作为试剂，用于相应抗体或抗原的分析鉴定和定量测定，主要有荧
5、光抗体染色技术和荧光免疫测定两种类型。 非均相荧光免疫测定法：需要分离抗原抗体复合物和剩余的标记物，然后测定复合物或剩余标记物的量，从而计算出标本中的抗原量。 均相荧光免疫测定法：不需要分离复合物与剩余标记物，直接测定剩余的标记物的量，计算出标本中的抗原量。,一、分子发光分析法及其分类 某些物质的分子吸收一定能量后，电子从基态跃迁到激发态，以光辐射的形式从激发态回到基态，这种现象称为分子发光，在此基础上建立起来的分析方法为分子发光分析法,分子在退激过程中以光辐射形式释放能量,荧光的产生,根据分子受激时所吸收能源及辐射光的机理不同分为以下几类：光致发光：以光源来激发而发光电致发光：以电能来激发而
6、发光原子发射光谱法生物发光：以生物体释放的能量激发而发光化学发光：以化学反应能激发而发光化学发光分析法,荧光荧光分析法 磷光磷光分析法,荧光效率：发射荧光的光量子数与吸收光的光量子数的比值,荧光淬灭：处于激发态的电子不能回复到基态，所吸收的能量不能以荧光的形式发射。荧光素：具有光致荧光特性的染料。,时间分辨荧光免疫测定法,以镧系元素螯合物标记抗体或抗原，利用荧光发射体荧光寿命差别而将波长相同的荧光分开的技术。 原理：镧系元素与螯合物络合，再与抗原或抗体结合，加入荧光增强剂，紫外光照射激发出荧光，进而测定。 主要类型； 固相双位点夹心法：待测物与固相抗体反应后，再加入Eu3+标记抗体反应，生成E
7、u3+标记抗体-抗原-固相抗体复合物，所测荧光强度与待测物浓度呈正比。 固相抗原竞争法:将大分子抗原包被在固相上成为固相抗原，固相抗原与待测抗原共同竞争限量的Eu3+标记抗体，待测抗原浓度越高，固相抗原结合的标记抗体就越小，所测荧光强度与待测物浓度呈反比。,固相抗体竞争法,待测抗原和Eu3+标记抗原与固相抗体发生竞争性结合，分离剩余的Eu3+标记抗原与Eu3+标记抗原抗体复合物，在固相中加入增强剂，测定复合物的荧光强度，荧光强度与待测抗原浓度呈反比。TR-FIA的特点：镧系元素螯合物荧光寿命很长；激发光与荧光的波长差别显著。 应用：,荧光偏振免疫测定法,利用物质分子在溶液中旋转速度与分子大小呈
8、反比的特点对荧光抗体进行检测的技术。 原理：荧光素标记抗原和待测抗原与抗体发生竞争结合反应，当标记抗原与相应抗体的量恒定时，反应平衡时结合状态的标记抗原量与待测抗原呈反比。 荧光偏振的强度与抗原浓度呈反比。以抗原浓度为横坐标，荧光偏振强度为纵坐标作图，建立关系。,1971年瑞典学者Engvail和Perlmann,荷兰学者Van Weerman和Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，即酶联免疫吸附测定法 (enzyme-linked immunosorbent assay , ELISA) 。ELISA现在已成为目前分析化学领域中的前沿课题 ，它是一种特殊
9、的试剂分析方法，是在免疫酶技术( immunoenzymatic techniques ) 的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术 。,酶联免疫分析法,一、基本原理它采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。测定的对象可以是抗体也可以是抗原。,在这种测定方法中有3种必要的试剂：固相的抗原或抗体（免疫吸附剂） 酶标记的抗原或抗体（标记物） 酶作用的底物（显色剂）,测量时，抗原（抗体）先结合在固相载体上，但仍保留其免疫活性，然后加一种抗体（抗原）与酶结合成的偶联物（标记物），此偶联物仍保留其原免疫活性与酶活性，当偶联物与固相载体上的抗原（抗体）反应结合
10、后，,再加上酶的相应底物，即起催化水解或氧化还原反应而呈颜色。,其所生成的颜色深浅与欲测的抗原（抗体）含量成正比。这种有色产物可用肉眼、光学显微镜、电子显微镜观察，也可以用分光光度计（酶标仪）加以测定。其方法简单，方便迅速，特异性强。,二、酶及其底物酶结合物是酶与抗体或抗原, 半抗原在交联剂作用下联结的产物。是ELISA成败的关键试剂，它不仅具有抗体抗原特异的免疫反应，还具有酶促反应，显示出生物放大作用，但不同的酶选用不同的底物 ，将得到不同的颜色反应.,ELISA的种类和变化,（一）双抗体夹心法 （二）间接法 （三）竞争法 （四）双位点一步法 （五）捕获法测IgM抗体 （六）应用亲和素和生物
