1、第三章 层析技术 chromatography technology,层析法又称色层分析法或色谱法 1903-1906年，俄国植物学家M. Tswett首先系统提出来的。 将叶绿素的石油醚溶液通过CaCO3管柱，并继续以石油醚淋洗，由于CaCO3对叶绿素中各种色素的吸附能力不同，色素被逐渐分离，在管柱中出现了不同颜色的谱带或称色谱图（Chromatogram）。,1931年将该方法应用到分离复杂的有机混合物，人们才发现了它的广泛用途。 英国生物学家Martin和Synge，首先提出了色谱塔板理论。并根据液-液逆流萃取的原理，发明了液-液分配色谱。 他们预言：一、流动相可用气体代替液体，与液体相
2、比，物质间的作用力减小了，这对分离更有好处；二、使用非常细的颗粒填料并在柱两端施加较大的压差，应能得到最小的理论塔板高(即增加了理论塔板数)，这将会大大提高分离效率。,前者预见了气相色谱的产生，并在1952年诞生了气相色谱仪，它给挥发性的化合物的分离测定带来了划时代的变革； 后者预见了高效液相色谱（HPLC）的产生，在60年代末也为人们所实现。 Martin和Synge于1952年被授予诺贝尔化学奖。 如今的色层分析法经常用于分离无色的物质，已没有颜色这个特殊的含义。但色谱法或色层分析法这个名字仍保留下来沿用。现在我们简称为层析法或层析技术。,第三章 层析技术,第一节 层析的原理 第二节 层析
3、法的分类 第三节 层析法常用实验技术 第四节 柱层析的基本装置及基本操作 第五节 凝胶层析 第六节 离子交换层析 第七节 亲和层析,1.1 固定相 固定相是层析的一个基质。它可以是固体物质（如吸附剂、凝胶、离子交换剂等），也可以是液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液），这些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附、溶解、交换等作用。 固定相对层析的效果起着关键的作用。,第一节 层析的原理,1.2 流动相 在层析过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体等，都称为流动相。 柱层析中一般称为洗脱剂 薄层层析时称为展层剂。,1.3 分配系数 分配系数是指在一定的条件下，某种组分在固定
4、相和流动相中含量（浓度）的比值，常用K来表示。 K=Cs/Cm Cs: 固定相中的浓度Cm: 流动相中的浓度。 K为热力学常数：与组分性质、固定相性质、流动相性质及温度有关。实验条件固定，K仅与组分性质有关，是层析中分离纯化物质的主要依据,分配系数与温度的关系： lnK = (G0/RT) K为分配系数（或平衡常数），G0为标准自由能变化，R为气体常数，T为绝对温度 这是层析分离的热力学基础。一般情况下，层析时组分的G0为负值，则温度与分配系数成反比关系。 通常温度上升20，K值下降一半，它将导致组分移动速率增加。这也是为什么在层析时最好采用恒温柱的原因。 对于K值相近的不同物质，可通过改变温
5、度的方法，增大K值之间的差异，达到分离的目的。,1.4 保留时间tR 从进样开始到某组分色谱峰顶（浓度极大点）的时间，即组分在色谱柱中的停留时间或组分流经色谱柱所需要的时间。 1.5 死时间t0或tm 分配系数为零的组分的保留时间，即组分在流动相中的停留时间或流动相流经色谱柱所需要的时间（又称流动相保留时间）。,1.6 迁移率（或比移值） 在一定条件下，在相同的时间内某一组分在固定相移动的距离与流动相本身移动的距离之比值。常用Rf来表示。 Rf小于或等于1。 K增加，Rf减少；反之， K减少，Rf增加。,1.7 相对迁移率 在一定条件下，在相同时间内，某一组分在固定相中移动的距离与某一标准物质
6、在固定相中移动的距离之比值。 可以小于等于1，也可以大于1。 用Rx来表示。不同物质的分配系数或迁移率是不同的。分配系数或迁移率的差异程度是决定几种物质采用层析方法能否分离的先决条件。很显然，差异越大，分离效果越理想。,1.8 分辨率（或分离度） 相邻两个峰的分开程度。用Rs来表示。,Rs值越大，两种组分分离的越好。,Rs值越大，两种组分分离的越好。 当Rs = 1时，两组分具有较好的分离，互相沾染约2%，即每种组分的纯度约为98%。 当Rs=1.5时，两组分基本完全分开，每种组分的纯度可达到99.8%。 如果两种组分的浓度相差较大时，尤其要求较高的分辨率。,1.9 操作容量（或交换容量） 在
