1、第五章 常见色谱分离技术,绪论薄层色谱法纸色谱经典柱液相色谱法及干柱层析,5.1 绪论,5.1.1 色谱发展史及进展,1、色谱法的出现1903年俄国植物学家Tswett(茨维特)把干燥的碳酸钙粉末装到一根细长的玻璃管中，然后把植物叶子的石油醚萃取物倒到管中的碳酸钙上，萃取液中的色素就吸附在管内上部的碳酸钙里，再用纯净的石油醚洗脱被吸附的色素，于是在管内的碳酸钙上形成了色带。当时Tswett把这种色带叫作“色谱”（Chromatography）。在这一方法中把色谱管叫作“色谱柱”，碳酸钙叫作“固定相”，纯净的石油醚叫作“流动相”。,2、色谱法的发展,在Tswett提出色谱概念后的20多年里没有人
2、关注这一伟大的发明。1931年：德国的Kuhn和Lederer在Tswett实验的基础上用氧化铝和碳酸钙分离了-，-，和-胡萝卜素，此后用这种方法分离了60多种这类色素。1940年：Martin和Synge提出液-液分配色谱法（Liquid-Liquid Partion Chromatography）,即固定相是吸附在硅胶上的水，流动相是某中有机溶剂。1941年Martin和Synge提出用气体代替液体流动相的可能性。1952年James和Martin发表了从理论到实践比较完整的气液色谱方法（Gas-Liquid Chromatography），因而获得了1952年的诺贝尔化学奖。1957年G
3、olay开创了开管柱气相色谱法（Open-Tubular Column Chromatography），习惯上称为毛细管气相色谱法（Capillary Column Chromatography）。,1956年Van Deemter等在前人研究的基础上发展了描述色谱过程的速率理论，1965年Giddings总结和发展了前人的色谱理论，为色谱的发展奠定了理论基础。,1944年Consden等就发展了纸色谱。1949年Macllean等在氧化铝中加入淀粉粘合计制作薄层板使薄层色谱（TLC）得以实际应用，而在1956年Stahl开发出薄层色谱板涂布器之后，才使TLC得到广泛地应用。20世纪60年代末
4、，把高压泵和化学键合固定相用于液相色谱，出现了高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography）。20世纪80年代初毛细管超临界流体色谱得到发展，但在90年代后未得到较广泛应用。20世纪80年代初由Jorgenson等集前人经验而发展起来的毛细管电泳，在90年代得到广泛的发展和应用。同时集高效液相色谱和毛细管电泳优点的毛细管电色谱在90年代后期受到重视。21世纪色谱科学将在生命科学等前沿科学领域发挥他不可替代的重要作用。,包括两相（即固定相、移动相）和样品。固定相 在色谱过程中不发生移动。 材料：固体（相）、固体及其所支持的液体。流动相 在色谱过程中不
5、停地移动，并带动被分离物质一起移动。 材料：气体、液体。样 品 溶质,5.1.2 色谱体系,色谱法的基本原理,色谱法是包括一大类操作方式不同、但分离原理相同的一门技术，不论采用何种方法或设备、其色谱过程有着如下共同点：（1）任何色谱过程，都必须有两相物质存在，一为固定相，一为流动相。（2）物质的分离还必须借助于流动相相对于固定相移动。（3）被分离的物质称为溶质，由于各种溶质组分与两相物质有着不同作用力，从而造成各组分产生差速运动而达到分离目的。 溶质与两相物质之间作用力可以为吸附力，也可以为溶解力；由于此种力之不同，决定了各个组分在两相中有着不同量或浓度的分布，随着流动相的前移，则此种分布不断
6、变更，最终与流动相作用力大的组分前移快，反之则慢，下图为一二元组分分离示意图。,下图为一二元组分分离示意图。,分 离 原 理,在色谱分析中，当流动相携带样品通过色谱的固定相时，样品分子与固定相分子之间发生相互作用，使样品分子在流动相和固定相之间进行分配。与固定相分子作用越大的组分向前移动速度越慢，与固定相分子作用越小的组分向前移动速度越快，经过一定的距离后，由于反复多次的分配，使原本性质（沸点、极性等）差异很小的组分之间可得到很好的分离。,5.1.3 色谱法的分类（依据不同,分发不同）,（1）按两相的状态分类,开床式色谱,纸色谱（利用滤纸作固定相的支持物，把试样点在滤纸上，用溶剂将其展开而进行