11、素的ELISA,（一）双抗体夹心法,此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原,获得待分析物的未标定抗体,将特异性抗体与固相 载体连接形成固相抗体,洗涤除去未结合的 抗体及杂质,加入封闭蛋白溶液以封闭载体 表面残留的蛋白结合位点,洗涤并除去未结合的封闭蛋白,加受检标本（抗原）形成 固相抗体抗原复合物,洗涤除去其他 未结合的物质,加酶标抗体生成 抗体待测抗原酶标记抗体 的复合物,彻底洗涤 未结合的酶标抗体,加底物进行 酶催化反应,根据颜色反应的 程度进行该抗原 的定性或定量测定,间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。,（二）间接法,包被固相载
12、体: 用已知抗原包被 固相载体,加待检标本: 使相应抗体与固相抗原结合 洗涤，除去无关的物质,加酶标抗抗体: 与固相载体上抗原抗体 复合物结合；洗涤，除去 未结合的酶标抗抗体,加底物 显色,根据颜色反应的程度进行 该抗原的定性或定量测定,（三）竞争法,此法可用于抗原和半抗原的定量测定，也可用于测定抗体 。,用已知特异性 抗体包被 固相载体,测定管加待测抗原和 一定量的酶标抗原使二者与 固相抗体竞争结合,对照管只加一定量酶标抗原 与固相抗体直接结合,分别洗涤 除去未结合 的成分,加底物显色,分别测定两管的吸光度值， 根据对照管与测定管吸光度值之比，计算标本中待测抗原含量,对照管由于只加酶标抗原，
13、与固相抗体充分结合，故分解底物显色深；测定管的显色程度则随待测抗原和酶标抗原与固相抗体竞争结合的结果而异。如待测抗原量多，竞争性地抑制酶标抗原与固相抗体结合，使固相上结合的酶标抗原量减少。因此，加入底物后显色反应较弱。,（4） 双位点一步法 在双抗体夹心法测定抗原时，如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体，则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步。这种双位点一步不但简化了操作，缩短了反应时间，如应用高亲和力的单克隆抗体，测定的敏感性和特异性也显著提高。单克隆抗体的应用使测定抗原的ELISA提高到新水平。,五）捕获法测IgM抗体 血清中针对某些抗
14、原的特异性IgM常和特异性IgG同时存在，后者会干扰IgM抗体的测定。因此测定IgM抗体多用捕获法，先将所有血清IgM（包括异性IgM和非特异性IgM）固定在固相上，在去除IgG后再测定特异性IgM.操作步骤如下： （1）将抗人IgM抗体连接在固相载体上，形成固相抗人IgM.洗涤。 （2）加入稀释的血清标本：保温反应后，血清中的IgM抗体被固相抗体捕获。洗涤除去其他免疫球蛋白和血清中的杂质成分。 （3）加入特异性抗原试剂：它只与固相上的特异性IgM结合。洗涤。 （4）加入针对特异性的酶标抗体：使之与结合在固相上的抗原反应结合。洗涤。 （5）加底物显色：如有颜色显示，则表示血清标本中的特异性Ig
15、M抗体存在，是为阳性反应。,（六）应用亲和素和生物素的ELISA 亲和素是一种糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量60kD,每个分子由4个亚基组成，可以和4个生物素分子亲密结合。现在使用更多的是从链霉菌中提取的链霉和素（strepavidin）。生物素（biotin）又称维生素H,分子量244.31,存在于蛋黄中。用化学方法制成的衍生物，生物素-羟基琥珀亚胺酯（biotin-hydroxysuccinimide,BNHS）可与蛋白质、糖类和酶等多种类型的大小分子形成生物素化的产物。亲和素与生物素的结合，虽不属免疫反应，但特异性强，亲和力大，两者一经结合就极为稳定。由于1个亲和素分子有4个生物素分子的结合位置，可以连接更多的生物素化的分子，形成一种类似晶格的复合体。因此把亲和素和生物素与ELIS偶联起来，就可大提高ELISA的敏感度。,
