1、食品中甜蜜素的研究 -紫外光度法测定其含量,主讲人：曾秋莲组员：覃小洁、赵方霞、 廖秀芬、王静敏,目录,一、前言二、实验三、结果与讨论四、实验优化五、实验的优缺点,一、前言,1.甜蜜素简介：甜蜜素的化学名称为环己基氨基磺酸钠(或钙)，是食品生产中常用的添加剂。英文名为Sodium cyclamate，化学式为C6H12N03SNa，其结构式见图1.2。,甜蜜素纯品为白色粉末状物质，相对分子量为201.22，酸式物为白色结晶或粉末，无臭或几乎无臭，有甜味，熔点为159一170C，易溶于水，极微溶解于乙酸，在光、热、空气中稳定，具有耐酸碱、不吸潮等优良特性，甜度是蔗糖的30-80倍，甜度纯正、风味
2、自然，在食品加工中具有较好的稳定性，可以代替蔗糖或与蔗糖混合使用，能高度保持食品原有的风味，并能延长食品的保存时间。,本品常与糖精钠混合使用，可增强甜度并 减少糖精的后苦味，同时降低成本。因此 甜蜜素可广泛用于调味品、果酱、果冻、 冰淇淋、糕点、蜜饯、饮料等食品，同时 还可以与其它甜味剂混合使用，在医药上 可用于糖尿病、肥胖症等患者的甜食。到 目前为止，我国等40多个国家允许在各类 食品中使用。,加了甜蜜素的蛋糕,2、甜蜜素的历史发展进程,1949年美国最早批准用于食品，其问题是目前对甜蜜素的致癌性尚无定论。1969年有人报道高浓度的甜蜜素与糖精钠的混合剂可以导致大鼠膀肤癌。20世纪70年代，
3、甜蜜素因被怀疑可以代谢生成环己胺而有致癌性，在美国、英国等国家禁用。1982年JECFA经多项长期实验认为甜蜜素没有致膀肤癌性。1986年美国国家科学研究会和国家科学院(NRC/NAS)报告本品有促进和致癌的可能。1987年我国批准使用甜蜜素，主要用于蜜饯、糕点、饮料、炒货等，它是目前我国食品行业中应用最多的一种甜味剂。,目前，有些生产企业为牟取暴利，在生产中存在一些严重超范围、超限量使用甜味剂、防腐剂的问题。在中小城市、城镇农村的小企业生产的乳饮料、果汁饮料中，甜味剂超标现象尤其严重，有些产品甚至全部或大部分使用甜蜜素，这些产品主要消费对象为儿童，危害极大。与容易导致急性食物中毒的微生物污染
4、、农药残留、使用违规化工原料等行为对比，违规使用甜蜜素的后果在短期内似乎比较轻，但长此以往必然危害消费者健康，损害我国食品添加剂行业的声誉并影响食品工业的健康发展。因此，对甜味剂、防腐剂进行有效监控、检测是十分必要的。,人人都在质疑，你敢放心食用吗？,2011年5月，北京“唐僧肉”门,3、前人对甜蜜素的探索,目前国内外对各类食品中的甜味素含量的分析报道较多，包括分光光度法，电化学方法，毛细管电泳方法，离子色谱法，气相色谱及气相色谱质谱联用方法，液相色谱与液相色谱一质谱联用方法，以及流动注射技术与不同分析方法的联用等方法。,毛细管电泳法,分光光度仪,气-质联用色谱仪,目前国家标准中规定测定食品中
5、环己基氨基磺酸钠(甜蜜素)的方法主要有比色法、气相色谱法、薄层色谱法三法，其中首选方法即是气相色谱法，首先在硫酸介质中环己基氨基磺酸钠与亚硝酸反应，生成环己醇亚硝酸醋后，利用气相色谱法进行定性和定量。测定结果很大程度上取决于待测样品的处理过程，衍生条件的选择以及衍生效率的提高，因此测定误差较大。建立一种简便、快速、准确的甜味剂和防腐剂的同时测定的方法，可以节约大量人力、物力，所以具有十分重要的实际应用价值。使用紫外一可见分光光度计，建立一种简便、快捷、准确、灵敏的检测方法，以满足食品中甜蜜素的检测的需要。紫外光度法测定样品时，可以直接用蒸馏水定容，对前处理过程的要求不是很高，仪器操作简单，没有