7、分离） 薄层色谱（用粉末吸附剂，压成或涂成薄层，然后用类似纸色谱的操作进行分离）,（2）按分离“床”的几何形状分类,柱色谱,（3）按分离原理分类, 吸附色谱：利用吸附剂表面对不同组分具有的不同吸附能，达到分离目的。 分配色谱：利用不同组分在给定的两相中具有不同的分配系数而使混合物实现分离与测定的方法。 离子交换色谱：以带固定电荷的离子交换剂作固定相，用于分离带相反电荷的物质。由于不同物质带电情况不同而对固定相有不同的静电力而进行分离 。 凝胶色谱：又叫体积排阳色谱，分子筛色谱。以多孔的固体凝胶作固定相，分子大小不同的物质因进入固定相孔内的程度不同而达到分离的目的。 亲合色谱：根据固定相上键合的
8、特殊配体对某种生物大分子有专一性吸附而除去其他杂质。使生物大分子得以分离。,（4）按使用领域不同对色谱的分类：,分析型色谱：主要用于各种样品的分析，其特点是色谱柱较细，分析的样品量少。 制备型色谱：又可分为实验室用制备型色谱和工业用大型制造纯物质的制备色谱。,5.2 薄层色谱法,薄层色谱法（Thin-Layer Chromatography，简称TLC） 定义：是一种把固体分离材料铺在一个固体薄片上形成薄层，通过移动相流经薄片上附着的吸附剂，带动试样逐渐上升(展开)，由于混合物组分对固定相、移动相相对吸附能力的不同而将其加以分离的方法分类：薄层色谱法可以有多种形式：如吸附色谱，分配色谱，离子交
9、换色谱等，而应用最广泛的是吸附薄层色谱，所以在这里只讨论它。,5.2.1 基本原理,基本概念： 吸附：溶质分子随流动相之流动，会贴在固定相表面上，这就是吸附。 物理吸附：吸附作用力为分子间的一般作用力，即范德华力，没有化学键的生成与破坏。因之物理吸附具有普遍性，无选择性；吸附速度快而可逆；同时吸附热较小（510千卡/摩尔）；被吸附分子不限于单层，实际上可以是多层。 化学吸附：吸附作用力类似化学键力；即电子的转移或电子共用等。由于被吸附分子与吸附剂分子间有成键的可能，所以有选择性，吸附速度较慢，需要在高温下才能发生；不易解析；吸附热较大（10100千卡/摩尔），被吸附分子一般是单层的。物理吸附与
10、化学吸附可以并行发生，二者不是截然无关的。 吸附剂：吸附别的物质的物质。如：硅胶、三氧化二铝。 展开剂：溶剂，又叫洗脱剂，带动样品移动。 样品：又叫溶质。,基 本 原 理,在吸附薄层色谱体系中，一般均发生物理吸附。当样品溶液被点样到薄板的吸附剂上然后用展开剂展开时，吸附剂对样品分子、溶剂分子均发生吸附。同时，它们也都可以被解吸下来（即吸附在某一点上的分子被其他分子所取代）。 在薄层色谱的展开过程中，溶质分子和溶剂分子对吸附剂存在着一个竞争。被吸附在薄板上的溶质分子可以被溶剂分子置换进入溶剂中，并随溶剂的向前移动而迁移。而在溶剂中的溶质分子也可以把吸附在吸附剂上的溶剂分子置换下来，溶质分子重新被
11、吸附在吸附剂上。这一过程不断循环往复进行。 对于吸附性强的溶质组分在吸附剂上的浓度大一些；吸附弱的溶质组分则在溶液中浓度大。 吸附弱or在溶液中浓度大的组分，随溶剂的前进迁移速度快，则Rf值大；反之吸附强or在溶液中浓度小的组分随溶剂的前进迁移速度慢，则Rf值小。这样就可以把不同的组分分离开。,溶质迁移的快慢用比移值Rf来表示,在给定的实验条件下，Rf值对于某一溶质说是一特征值，因此可借色谱法来鉴定物质。吸附力强的溶质，有较小的Rf值，反之，则有较大的Rf值。Rf这一特征值就构成了色谱分析的基础。,5.2.2 薄层色谱的固定相,1. 确定吸附剂 从被分离混合物性质出发主要考虑3个方面溶解性；酸
12、碱性；极性。,溶解性：, 酸碱性：,吸附剂酸碱性与试样的应保持一致。否则会发生化学反应而产生不可逆吸附。 一般地： 硅胶 略带酸性。(适用于酸性和中性物质的分离) 氧化铝略带碱性。(适用于碱性和中性物质的分离) 硅胶与氧化铝以1：1量惨和中性吸附剂。, 极性:,吸附剂一般都是极性物质，所以混合物试样的极 性越大，则被吸附剂吸附得越牢，移动速度越慢（Rf 值越小）,常见吸附剂吸附能力的比较：,蔗糖纤维素淀粉CaCO3 CaSO4MgCO3 硅胶活性炭MgO氧化铝,（2）吸附力的规律性：,被吸附分子与吸附剂（硅胶、氧化铝）之间的吸附力大小有下列规律性: 能在吸附剂和吸附分子间形成氢键时，吸附力就大