7、一定条件下，某种组分与基质（固定相）反应达到平衡时，存在于基质上的饱和容量，我们称为操作容量（或交换容量）。 数值越大，表明基质对该物质的亲合力越强。 同一种基质对不同种类分子的操作容量是不相同的，这主要是由于分子大小（空间效应）、带电荷的多少、溶剂的性质等多种因素的影响。 实际操作时，加入的样品量要尽量少些，特别是生物大分子，样品的加入量更要进行控制，否则用层析办法不能得到有效的分离。,第二节 层析法的分类,2.1 按两相所处状态分类,2.2 按层析原理分类,2.3 按操作形式不同分类,2.4 正相色谱与反相色谱 正相色谱是指固定相的极性高于流动相的极性，因此，在这种层析过程中非极性分子或极
8、性小的分子比极性大的分子移动的速度快，先从柱中流出来。 反相色谱是指固定相的极性低于流动相的极性，在这种层析过程中，极性大的分子比极性小的分子移动的速度快而先从柱中流出。 一般来说，分离纯化极性大的分子（带电离子等）采用正相色谱（或正相柱），而分离纯化极性小的有机分子（有机酸、醇、酚等）多采用反相色谱（或反相柱）。,第三节 层析法常用实验技术,3.1 纸层析（paper chromatography） 3.2 薄层层析（thin-layer chromatography，TLC） 3.3 离子交换层析（ion exchange chromatography） 3.4 亲和层析（affinity
9、 chromatography） 3.5 凝胶层析法（gel chromatography） 3.6 高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）： 3.7 气相色谱（gas chromatography，GC）,3.1 纸层析（paper chromatography） 纸层析是以滤纸作为支持物的分配层析。 滤纸纤维与水有较强的亲和力，能吸收22%左右的水，其中6%7%的水是以氢键形式与纤维素的羟基结合。 滤纸纤维与有机溶剂左右的亲和力很弱。 滤纸纤维及其结合的水作为固定相，有机溶剂作为流动相。,纸层析对混合物进行分离时，发生两种作用
10、，混合物的彼此分离是这两种因素共同作用的结果。 第一种是溶质在结合于纤维上的水与流过滤纸的有机相进行分配（即液-液分离） 第二种是滤纸纤维对溶质的吸附及溶质溶解于流动相的不同分配比进行分配（即固-液分配）。,双向纸层析法 在样品所含溶质较多或某些组分在单相纸层析中的Rf比较接近，不易明显分离时采用此法。 该法是将滤纸在某一特殊的溶剂系统中按一个方向展层以后，即予以干燥。 转向90度，在另一溶剂系统中进行展层，待溶剂到达所要求的距离后，取出滤纸，干燥显色，从而获得双向层析谱。 纸层析还可以与区带电泳法结合，能获得更有效的分离方法，这种方法称为指纹谱法。,3.2 薄层层析（thin-layer c
11、hromatography，TLC） 薄层层析是在玻璃板上涂布一层支持剂，待分离样品点在薄层板一端，然后让推动剂从上流动，从而使各组分得到分离的物理方法。 常用的支持剂有：硅胶G、硅胶GF、氧化铝、纤维素、硅藻土、硅胶G硅藻土、纤维素G、DEAE-纤维素、交联葡聚糖凝胶等。 使用的支持剂种类不同，其分离原理也不尽相同，有分配层析、吸附层析、离子交换层析、凝胶层析等多种。,薄层层析设备简单，操作简单，快速灵敏。 改变薄层厚度，既能作分析鉴定，又能做少量制备。 配合薄层扫描仪，可以同时做到定性定量分析，在生物化学、植物化学等领域是一类广泛应用的物质分离方法。,3.3 离子交换层析（ion exch
12、ange chromatography） 离子交换层析是利用离子交换剂上的可交换离子与周围介质中被分离的各种离子间的亲和力不同，经过交换平衡达到分离的目的的一种柱层析法。 该法可以同时分析多种离子化合物，具有灵敏度高，重复性、选择性好，分离速度快等优点，是当前最常用的层析法之一。 常用于多种离子型生物分子的分离，包括蛋白质、氨基酸、多肽及核酸等。,3.4 亲和层析（affinity chromatography） 亲和层析是利用某些生物分子之间专一可逆结合特性、高度专一的吸附层析类型。 固体基质具有一个与之共价相连的特殊结合分子（如配位体），连接后的配体对互补分子的亲和力不会改变。 配体是发生