6、经过专业训练的人也可完成。本法测定结果较准确，检出限低至0.3ug/ml（色谱法检出限为1.3g/ml）.,二、实验,1、方法与原理： 采用紫外光光度法间接测定食品中甜蜜素的是基于以下原理。 在一定的酸性介质中，甜蜜素与过量的亚硝酸钠发生等摩尔氧化还原反应，生成环己烯和硫酸以及氮气，剩余的亚硝酸钠继续与过量的KI发生氧化还原反应，生成I3- ，其化学反应式如下：,在波长350 nm处有灵敏的吸收，未加甜蜜素溶液 测得吸光度A与加入甜蜜素溶液吸光度A两者之差A(A=Ao-A)为甜蜜素所产生的吸光度，利用 A与甜蜜素浓度的线性关系，即可采用标准曲线法定量求出食品中甜蜜素的含量。,2、仪器和试剂,2
7、.1仪器(1) TU-1900双光束紫外一可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司);(2) MVS-1漩涡混合器(北京北德工贸有限公司);,(3) BS110S电子天平(Sartorius公司);(4) KH-100B型超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司);(5) TGL-16G离心沉淀器(上海安亭科学仪器厂)。,2.2 试剂,(1)盐酸，分析纯(沈阳化学试剂厂);(2)碘化钾，分析纯(沈阳市医药公司化玻站试剂分装厂);(3)硫酸，分析纯(辽宁省兴城市红星化工厂);(4)磷酸，分析纯(沈阳化学试剂厂);(5)亚硝酸钠，分析纯(沈阳市试剂一厂);(6)甜蜜素，标准物质(国家标准物质研究
8、中心);(7)苯甲酸，分析纯(沈阳市新西试剂厂);(8)山梨酸，标准物质(国家标准物质研究中心);(9)糖精钠，标准物质(国家标准物质研究中心);,(10)蔗糖标准物质，分析纯(天津科密欧化学试剂开发中心); (11)葡萄糖标准物质，分析纯(天津科密欧化学试剂开发中心);(12)咖啡因，分析纯(Lancaste:公司); (13)柠檬酸，分析纯(东北制药总厂一分厂)。,2.3 试剂的配制,(1)1000ug/ml甜蜜素标准储备液的配制: 准确称取0.1000 g甜蜜素，加少量去离子水溶解后转移至100 ML容量瓶中，定容至刻度，得到1000 A.g/mL甜蜜素标准储备液。(2) 2.5 mol
9、/L盐酸溶液的配制: 取浓盐酸52.1 mL于250 mL容量瓶中，用去离子水定容至刻度，得到2.5 mol/L盐酸溶液。(3) 0.05 mol/L碘化钾溶液的配制: 称取2.075 g碘化钾固体，用去离子水溶解后转移至250 mL容量瓶中，定容至刻度，得到0.05 mollL碘化钾溶液，避光放置或保存于棕色瓶中。,(4) 0.2 mol/L亚硝酸钠的配制: 称取0.690 g亚硝酸钠固体，用去离子水溶解后转移至50 mL容量瓶中，定容至刻度，得到0.2mol/L亚硝酸钠溶液，避光放置或保存于棕色瓶中。(5) 2.0 mmollL亚硝酸钠的配制: 吸取0.2 mol/L亚硝酸钠1.0 ML于