13、。 被吸附分子的极性大，吸附力就大；分子中极性官能团增多，吸附力也增加。 分子中有双键时吸附力比无双键时大，双键增大，特别是形成共轭时吸附力增大的更明显。苯环的影响比双键大。 同系物中分子量大则吸附作用也强。,同分异构体若形成了分子内氢键，则对吸附剂的吸附力大大减小，如下列物质的吸附力大小为：,含单官能团的化合物，当烷基链长短相同时，吸附力大小为:,离子化合物羧酸醇、酰胺伯胺酯、醛酮腈、叔胺、硝基化合物醚烯卤代烷烷,（3）吸附剂选用 吸附色谱： 最常用的吸附剂有硅胶、氧化铝，粒度一般为150300目筛孔，其次是聚酰胺和纤维素，其粒度一般分别为70140目筛孔和160200目筛孔。 氧化铝的极性
14、比硅胶大，比较适用于分离极性较小的化合物（烃、醚、醛、酮、卤代烃等）；相反，硅胶适用于分离极性较大的化合物（羧酸、醇、胺等），而非极性化合物在硅胶板上吸附较弱，分离较差，Rf值较大。,表5-1 常见薄层色谱吸附剂（固定相）,2. 薄层色谱对吸附剂的要求,具有均匀的结构和一定的比表面积。 具有一定的机械强度和稳定性。对展开剂和样品成分不分解、不破坏。 具有可逆的吸附性。 最好为白色固体，以利于观测。,注意：碱性氧化铝做吸附剂时，会引起一些物质的反应。 如：使醛酮缩合、酯和内酯水解、醇羟基脱水。,5.2.3 薄板的制备：,1、薄板制备：,（1）薄板的选择 最常用的薄板是玻璃板，其大小 选择：根据目
15、的、样品量、组分的数目多少和展开的 方式等综合而定。 小量制备：待分离组分总量在0.51g左右，可采用 400mm350mm的薄板13块即可。 预试或定性分析：用单项展开时，多用载玻片 （200mm50mm，200mm25mm或75mm25mm）。 双向展开或小量制备时，一般采用200mm200mm 或400mm200mm的大板。 玻璃板要求：平整、光滑、干净。,（2）制板方法：湿铺法 和干铺法 干铺法 概念：就是将吸附剂颗粒或粉末均匀地平铺在玻璃板上的方法，所制得薄板称为干板。 吸附剂粒度要求：一般为150200目左右。 涂铺方法：把玻璃板平放在平台上或实验台面上，先将吸附剂大致平摊在玻板上
16、，然后两手握住一根带有两个套圈的粗玻璃棒，按照图所示方向推动，把多余的吸附剂除去，便可得到一块均匀的薄板。玻棒套圈可以用塑料管或胶布等制成。两个套圈的厚度和距离，便是薄层的厚度和宽度。定性或定量板厚度：0.250.5mm；制备板厚度：1-3mm（此法也可用于制备大块湿板）。,图51 薄层干铺法1玻板 2玻棒 3厚层套圈 4导轨套圈 5薄层,湿铺法 概念：将溶剂或含粘合剂的溶剂和吸附剂按一定的比例，一般硅胶为30g/(75-90) ml，氧化铝为25g/50ml，加到一起，调成糊状，然后再将糊状物均匀的铺在薄板上的方法。 吸附剂粒度要求：硅胶、氧化铝一般为200300目左右；聚酰胺、纤维素一般为
17、160200目。 湿铺法的操作步骤：调糊 硅胶G、氧化铝G、硅胶GF254或不含粘合剂的吸附剂如硅胶H、氧化铝H的充分调匀，均是取1份吸附剂，加入2-3份水。 用CMC作粘合剂：0.5%羧甲基纤维素钠溶液100ml,加硅胶H（200250目）30g或氧化铝50g，充分调匀后，即可涂铺。,用淀粉作粘合剂时：取硅胶H（200250目）0.95份，加0.05份淀粉（可溶性淀粉不能用），加水23份，将容器放在沸水浴上加热，不停搅拌下煮沸5分钟，直到获得最大的粘稠度，再加水1份，再煮12min，调匀，冷后涂铺。 纤维素粉作粘合剂：纤维素粉1份，加水（或丙酮）56份调成糊状后涂铺。 聚酰胺1g，加6mL
18、85%甲酸，搅拌溶解后，再加70%乙醇3mL，调匀后，便可涂铺。,徒手铺板：将调制好的薄层糊倒在备用的玻板上，用玻棒初步摊开，用拇指和食指抓住玻板一端，在桌面上反复震动数次，待薄层糊铺展均匀后，平放在平台上即可。此法简便、快速，最适合微型板的制备。 薄层板质量的判定：薄厚均匀，层面不应有波纹，也不应有透过吸附剂而看到玻璃板的斑点。 薄板的后处理：晾干后，活化。 硅胶板 一般在105,最高不超过128 ，烘箱中烘烤半小时，冷却后取出在干燥器中保存备用。作为分配色谱的硅胶薄层板无需活化，在室温下放置12h24h后即可使用； 氧化铝板 200220活化4h，得活性为级的板。150160 活化4h，得