13、亲和反应的功能部位，也是载体和被亲和分子之间的桥梁。配体本身必须有两个基团：一个能与载体共价结合，一个能与被亲和分子结合。 配基的固定化方法有载体结合法、物理吸附法、交联法和包埋法等四类方法。,3.5 凝胶层析法（gel chromatography） 凝胶层析法也称分子筛层析法，是指混合物随流动相经过凝胶层析柱时，其中各组分按其分子大小不同而被分离的技术。 该法设备简单、操作方便、重复性好、样品回收率高，除常用于分离纯化蛋白质、核酸、多糖、激素等物质外，还可以用于测定蛋白质的相对分子质量，以及样品的脱盐和浓缩等。 常用的凝胶类型有：交联葡聚糖凝胶，琼脂糖凝胶，聚丙烯酰胺凝胶等。,3.6 高效
14、液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）： 高效液相色谱是一种多用途的层析方法，可以使用多种固定相和流动相，并可以根据特定类型分子的大小、极性、可溶性或吸收特性的不同将其分离开来。 核心部件是耐高压的色谱柱。通常由不锈钢制成，并且所有的组成元件、阀门等都是用可耐高压的材料制成。,溶剂运送系统的选择取决于：等度（无梯度）分离：在整个分析过程中只使用一种溶剂（或混合溶剂）；梯度洗脱分离：使用一种微处理机控制的梯度程序来改变流动相的组分，该程序可通过混合适量的两种不同物质来产生所需要的梯度。 由于HPLC的高速、灵敏和多用途等优点，它成为许多
15、生物小分子分离所选择的方法，常用的是反相分配层析法。,3.7 气相色谱（gas chromatography，GC） 现代的气相色谱使用长达50m的毛细管层析柱（内径为0.10.5mm）。 固定相通常为一种交联的硅多体，附着在毛细管内壁成一层膜。在正常操作温度下，其性质类似于液体膜，但要结实的多。 流动相（载气）通常为氮气或氢气。 大多数生物大分子的分离受柱温的影响。柱温有时在分析过程中维持恒定（通常50250），更常见的为设定一个增温的程序（如以每分钟10的速度从50升高到250）。,样品通过一个包含有气紧阀门的注射孔注入柱顶部。 柱中的产物可用下列方法检测出： 1) 火焰离子检测法：流出气
16、体通过一种可使任何有机复合物离子化的火焰，被固定在火焰顶部附近的电极所检测。 2) 电子捕获法：使用一种发射射线的放射性同位素作为离子化的方式。可以检测极微量（pmol）的亲电复合物。 3) 分光光度计法：包括质谱分析法（GC-MS）和远红光谱分析法（GC-IR）。 4) 电导法：流出气体中的组成成分的改变会引起铂电缆电阻的变化。,第四节 柱层析的基本装置及基本操作,柱层析的基本装置,4.1,4.2 柱层析的基本操作 装柱 平衡 加样 洗脱 收集、鉴定及保存 基质（吸附剂、交换树脂或凝胶等）的再生, 装柱 根据层析的基质和分离目的选好柱子。一般柱子的直径与长度比为1:1050；凝胶柱可以选1:
17、100200，同时将柱子洗涤干净。 将层析用的基质（如吸附剂、树脂、凝胶等）在适当的溶剂或缓冲液中溶胀，并用适当浓度的酸（0.5N1N）、碱（0.5N1N）、盐（0.5M1M）溶液洗涤处理，以除去其表面可能吸附的杂质。 然后用去离子水（或蒸馏水）洗涤干净并真空抽气（吸附剂等与溶液混合在一起），以除去其内部的气泡。,关闭层析柱出水口，并装入1/3柱高的缓冲液，并将处理好的吸附剂等缓慢地倒入柱中，使其沉降约3cm高。 打开出水口，控制适当流速，使吸附剂等均匀沉降，并不断加入吸附剂溶液。（吸附剂的多少根据分离样品的多少而定。）注意不能干柱、分层，否则必须重新装柱。 最后使柱中基质表面平坦并在表面上留
18、有23cm高的缓冲液，同时关闭出水口。（采用机械化装柱法在此省略。）, 平衡 柱子装好后，要用所需的缓冲液（有一定的pH和离子强度）平衡柱子。 用恒流泵在恒定压力下走柱子（平衡与洗脱时的压力尽可能保持相同）。 平衡液体积一般为35倍柱床体积，以保证平衡后柱床体积稳定及基质充分平衡。 如果需要，可用兰色葡聚糖2000在恒压下走柱，如色带均匀下降，则说明柱子是均匀的。 有时柱子平衡好后，还要进行转型处理。如离子交换层析。, 加样 加样量的多少直接影响分离的效果。 加样时应缓慢小心地将样品溶液加到固定相表面，尽量避免冲击基质，以保持基质表面平坦。 一般讲，加样量尽量少些，分离效果比较好。 通常加样量
19、应少于20%的操作容量，体积应低于5%的床体积，对于分析性柱层析，一般不超过床体积的1%。 最大加样量必须在具体条件下多次试验后决定。, 洗脱 洗脱的方式可分为简单洗脱、分步洗脱和梯度洗脱三种。 简单洗脱：柱子始终用同样的一种溶剂洗脱，直到层析分离过程结束为止。如果被分离物质对固定相的亲合力差异不大，其区带的洗脱时间间隔（或洗脱体积间隔）也不长，采用这种方法是适宜的。 分步洗脱：这种方法按照递增洗脱能力顺序排列的几种洗脱液，进行逐级洗脱。它主要对混合物组成简单、各组分性质差异较大或需快速分离时适用。每次用一种洗脱液将其中一种组分快速洗脱下来。,梯度洗脱：当混合物中组分复杂且性质差异较小时，一般
20、采用梯度洗脱。它的洗脱能力是逐步连续增加的，梯度可以指浓度、极性、离子强度或pH值等。最常用的是浓度梯度。 在水溶液中，亦即离子强度梯度。可形成梯度的形式有三种，如下页图所示。,洗脱条件的选择，也是影响层析效果的重要因素。当对所分离的混合物的性质了解较少时，一般先采用线性梯度洗脱的方式去尝试，但梯度的斜率要小一些，尽管洗脱时间较长，但对性质相近的组分分离更为有利。同时还应注意洗脱时的速率。,流速的快慢将影响理论塔板高度，从而影响分辨率。事实上，速度太快，各组分在固液两相中平衡时间短，相互分不开，仍以混合组分流出。速度太慢，将增大物质的扩散，同样达不到理想的分离效果。只有多次试验才会得到合适的流
21、速。,总之，我们必须经过反复的试验与调整（可以用正交试验或优选法），才能得到最佳的洗脱条件。还应强调的一点是，在整个洗脱过程中，千万不能干柱，否则分离纯化将会前功尽弃。, 收集、鉴定及保存 在生化实验中，基本上我们都是采用部分收集器来收集分离纯化的样品。 由于检测系统的分辨率有限，洗脱峰不一定能代表一个纯净的组分。因此，每管的收集量不能太多，一般1ml-5ml / 管。如果分离的物质性质很相近，可低至0.5ml / 管。,在合并一个峰的各管溶液之前，还要进行鉴定。 例如，一个蛋白峰的各管溶液，我们要先用电泳法对各管进行鉴定。 对于是单条带的，认为已达电泳纯，合并在一起。其他的另行处理。 对于不
22、同种类的物质采用相应的鉴定方法。为了保持所得产品的稳定性与生物活性，我们一般采用透析除盐、超滤或减压薄膜浓缩，再冰冻干燥，得到干粉，在低温下保存备用。, 基质的再生 许多基质（吸附剂、交换树脂或凝胶等）价格昂贵，可以反复使用多次，所以层析后要回收处理，以备再用，严禁乱倒乱扔。这也是一个科研工作者的科学作风问题。 各种基质的再生方法可参阅具体层析实验及有关文献。,第五节 凝胶层析,5.1 凝胶层析简介 5.2 凝胶层析的基本原理 5.4 凝胶的种类和性质 5.3 凝胶层析的基本概念 5.5 凝胶的选择、处理和保存 5.6 凝胶层析操作中应注意的问题 5.7 凝胶层析的应用,5.1 凝胶层析简介
23、凝胶层析（gel chromatography）又称为凝胶排阻层析（gel exclusion chromatography）、分子筛层析（molecular sieve chromatography）、凝胶过滤（gel filtration）、凝胶渗透层析（gel permeation chromatography）等。 它是以多孔性凝胶填料为固定相，按分子大小顺序分离样品中各个组分的液相色谱方法。,1959年，Porath和Flodin首次用一种多孔聚合物交联葡聚糖凝胶作为柱填料，分离水溶液中不同分子量的样品，称为凝胶过滤。 1964年，Moore制备了具有不同孔径的交联聚苯乙烯凝胶，能够
24、进行有机溶剂中的分离，称为凝胶渗透层析（流动相为有机溶剂的凝胶层析一般称为凝胶渗透层析）。 随后这一技术得到不断的完善和发展，目前广泛的应用于生物化学、高分子化学等很多领域。 凝胶层析广泛用于蛋白质（包括酶）、核酸、多糖等生物分子的分离纯化，同时还应用于蛋白质分子量的测定、脱盐、样品浓缩等。,5.2 凝胶层析的基本原理,凝胶层析是依据分子大小这一物理性质进行分离纯化的。层析过程如图 所示。凝胶层析的固定相是惰性的珠状凝胶颗粒，凝胶颗粒的内部具有立体网状结构，形成很多孔穴。当含有不同分子大小的组分的样品进入凝胶层析柱后，各个组分就向固定相的孔穴内扩散，组分的扩散程度取决于孔穴的大小和组分分子大小
25、。比孔穴孔径大的分子不能扩散到孔穴内部，完全被排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间随流动相向下流动，它们经历的流程短，流动速度快，所以首先流出；而较小的分子则可以完全渗透进入凝胶颗粒内部，经历的流程长，流动速度慢，所以最后流出；而分子大小介于二者之间的分子在流动中部分渗透，渗透的程度取决于它们分子的大小，所以它们流出的时间介于二者之间，分子越大的组分越先流出，分子越小的组分越后流出。这样样品经过凝胶层析后，各个组分便按分子从大到小的顺序依次流出，从而达到了分离的目的。,Gel structure,AGAROSE,A good gel for gel filtration contains abo