19、活性为级的板。,2、薄板（吸附剂）活性测定： （1）海氏（Hermenek）法 适用对象：无粘合剂氧化铝和硅胶板 方法：取0.02mL染料混合液，分别滴于氧化铝（或硅胶）干板上（薄层：902400.6mm），用四氯化碳展开（薄板与展开缸底夹角为1020）。然后按下表中Rf值确定其活度级别。,表52 氧化铝及硅胶海氏定级法,（2）斯托尔（Stahl）方法 适用对象：用湿铺板、经活化的含粘合剂的硅胶板 方 法：将三种染料的混合氯仿溶液点在薄层上，点的直径为12mm，用正己烷乙酸乙酯（91）展开，3060min内溶剂爬行10cm，如果三种染料的比移值（Rf）大小为对二甲氨基偶氮苯靛酚蓝苏丹红，则与级
20、氧化铝的活性相当。,5.2.4 点样及展开,1、点样：将样品溶液点在薄板上。,点样工具：微量注射器；玻璃毛细管。 点样方法：液体直接点样法；固体添埋法。 样点式样：点型；线型；条型。 点样应注意的五个问题： 点样液的浓度与制备： 5%准备液 0.11%点样液 重复点样的次数与操作事项： 点样斑点的大小：一般点样斑点直径不大于3mm； 点样量：0.25mm薄层，一般点样量为几微克几百微克作定性分析；2mm层厚，点样量可达几十毫克几百毫克作制备。 点样位置：距底边约1.52cm的起始线上，点与点之间的距离一般为1.52cm。,图52 各种点样方式示意图,2、展开/展层：是混合物样品分离的过程。,应
21、注意： 展开剂不淹没样点。 薄板呈倾斜状 溶剂前沿不超过板顶。,展层的容器：除了专用的色谱缸外，常见玻璃标本缸、染色缸、广口瓶、大量筒、大试管等可作为其代用品。 展层方式：上行法；下行法；双向法；递次上行法。,（1）上行法：有倾斜上行法或垂直上行法两种。软板则只能与平面成约15的近水平倾斜放置。 上行法展开的距离一般为1015cm，展开时间约为30min左右，最快者只需几分钟，最慢者需23h。,（2）下行法：薄层样点朝上，展开剂是从上向下通过薄层。展开剂与薄层之间是通过滤纸条或纱布条作为桥梁进行转移的。由于展开剂受吸附和重力的双重作用，因此，下行法展开速度较快。 （3）双向展开法：适用于方形板
22、。先沿X轴展开，然后再换用另外一种展开剂沿Y轴展开。此法常用于某些复杂成分或Rf值较小的成分的展开，氨基酸分离就常用此法展开。,（4）递次单向法/多次单向法：,先用一种展开剂上行展开后，再在同一方向用同一种或换成另外一种展开剂展开，如此反复多次，可得到较好的分离效果，这种方法称为递次上行法，可适用于不易分离的化合物的分离。,边缘效应： 消除边缘效应的方法：是在层析缸内壁贴上用展开剂浸湿的滤纸条。,3、展开剂的选择：,即：一是展开剂对被分离物质应该有一定的解吸能力，即要选择合适的极性。极性大的溶剂，解吸能力（或叫洗脱能力）强，样品组分的Rf值大；极性小的溶剂，解吸能力小，使组分的Rf也小。二是展
23、开剂对被分离的组分有一定的溶解度，因为被解吸下来的组分只有能溶解在展开剂中才能随展开剂向前移动。,大原则：选择展开剂一般需要针对吸附剂的种类、 活度和被分离混合物的组成及各成分的性质结构和 性质等情况综合而定,小原则：被分离物质和展开剂之间的极性关系应符合“相似相溶原理”。该原则可用于确定展开剂的大致范围。 即：强极性试样用强极性展开剂；弱极性试样用弱极性展开剂。选择的具体方法： 粗选预试验（微园环试验和小板试验）确定,硅胶和氧化铝板上官能团对洗脱能力的影响是：（弱强）,若溶剂分子中有以上官能团，则越往后的官能团溶剂，洗脱时解吸能力越大，Rf越大。,某些溶剂的洗脱能力/极性大小，见下：,单一溶
24、剂的极性大小顺序为：石油醚（小）环己烷四氯化碳三氯乙烯苯甲苯二氯甲烷氯仿乙醚乙酸乙酯乙酸甲酯丙酮正丙醇甲醇吡啶乙酸（大） 混合溶剂的极性顺序：苯氯仿（1+1） 环己烷乙酸乙酯（8+2）氯仿丙酮（95+5）苯丙酮（9+1）苯乙酸乙酯（8+2）氯仿乙醚（9+1）苯甲醇（95+5） 苯乙醚（6+4）环己烷乙酸乙酯（1+1）氯仿乙醚（8+2）氯仿甲醇（99+1）苯甲醇（9+1）氯仿丙酮（85+15）苯乙醚（4+6）苯乙酸乙酯（1+1）氯仿甲醇（95+5）氯仿丙酮（7+3）苯乙酸乙酯（3+7）苯乙醚（1+9）乙醚甲醇（99+1）乙酸乙酯甲醇（99+1）苯丙酮（1+1）氯仿甲醇（9+1）,如何根据被分离的