26、ut95% water,Gel structure,Agarose,Dextran,A hypothetical structure for Superdex,Steric exclusion,Molecules are excluded from the gel bead to different extents according to their sizes,Gel bead,Very large molecules are completely excluded,Very small ones get everywhere,5.3 凝胶层析的基本概念 5.3.1 外水体积、内水体积、基
27、质体积、柱床体积、洗脱体积 5.3.2 分配系数 5.3.3 排阻极限 5.3.4 分级分离范围 5.3.5 吸水率和床体积 5.3.6 凝胶颗粒大小,VtVoViVg 由于Vg相对很小，可以忽略不计，则有： VtVoVi,洗脱体积（Ve）是指将样品中某一组分洗脱下来所需洗脱液的体积。,5.3.1 洗脱体积及其他,外水体积是指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积，也就是凝胶颗粒间液体流动相的体积。内水体积是指凝胶颗粒中孔穴的体积，凝胶层析中固定相体积就是指内水体积。基质体积是指凝胶颗粒实际骨架体积。而柱床体积就是指凝胶柱所能容纳的总体积。洗脱体积是指将样品中某一组分洗脱下来所需洗脱液的体积。我们设柱
28、床体积为Vt，外水体积为Vo，内水体积为Vi，基质体积为Vg，则有： VtVoViVg 由于Vg相对很小，可以忽略不计，则有： VtVoVi,设洗脱体积为Ve，Ve一般是介于Vo 和Vt之间的。对于完全排阻的大分子，由于其不进入凝胶颗粒内部，而只存在于流动相中，故其洗脱体积VeVo；对于完全渗透的小分子，由于它可以存在于凝胶柱整个体积内（忽略凝胶本身体积Vg），故其洗脱体积VeVt。分子量介于二者之间的分子，它们的洗脱体积也介于二者之间。有时可能会出现Ve Vt，这是由于这种分子与凝胶有吸附作用造成的。凝胶层析中的几种洗脱峰如图 所示：,Ve:洗脱体积,柱床体积Vt可以通过加入一定量的水至层析
29、柱预定标记处，然后测量水的体积来测定。 外水体积Vo可以通过测定完全排阻的大分子物质的洗脱体积来测定，一般常用蓝色葡聚糖-2000作为测定外水体积的物质。因为它的分子量大（为200万），在各种型号的凝胶中都被排阻，并且它呈蓝色，易于观察和检测。,5.3.2 分配系数 分配系数是指某个组分在固定相和流动相中的浓度比。 对于凝胶层析，分配系数实质上表示某个组分在内水体积和在外水体积中的浓度分配关系。在凝胶层析中，分配系数通常表示为：Kav=(Ve-V0)/(Vt-V0) 完全排阻的大分子，VeVo，故Kav0。 完全渗透的大分子，VeVt，故Kav1。 一般Kav值在01之间。如果Kav值大于1，
30、则表示这种物质与凝胶有吸附作用。,对于某一型号的凝胶，在一定的分子量范围内，各个组分的Kav与其分子量的对数成线性关系： Kavblg MWc 其中b、c为常数，MW表示物质的分子量。 由于Ve和Kav也成线性关系，所以同样有： Veblg MWc 其中b、c为常数。 用已知分子量的标准物质进行洗脱，分别测定Ve或Kav，并根据上述的线性关系绘出标准曲线，然后在相同的条件下测定未知物的Ve或Kav，通过标准曲线即可求出其分子量。,5.3.3 排阻极限 排阻极限是指不能进入凝胶颗粒孔穴内部的最小分子的分子量。所有大于排阻极限的分子都不能进入凝胶颗粒内部，直接从凝胶颗粒外流出，所以它们同时被最先洗
31、脱出来。 排阻极限代表一种凝胶能有效分离的最大分子量，大于这种凝胶的排阻极限的分子用这种凝胶不能得到分离。 例如Sephadex G-50的排阻极限为30,000，它表示分子量大于30,000的分子都将直接从凝胶颗粒之外被洗脱出来。,5.3.4 分级分离范围 表示一种凝胶适用的分离范围，对于分子量在这个范围内的分子，用这种凝胶可以得到较好的线性分离。 例如Sephadex G-75对球形蛋白的分级分离范围为3,00070,000，它表示分子量在这个范围内的球形蛋白可以通过Sephadex G-75得到较好的分离。 对于同一型号的凝胶，球形蛋白与线形蛋白的分级分离范围是不同的。,5.3.5 吸水
32、率和床体积 吸水率是指1g干的凝胶吸收水的体积或者重量，但它不包括颗粒间吸附的水份。所以它不能表示凝胶装柱后的体积。 床体积是指1g干的凝胶吸水后的最终体积。,5.3.6 凝胶颗粒大小 层析用的凝胶一般都成球形，颗粒的大小通常以目数（mesh）或者颗粒直径（mm）来表示。 柱子的分辨率和流速都与凝胶颗粒大小有关。 颗粒大，流速快，但分离效果差；颗粒小，分离效果较好，但流速慢。一般比较常用的是100200目。,5.4 凝胶的种类和性质 凝胶的种类很多，常用的凝胶主要有： 葡聚糖凝胶（dextran） 聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide） 琼脂糖凝胶（agarose） 以及聚丙烯酰胺和琼
33、脂糖之间的交联物。 另外还有多孔玻璃珠、多孔硅胶、聚苯乙烯凝胶等等。,5.4.1 葡聚糖凝胶 葡聚糖凝胶是指由天然高分子（葡聚糖）与其它交联剂交联而成的凝胶。葡聚糖凝胶主要由Pharmacia Biotech生产。常见的有两大类，商品名分别为Sephadex和Sephacryl。 葡聚糖凝胶中最常见的是Sephadex系列，它是葡聚糖与3-氯-1,2环氧丙烷（交联剂）相互交联而成，交联度由环氧氯丙烷的百分比控制。,Sephadex 的主要型号是G-10 G-200，后面的数字是凝胶的吸水率（单位是ml / g干胶）乘以10。如Sephadex G-50，表示吸水率是5ml/g干胶。 Sepha
34、dex的亲水性很好，在水中极易膨胀，不同型号的Sephadex的吸水率不同，它们的孔穴大小和分离范围也不同。数字越大的，排阻极限越大，分离范围也越大。Sephadex中排阻极限最大的G-200为6105。,Sephadex在水溶液、盐溶液、碱溶液、弱酸溶液以及有机溶液中都是比较稳定的，可以多次重复使用。 Sephadex稳定工作的pH一般为210。强酸溶液和氧化剂会使交联的糖苷键水解断裂，所以要避免Sephadex与强酸和氧化剂接触。 Sephadex在高温下稳定，可以煮沸消毒，在100 下40 min对凝胶的结构和性能都没有明显的影响。,Sephadex含有羟基基团，呈弱酸性，可与分离物中的
35、一些带电基团（尤其是碱性蛋白）发生吸附作用。但一般在离子强度大于0.05的条件下，几乎没有吸附作用。 Sephadex进行凝胶层析实验时常使用一定浓度的盐溶液作为洗脱液，避免其与蛋白发生吸附。 盐浓度不宜过高，否则会引起凝胶柱床体积发生较大的变化。 Sephadex G-25和G-50中分别加入羟丙基基团反应，形成LH型烷基化葡聚糖凝胶，主要型号为Sephadex LH-20和LH-60，适用于以有机溶剂为流动相，分离脂溶性物质，例如胆固醇、脂肪酸激素等。,Sephadex有各种颗粒大小（一般有粗、中、细、超细）可以选择，一般粗颗粒流速快，但分辨率较差；细颗粒流速慢，但分辨率高。要根据分离要求
36、来选择颗粒大小。 Sephadex的机械稳定性相对较差，它不耐压，分辨率高的细颗粒要求流速较慢，所以不能实现快速而高效的分离。,Sephacryl是葡聚糖与甲叉双丙烯酰胺（N, N-methylenebisacrylamide）交联而成。是一种比较新型的葡聚糖凝胶。 Sephacryl的优点就是它的分离范围很大，排阻极限甚至可以达到108，远远大于Sephadex的范围。 不仅可以用于分离一般蛋白，也可以用于分离蛋白多糖、质粒、甚至较大的病毒颗粒。,Sephacryl与Sephadex相比另一个优点就是它的化学和机械稳定性更高：Sephacryl在各种溶剂中很少发生溶解或降解，可以用各种去污剂
37、、胍、脲等作为洗脱液，耐高温。 Sephacryl稳定工作的pH一般为311。 Sephacryl的机械性能较好，可以以较高的流速洗脱，比较耐压，分辨率也较高，所以Sephacryl相比Sephadex可以实现相对比较快速而且较高分辨率的分离。,5.4.2 聚丙烯酰胺凝胶 聚丙烯酰胺凝胶是丙烯酰胺（acrylamide）与甲叉双丙烯酰胺交联而成。改变丙烯酰胺的浓度，就可以得到不同交联度的产物。 主要由Bio-Rad Laboratories生产，商品名为Bio-Gel P，主要型号有Bio-Gel P-2 Bio-Gel P-300等10种，后面的数字基本代表它们的排阻极限的10-3，所以数字