25、对象选择吸附剂和展开剂？,一般地：都是根据样品极性及试验结果临时确定的。若吸附剂确定后，经试验若： Rf值太大，选展开剂极性比原来的小的溶剂。 Rf值太小，选展开剂极性比原来的大的溶剂。 一般经过多次才能确定下来。,有一 三角形图解法可以作为初步选择参考。,图5-3 吸附色谱中三种主要因素的关系图,5.2.5 显色,显色：为再现无色组分斑点位置。 目的：对物质进行鉴定。 方法：物理方法紫外光照射。化学方法化学试剂喷洒。,喷洒工具及方法：喷壶；喷洒显色剂要求喷壶与薄层的距离应在约30 40厘米，显色后，要立即用铅笔或打头针把斑点位置标出，以便下步测量Rf值，并把薄层色谱图描绘下来。,喷 壶,显色
26、剂种类：,介绍几种化学方法：（显色前要将展开剂挥发掉）,1、碘蒸气法将展开后溶剂挥发干的薄板放入一个密闭的容器内。容器是碘蒸气饱和的器皿。多数有机物可以显黄到黄棕色斑点。显色作用是碘溶解在组分中，或被吸附在组分物质上或与组分发生加成作用，主要是吸附作用。所以显色后在空气中放置碘会挥发，斑点褐色，有利于应用在制备薄层色谱。,通用显色剂； 选择性显色剂； 专属性显色剂。,2、喷雾显色,将可以与分离的物质反应生成有色物质的显色剂配成一定浓度的溶液，用喷雾器均匀地喷在薄层板上进行显色。常用的通用性显色剂如下： a. 重铬酸钾硫酸（5g重铬酸钾溶于100mL 40%硫酸中）：用于检查一般有机物。 b荧光
27、素溴（0.1g荧光素溶于100mL乙醇）：喷后放在有5%的Br2CCl4缸中熏，在紫外灯下观察。用于不饱和化合物。 c硫酸：配成5%的硫酸乙醇溶液或15%硫酸正丁醇溶液或浓硫酸醋酸（1：1）的溶液。这是一种通用显色剂。喷后放置15min，然后110下烘到显色。 d磷钼酸（或磷钨酸、硅钨酸）：喷洒剂为5%10%的磷钼酸乙醇溶液，用于检查还原性物质、生物碱、甾体。喷后加热到120到斑点出现。,3、吸附剂加荧光粉,样品是有机物且含有共轭基团可以吸收紫外线时，其薄层分析可以事先在吸附剂中加荧光粉，制成的薄板在紫外灯下显一片荧光。展开后，挥发干溶剂的薄板，其组分斑点因吸收紫外线而显暗色斑点，其余地方仍显
28、荧光。这是一种对共轭基团的物质的最方便的显色办法。,5.2.6 定性分析及定量分析,1、定性分析： 以组分的比移值（Rf值）为依据，即在相同的条件下相同物质有相同的Rf值，不同物质有不同的Rf值。,比移值：溶质的运动速度与展开剂的运动速度之比值。,注意： Rf值与许多因素有关。,（1）比移值,薄层色谱的Rf值, 影响Rf值的因素：,薄层的厚度 吸附剂的种类、粒度、活度（吸附能力） 展开剂的纯度、组成及挥发性 展开方式（上行或下行） 展开缸的形状、大小及缸内溶剂的饱和程度 取样量大小（取样量大，斑点拖尾， Rf较小） 外界温度（温度变化既影响溶剂的挥发性，又影响吸附平衡） 边缘效应（即同一样品，
29、点在薄板中部的比两边的Rf小）, Rf的特性和应用：,在固定条件下，特定化合物的Rf值是一个常数。因此，在条件完全相同的情况下，Rf值可以作为该化合物定性鉴定的物理指标，就像测定熔点或其它物理常数一样。为了获得相同的色谱条件，通常是把未知样和标准样同时滴加在同一块薄板上。, Rf的测量 Rf值测量：斑点轮廓斑点重心位置斑点中心到点样原点距离展开剂前沿到点样原点距离Rf值计算,（2）TLC定性分析的几种方法,将样品的Rf 值与标样的Rf 相比较：由于影响Rf值的因素很多，常需要在使用两种以上不同组成的展开剂而得到的Rf值与标样的Rf值一致时，才认定该斑点与标样是同一化合物。 将斑点的显色特性与标
30、样的显色特性相比较：确定化合物性质。 使用斑点的原位扫描：展开后的斑点用薄层扫描仪作原位扫描可得该斑点的扫描图，当其吸收峰及最大吸收波长与标样一致时，可认为是同一物质。 与其他方式联用：将薄层分离后得到的单一斑点收集、洗脱，然后使用GC、HPLC、紫外、红外等方法帮助鉴定。,2、定量分析,（1）洗脱法 展开后的薄板，选择某种不影响下步定量操作的显色方法进行显色，如碘蒸气法显色。然后刮下需要定量的组分的标准样的斑点和待测样对应组分的斑点。分别用溶剂萃取，然后用紫外光谱或荧光光谱（只适用于有荧光的化合物）进行定量，也可以使用气相色谱或液相色谱定量。薄层色谱分离后用分光光度法测定，方法误差约在2%-
31、6%。 （间接法测定斑点物质分离准确定溶仪器测定，误差在35%之间。）,（2）薄层扫描定量法,扫描仪扫描方式：线性扫描和锯齿扫描,线性扫描：用一束比斑点略长的光束对斑点作单向扫描。 锯齿扫描：用微小的正方形光束对斑点沿X方向进行锯齿形扫描，同时也沿Y方向缓慢地扫描，能测定斑点的全部面积。在组分斑点处会出现一个吸收峰。其记录的是样品吸收峰与空白峰的差。用未知样组分的峰面积和已知标准样的峰面积及上样量就可以计算出待测样品中组分的量。,结果确定 用未知样组分的峰面积和已知标准样的峰面积及上样量就可以计算出待测样品中组分的量。,注意：薄层板制备的均匀程度对定量分析的误差影响极大。,5.2.7 特殊型薄