38、越大，可分离的分子量也就越大。 聚丙烯酰胺凝胶的分离范围、吸水率等性能基本近似于Sephadex。排阻极限最大的Bio-Gel P-300为4105。,聚丙烯酰胺凝胶在水溶液、一般的有机溶液、盐溶液中都比较稳定。 聚丙烯酰胺凝胶在酸中的稳定性较好，在pH为110之间比较稳定。 在较强的碱性条件下或较高的温度下，聚丙烯酰胺凝胶易发生分解。 聚丙烯酰胺凝胶非常亲水，基本不带电荷，吸附效应较小。对芳香族、酸性、碱性化合物可能略有吸附作用，使用离子强度略高的洗脱液就可以避免。 聚丙烯酰胺凝胶不会象葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶那样可能生长微生物。,5.4.3 琼脂糖凝胶 琼脂糖是从琼脂中分离出来的天然线性多糖
39、，它是琼脂去掉其中带电荷的琼脂胶得到的。琼脂糖是由D半乳糖（D-galactose）和3,6脱水半乳糖（anhydrogalactose）交替构成的多糖链。 它在100时呈液态，当温度降至45以下时，多糖链以氢键方式相互连接形成双链单环的琼脂糖，经凝聚即成为束状的琼脂糖凝胶。 琼脂糖凝胶的商品名因生产厂家不同而异，常见的主要有Pharmacia Biotech生产的Sepharose（2B 4B）和Bio-Rad Laboratories生产的Bio-gel A等。,琼脂糖凝胶对样品的吸附作用很小。 琼脂糖凝胶在pH为49之间是稳定的，它在室温下很稳定，稳定性要超过一般的葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺
40、凝胶。 琼脂糖凝胶的机械强度和孔穴的稳定性都很好，一般好于前两种凝胶，在高盐浓度下，柱床体积一般不会发生明显变化，使用琼脂糖凝胶时洗脱速度可以比较快。 琼脂糖凝胶的排阻极限很大，分离范围很广，适合于分离大分子物质，但分辨率较低。 琼脂糖凝胶不耐高温，使用温度以030为宜。,Sepharose与2,3二溴丙醇反应，形成Sepharose CL型凝胶（CL-2B CL-4B） 分离特性基本没有改变，但热稳定性和化学稳定性都有所提高，可以在更广泛的pH范围内应用，稳定工作的pH范围为313。 Sepharose CL型凝胶还特别适合于含有有机溶剂的分离。,5.4.4 聚丙烯酰胺和琼脂糖交联凝胶 这类
41、凝胶是由交联的聚丙烯酰胺和嵌入凝胶内部的琼脂糖组成。它们主要由LKB提供，商品名为Ultragel。 由于含有聚丙烯酰胺，所以有较高分辨率；而它又含有琼脂糖，这使得它又有较高的机械稳定性，可以使用较高的洗脱速度。 调整聚丙烯酰胺和琼脂糖的浓度可以使Ultragel有不同的分离范围。,5.4.5 多孔硅胶、多孔玻璃珠 这类凝胶是由硅胶或玻璃制成具有一定直径的网孔状结构的球形颗粒。 属于硬质无机凝胶，最大的特点是机械强度很高、化学稳定性好，使用方便而且寿命长。 无机胶一般柱效较低，但用微粒的多孔硅胶制成的HPLC柱也可以有很高的柱效，可以达到4104塔板/米。 多孔玻璃珠易破碎，不能填装紧密，柱效
42、相对较低。,多孔硅胶和多孔玻璃珠的分离范围都比较宽 多孔硅胶一般为1025106 多孔玻璃珠一般为31039106。 最大缺点是吸附效应较强（尤其是多孔硅胶），可能会吸附比较多的蛋白，但可以通过表面处理和选择洗脱液来降低吸附。 另一个缺点是它们也不能用于强碱性溶液，一般使用时pH应小于8.5。,另外值得一提的是各类凝胶技术近年来发展得很快，目前已研制出很多性能优越的新型凝胶。 例如Pharmacia Biotech的Superdex和Superrose Superdex的分辨率非常高，化学物理稳定性也很好，可以用于FPLC、HPLC分析。 Superose的分离范围很广，分辨率较高，可以一次性
43、的分离分子量差异较大的混合物。同时它的机械稳定性也很好。,5.5 凝胶的选择、处理和保存 5.5.1 凝胶的选择 分离范围 凝胶颗粒的大小 实验条件,一方面，根据分离范围来选择合适型号的凝胶 一般的凝胶层析实验可以分为两类：分组分离（group separations）和分级分离（fractionations） 分组分离是指将样品混合物按分子量大小分成两组，一组分子量较大，另一组分子量较小。例如蛋白样品的脱盐或蛋白、核酸溶液去除小分子杂质以及一些注射剂去除大分子热源物质等等。 分级分离是指将一组分子量比较接近的组分分开。,选择凝胶另外一个方面就是凝胶颗粒的大小 颗粒小，分辨率高，但相对流速慢，