32、层色谱,1、制备TLC 薄层色谱可以用于小量的样品的制备分离中。若要制备几十毫克样品，薄层色谱往往比柱色谱更快捷，分离效果也更佳。这时就要采用大尺寸的薄板，并且重复分离多次。 薄板的尺寸视展开槽而定，一般可以做成2020 cm或2040 cm。板也可以适当厚一些，以增大每块板的上样量。但也要注意板做得厚了，分离效果会下降。在2020 cm，厚0.5mm的薄层板上可以分离10-50mg样品。 点样方法也与分析型不同，不是点成一个点，而是沿薄板一边的1.5cm处，与此边平行地点成一条线，而且尽量点均匀。展开后，样品每一个组分出现一条带状。显色后，把所需组分对应的一条带括下，萃取，浓缩，收集。,2、
33、烧结薄层色谱,这是一种多次使用的薄层板，一般薄层板容易造成吸附层脱落，不易携带，而且只能用一次。现有商品化的烧结薄层色谱板，吸附层烧结在玻璃板或高聚物板上（是由200300石英或玻璃粉，与200300目硅胶或氧化铝按1：25重量混合，用乙醇调成浆料，涂在玻璃板上。0.250.3毫米厚，然后在700780高温下烧结，即成烧结板），便于携带，可以供定性定量用。而且使用后可以用乙醇或其它有机溶剂洗涤，最后用水先干净后烘干再继续使用。,分离后的组分应在浓缩后用薄层色谱或气相色谱或高效液相色谱作纯度检验。吸附剂最好在制板前用溶剂提取，以除去杂质，避免杂质带进分离后的组分中。,3、高效薄层色谱,高效薄层色
34、谱是在原有的基础上采用粒度更小（5-7m）及粒度分布范围更窄的吸附剂，配用特殊粘合剂制备成高效薄层色谱板来实现高效分离。它的特点是点样量少，展开时间短，斑点集中，分辨力高，检出下限小，达到Pg级，可供直接定量测定用。高效薄层色谱的展开时间只要3-20min，移行距离3-7cm即可获满意结果。,4、旋转TLC,让它在通入展开剂的情况下旋转，使样品展开而得到分离。,又称离心薄层色谱法 (centrifugal thin layer chromatography)。一种旋转离心、连续洗脱的径向薄层色谱技术。分离原理是基于样品在吸附剂和展开剂之间的吸附或分配作用的不同，以及离心力的作用，促使样品各组分
35、之间原有Rf值差异加大，因此提高了分离效果,加快分离速度。,5.2.8 TLC的特点,方法简便易行,价格低廉； 在色谱板上检测样品不会丢失组分； 分析快速； 检出灵敏度高； 分离能力强； 检测手段多样化； 应用广泛； 可选用不同种类分离材料,以适应不同分离的需求。,5.2.9 吸附薄层色谱的应用,吸附薄层色谱可用于定性和定量分析(1)研究合成反应进行过程(2)中草药分离提纯(3)未知物的鉴定(4)检验物质纯度(5)定量测定,TLC应用示例,药物“诺氟沙星”注射液中棕黄色沉淀物的鉴定,诺氟沙星的结构:,1-乙基-6-氟-4-氧代-1,4-二氢-7-(1-派嗪基)-3-喹啉羧酸,诺氟沙星经灭菌后，
36、往往产生棕色至棕色沉淀物，影响产品质量。人们应用现代分离分析手段对诺氟沙星中沉淀物进行了研究：,确定该沉淀物为诺氟沙星的脱羧产物，并对产生沉淀的原 因进行了分析，（结果表明：在诺氟沙星结构中，3-位碳上的 COOH，属于-酮酸类，它在酸性介质中易脱羧，若有金属离 子的存在，则可加速脱羧进程；若在酸性条件下，加温过高， 时间过长，也会加速脱羧进程，脱羧物慢慢沉淀下来，致使注 射液的透明度不合格。）这对诺氟沙星注射液以及喹诺酮类其 他药物的质量控制有指导意义。,其分析过程中有一步是薄层分析：,分别取沉淀物和诺氟沙星适量，加N,N-二甲基甲酰胺制成每1ml中约含2mg的溶液，在硅胶G或硅胶GF254
37、（加0.5%羧甲基纤维素钠制板）薄层板上点样13l，在氯仿-无水甲醇-浓氨水（15103）中展开，展距为1013cm，置紫外灯（254nm）下检视，结果见右图。图谱表明沉淀物的Rf值与诺氟沙星主斑点的Rf值不同。,诺氟沙星及其沉淀物的薄层色谱图 A-诺氟沙星 B-诺氟沙星沉淀物,5.3 纸色谱 (Paper chromatography),5.3.1 基本原理 纸色谱是一种以滤纸为支持物，以分配机理为主的色谱（此外，还涉及吸附和离子交换等机理），主要用于多官能团或高极性的亲水化合物如醇类、羟基酸、氨基酸、糖类和黄酮类等的分离。 滤纸是由几乎纯粹纤维素构成的。在水蒸汽饱和的空气中，它可以吸附20
38、25%的水分，其中约有67%的吸附水是通过氢键与纤维素的羟基结合而结合于纤维素上，一般较难脱去。这些吸附水就构成了色谱过程的固定相，滤纸只起到支持固定相的作用。作为分配色谱，其分离过程是依赖于萃取原理而实现的。,分配色谱的原理： 相当连续多次的液液萃取。与吸附色谱不同的是固定相和流动相均是液体，固定相的液体由其它固体材料（支持剂、载体或担体）来支持或载附，不随流动相的移动而移动。因此，物质的分离是依靠不同的物质在固定相和流动相之间以不同的分配系数（K）连续不断地形成分配平衡而实现的。 物质在薄层板上移动速度常用Rf值（比移值）表示，其定义是：,5.3.2 滤纸的要求与选择 滤纸的要求：质地细密
39、，厚薄均匀，平整，对光检测时透光度均匀，不得有污点，应有一定的强度，滤纸对溶剂的渗透速度适当，滤纸中不含有水溶性和有机溶剂可溶性杂质，对氨基酸分析有干扰的铜、铁元素的含量分别在1.5和10ppm以内。 常用滤纸：杭州新华造纸厂生产的定性滤纸、定量滤纸和层析滤纸（见下表），以新华1号滤纸最为普遍。如果需要加大点样量，可选择较厚的新华3号滤纸。使用进口滤纸最多的当属英国造的沃特曼（Whatman）1号滤纸。 滤纸的选择：一般选择中速滤纸。以正丁醇为主的展开剂，粘度较大，展开速度慢；以石油谜、氯仿等为主的溶剂展开速度较快。可据此结合实验要求来挑选快速、中速、慢速的滤纸。一般定性分析选用较薄的滤纸；厚
40、质滤纸往往作制备用。,滤纸裁剪及注意事项：需要条形状时，应顺着纤维排列的方向。在裁剪滤纸时，要把周边裁剪整齐，不能留毛边。还要注意防止手垢和汗渍等杂质污染滤纸。,5.3.3 展开溶剂的选择与配制 纸色谱溶剂系统的要求： 被分离的物质在该溶剂系统中比移值在0.050.85之间，而分离两个以上的混合物，相互间比移值最好大于0.05。检测物质纯度则比移位最好在0.40.6之间 溶剂的任一组分均不与目标物起化学反应。 纸层析所得斑点圆整，并且圆整程度不依点样多少而有差异 分离物质在溶剂系统中的分配比恒定，受温度变化小，而且容易迅速达到平衡。这样易得圆整的斑点，且无需恒温的实验条件 尽可能少用高沸点溶剂
41、 多元系统溶剂中，组成恒定，受温度变化小,展开系统的选择原则：多用极性的混合溶剂，且其中之一是水。在选择展开剂时，一般按照相似相溶原理进行。 如果被分离物质是易溶于水，但难溶于乙醇的的强亲水性的，如氨基酸、糖类等，可选用含水量在1040%之间的高含水量系统作为展开剂。 若物质是可溶于乙醇和水，且较易溶于乙醇的中等亲水性的，则宜采用中等含水量的溶剂系统作展开剂。 对于难溶于水，但易溶于亲脂性溶剂的物质，则展开剂主要组分是苯、环己烷、四氯化碳、甲苯等。 对于完全亲脂性物质如甾醇等，最好采用反相系统，即用甲酰胺、二甲基甲酰胺等浸渍滤纸作固定相，可用含水的醇或与此相近的溶剂作为流动相。 混合溶剂中有机
42、溶剂与含水量的变化规律：有机溶剂的极性越大，所配成的混合溶剂的有机相中含水量越高，反之，含水量越低。,混合溶剂的配制特例：如果混合液分层，则必须在充分振荡混合、静置分层之后，分出有机相作为展开剂。 分离酸性或碱性物质时溶剂系统：由于酸和碱的电离平衡现象，展开时必将产生拖尾现象。因此，通常在溶剂中加入较强的酸（如甲酸）或碱（如氨）来抑制弱酸或弱碱的电离。另一种常用方法就是在滤纸上喷上缓冲盐类，以保持一定的pH值，干后再展开。但必须注意，展开剂也必须事先用缓冲液平衡后再使用。,斑点拖尾现象的几种原因 点样量过多，样品量超过了点样处滤纸所荷载的溶剂能够溶解的能力。 某些物质可以形成多个电离形式，且各
43、自有其不同的Rf值，因而在纸上造成连续拖尾，这种情况可使用碱性或酸性的展开系统，抑制其电离即可消除。 被分离的物质与滤纸上的Cu2+、Ca2+、Mg2+等杂质形成络合物而形成拖尾，可改用纯滤纸展开。 某些物质在展开过程中会逐渐分解，如肾上腺素和某些含硫氨基酸等，可将它们转变成稳定的物质再作展开来克服。 当被分离的物质能溶于显色剂中时，如显色剂用量过多，可使斑点模糊或拖长。,5.3.4 操作 确定并标记点样位置点样滤纸饱和展开斑点检出 点样：距底边1520mm，点间距离约为812mm，样点直径为3mm左右。点好样品，风干或吹风机吹干。 饱和与展开：将滤纸悬吊于装有展开剂的色谱缸中，用盖盖好，静置