44、实验时间长，有时会造成扩散现象严重。 颗粒大，流速快，分辨率较低但条件得当也可以得到满意的结果。选择时要依据分离的具体情况而定， 例如样品中各个组分差别较大，则可以选用大颗粒的凝胶，这样可以很快的达到分离的目的；如果有个别组分差别较小，则要考虑使用小颗粒凝胶以提高分辨率。,由于凝胶一般都比较稳定，所以它在一般的实验条件下都可以正常的工作。 如果实验条件比较特殊，如在较强的酸碱中进行或含有有机溶剂等等，则要仔细查看凝胶的工作参数，选择合适的类型的凝胶。,5.5.2 凝胶的处理 1、估算出凝胶的用量 由于市售的葡聚糖凝胶和丙烯酰胺凝胶通常是无水的干胶，所以要计算干胶用量：,由于凝胶处理过程以及实验
45、过程可能有一定损失，所以一般凝胶用量在计算的基础上再增加1020。,2、干胶的膨化 一般吸水率较小的凝胶（即型号较小、排阻极限较小的凝胶）膨化时间较短，在20条件下需34小时 吸水率较大的凝胶（即型号较大、排阻极限较大的凝胶）膨化时间则较长，20条件下需十几个到几十个小时。 如Sephadex G-100以上的干胶膨化时间都要在72小时以上。如果加热煮沸，则膨化时间会大大缩短，一般在15小时即可完成，而且煮沸也可以去除凝胶颗粒中的气泡。,琼脂糖凝胶和有些市售凝胶是水悬浮的状态，所以不需膨化处理。 外多孔玻璃珠和多孔硅胶也不需膨化处理。3、纯化和排除气泡 纯化可以反复漂洗，倾泻去除表面的杂质和不
46、均一的细小凝胶颗粒。也可以一定的酸或碱浸泡一段时间，再用水洗至中性。 排除凝胶中的气泡可以通过抽气或加热煮沸的方法排除气泡。,5.5.3 凝胶的保存 凝胶的保存一般是反复洗涤去除蛋白等杂质，然后加入适当的抗菌剂，通常加入0.02的叠氮化钠，4下保存。 如果要较长时间的保存，则要将凝胶洗涤后脱水、干燥，可以将凝胶过滤抽干后浸泡在50的乙醇中脱水，抽干后再逐步提高乙醇浓度反复浸泡脱水，至95乙醇脱水后将凝胶抽干。置于60烘箱中烘干，即可装瓶保存。 膨化的凝胶不能直接高温烘干，否则可能会破坏凝胶的结构。,5.6 凝胶层析操作中应注意的问题 5.6.1 层析柱的选择 5.6.2 凝胶柱的鉴定 5.6.
47、3 洗脱液的选择 5.6.4 加样量 5.6.5 洗脱速度,5.6.1 层析柱的选择 层析柱大小主要是根据样品量的多少以及对分辨率的要求来进行选择。 一般来讲，主要是层析柱的长度对分辨率影响较大，长的层析柱分辨率要比短的高；但层析柱长度不能过长，否则会引起柱子不均一、流速过慢等实验上的一些困难。 一般柱长度不超过100cm，为得到高分辨率，可以将柱子串联使用。 层析柱的直径和长度比一般在1:251:100之间。 用于分组分离的凝胶柱，如脱盐柱由于对分辨率要求较低，所以一般比较短。,5.6.2 凝胶柱的鉴定 柱填装后肉眼观察应均匀、无纹路、无气泡。 通常可以采用一种有色的物质，如蓝色葡聚糖-20
48、00、血红蛋白等上柱，观察有色区带在柱中的洗脱行为以检测凝胶柱的均匀程度。 如果色带狭窄、平整、均匀下降，则表明柱中的凝胶填装情况较好，可以使用。 如果色带弥散、歪曲，则需重新装柱。 有时为了防止新凝胶柱对样品的吸附，可以用一些物质预先过柱，以消除吸附。,5.6.3 洗脱液的选择 由于凝胶层析的分离机理简单以及凝胶稳定工作的pH范围较广，所以洗脱液的选择主要取决于待分离样品。 一般来说只要能溶解被洗脱物质并不使其变性的缓冲液都可以用于凝胶层析。 为了防止凝胶可能有吸附作用，一般洗脱液都含有一定浓度的盐。,5.6.4 加样量 加样要尽量快速、均匀。 加样过多，会造成洗脱峰的重叠，影响分离效果。
49、加样过少，提纯后各组分量少、浓度较低，实验效率低。 分级分离时，加样体积约为凝胶柱床体积的15左右，而分组分离时加样体积约为凝胶柱床体积的1025。,5.6.5 洗脱速度 一般洗脱速度要恒定而且合适。通常有两种方法：恒流泵和恒压重力洗脱。 洗脱速度取决于很多因素，包括柱长、凝胶种类、颗粒大小等。 一般来讲，洗脱速度慢一些样品可以与凝胶基质充分平衡，分离效果好。 洗脱速度过慢会造成样品扩散加剧、区带变宽，反而会降低分辨率，且实验时间会大大延长。 一般凝胶的流速是210 cm / h，市售的凝胶一般会提供一个建议流速，可供参考。,5.7 凝胶层析的应用 5.7.1 生物大分子的纯化 5.7.2 分子量测定 5.7.3 脱盐及去除小分子杂质 5.7.4 去热源物质 5.7.5 溶液的浓缩,5.7.4 去热源物质 热源物质是指微生物产生的某些多糖蛋白复合物等使人体发热的物质。 它们是一类分子量很大的物质，所以可以利用凝胶层析的排阻效应将这些大分子热源物质与其它相对分子量较小的物质分开。 例如对于去除水、氨基酸、一些注射液中的热源物质，凝胶层析是一种简单而有效的方法。,