44、12h后将点样端垂直浸入展开剂中展开。溶剂的前沿升到接近滤纸顶端时，取出滤纸，立即用铅笔画出溶剂前沿所在位置，吹干。,纸色谱的上行展开法,纸色谱的下行展开法,显色：用喷壶距滤纸约3040cm向滤纸均匀喷洒显色剂，以滤纸基本打湿为宜。然后用吹风机热风缓缓吹干并加热滤纸，直到显示出紫色斑点为止。 测量Rf值与鉴定：用铅笔将所有斑点的轮廓描出来，并确定出各斑点的重心位置，该点即为斑点位置。分别量出点样点到溶剂前沿的距离和各斑点位置的距离，按照Rf值定义计算各斑点的Rf值。,5.4 吸附柱色谱,柱色谱是将吸附剂填充到一根玻璃管或金属管中进行的色谱技术。这种方法可以用来分离大多数有机化合物，尤其适合于复
45、杂的天然产物的分离。适用于分离和精制较大量的样品。,5.4.1 吸附剂与洗脱剂根据待分离组分的结构和性质选择合适的吸附剂和洗脱剂是分离成败的关键。 1 吸附剂的要求 对样品组分和洗脱剂都不会发生任何化学反应，在洗脱剂中也不会溶解。 对待分离组分能够进行可逆的吸附，同时具有足够的吸附力，使组分在固定相与流动相之间能最快地达到平衡。 颗粒形状均匀，大小适当，以保证洗脱剂能够以一定的流速（一般为1.5mLmin-1）通过色谱柱。 材料易得，价格便宜而且是无色的，以便于观察。 2 常用吸附剂的种类：氧化铝、硅胶、聚酰胺、硅酸镁、滑石粉、氧化钙（镁）、淀粉、纤维素、蔗糖和活性炭等。,3 几种常见吸附剂的
46、特性 （1）氧化铝：市售的层析用氧化铝有碱性、中性和酸性三种类型，粒度规格大多为100150目。 碱性氧化铝（pH 9-10）：适用于碱性物质（如胺、生物碱）和对酸敏感的样品（如缩醛、糖苷等），也适用于烃类、甾体化合物等中性物质的分离。但这种吸附剂能引起被吸附的醛、酮的缩合。酯和内酯的水解、醇羟基的脱水、乙酰糖的去乙酰化、维生素A和K等的破坏等不良副反应。所以，这些化合物不宜用碱性氧化铝分离。 酸性氧化铝（pH3.5-4.5）：适用于酸性物质如有机酸、氨基酸等以及色素和醛类化合物的分离。 中性氧化铝（pH7-7.5）：适用于醛、酮、醌、苷和硝基化合物以及在碱性介质中不稳定的物质如酯、内酯等的分
47、离，也可以用来分离弱的有机酸和碱等。,（2）硅胶：硅胶是硅酸的部分脱水后的产物，其成分是SiO2xH2O，又叫缩水硅酸。柱色谱用硅胶一般不含粘合剂。 适用范围：非极性和极性化合物，适用于芳香油、萜类、甾体、生物碱、强心甙、蒽醌类、酸性、酚性化合物、磷脂类、脂肪酸、氨基酸，以及一系列合成产品如有机金属化合物等。 （3）聚酰胺：色谱用聚酰胺主要有锦纶6（聚己内酰胺）和锦纶66（聚己二酰己二胺）两种，分子量一般在1600020000，其亲水性和亲脂性均较好，因此既可分离水溶性成份，也可分离脂溶性成分。可溶于浓盐酸、甲酸及热的乙酸、甲酰胺和二甲基甲酰胺中；微溶于乙酸和苯酚等；不溶于醇、氯仿、丙酮、乙醚
48、、苯等；对碱稳定，对强酸可水解。 聚酰胺色谱的原理：兼具吸附色谱和分配色谱的功能。采用强极性洗脱剂时主要为吸附色谱正相色谱；采用弱极性洗脱剂时主要为分配色谱反相色谱。,分离对象：能与聚酰胺形成氢键的化合物，如酚类、酸类、醌类、硝基化合物及含羟基、氨基、亚氨基的化合物及腈和醛等类化合物。 聚酰胺在水中吸附能力的规律： 形成氢键的基团(如：酚羟基、氨基、羧基、硝基等)越多， 则吸附力越强。如：丁二酸丁酸,形成氢键的位置与吸附力有很大关系。对位、间位酚羟基使吸附力增大，邻位使吸附力减小。如：芳香核、共轭双键多者吸附力大，少者吸附力小。如：,若形成分了内氢键，则使化合物的吸附力减小。如：（4）硅酸镁：中性硅酸镁的吸附特性介于氧化铝和硅胶之间，主要用于分离甾体化合物和某些糖类衍生物。为了得到中性硅酸镁，用前先用稀盐酸，然后用醋酸洗涤，最后用甲醇和蒸馏水彻底洗涤至中性。,4 吸附剂的活度及其调节吸附剂的活性取决于它们含水量的多少，活性最强的吸附剂含有最少的水。 吸附剂的活性一般分为五级，分别用、和表示。数字越大，表示活性越小，一般常用。 向吸附剂中添加一定的水，可以降低其活性。反之，如果用加热处理的方法除去吸附剂中的部分水，则可以增加其活性，后者称为吸附剂的活化。 各种不同活度吸附剂的含水量见下表。,