10、100 ML容量瓶中，去离子水定容至刻度，临用时新配。(6) Crattz试剂I:亚铁氰化钾106 g/L，称取10.6 g亚铁氰化钾，用水溶解并稀释至100 ML.(7) Crattz试剂II:乙酸锌220泌，称取22 g乙酸锌，用水溶解并稀释至100 ML.,3.试验方法,3.1 预处理(1)汽水等碳酸型饮料 称取5.00 -10.00 g样品于50.00 mL容量瓶中，加入少量流动相，超声脱气10 min,加入Crattz试剂I、Crattz试剂if各0.5 mL，用流动相定容至刻度，混匀后放置15 min。取上清液约5 mL在4000 r/min下离心10 min，上清液过0.45um
11、滤膜。(2)乳饮料、醋 称取约5.00 g样品于50.00 mL容量瓶中，加入少量流动相，加入Crattz试剂I、Crattz试剂II各5.00 mL，用流动相定容至刻度，混匀，超声10 min后放置15 min。取上清液约5 mL在4000 r/min下离心10 min，上清液过0.45 um滤膜。(3)固体 将固体样品均质后称取约2.00 g，操作同(2).,3.2 操作步骤,准确移取2.5 mol/L HCl溶液1.0 ML于50 mL比色管中，移取样品滤液5.0 mL，加入2.0 mmol/L的亚硝酸钠溶液1.6 mL，用去离子水洗比色管口，漩涡1 min后于避光处 放置20 min后
12、，迅速加入0.05 mol/L KI溶液2.0 mL，用去离子水稀释至刻度，摇匀后，于暗处放置10 min。 以去离子水作参比液，用10 mm比色皿于波长350 nm处测定溶液的吸光度。,3.3 标准曲线的绘制,移取2.5 mol/L的盐酸溶液1.0 mL于8支50 mL比色管中，分别准确加入1000.00ug/mL的甜蜜素标准溶液0.06, 0.10, 0.20, 0.30, 0.40, 0.50, 0.60, 0.70 mL，加入2.0mmol/L亚硝酸钠溶液1.6 mL,漩涡混合1 min，暗处反应20 min后，加入0.05 mol/LKI溶液2.00 mL定容后，暗处放置10 min
13、，得到浓度分别为1.2, 2.0, 4.0, 6.0, 8.0, 10.0,12.0, 14.0 pg/mL的甜蜜素标准系列，并测定相应吸光度值A。不加甜蜜素，按照上述操作步骤，所测得吸光度A。,三、结果与讨论,采用光度法测定物质的条件必须是该物质对紫外一可见光有选择性的吸收，即在波长200-780 nm范围内有吸收峰存在。为此本实验对甜蜜素标准溶液、亚硝酸钠溶液，KI溶液及按实验方法处理的操作试液的吸收光谱分别进行了测定和研究。采用双光束紫外一可见分光光度计，以去离子水为参比，在波长200-500 nm范围内扫描溶液的吸光度。反应产物在288 nm, 350 nm波长处均有吸收。在I3-的吸
14、收波长350 nm，亚硝酸钠溶液、KI溶液和盐酸均无吸收峰，即创门在此波长附近都不干扰I3-的测定，同时由实验可知波长288 nm的吸收峰不稳定，而且有碘化钾的背景吸收，不利于甜蜜素的准确测定，故本实验选择350 nm为测定波长。,操作试液谱图,硝酸钠试液,碘化钾试液,盐酸试液,1、实验数据记录及处理,（1）标准系列吸光度,（2）检出限及精密度实验,在最佳的分析条件下，平行移取7份浓度为12.0 g/mL的甜蜜素标准溶液，按实验方法进行实验，并在所选定的实验条件下，测定相应的吸光度，其实验结果如表3.5所示。,由表中的结果可知，相对标准偏差RSD 5%，可认为本实验在所选定的分析条件下测定的结
15、果，符合精密度的要求，可靠性大。 方法的检出限即方法的最小检出浓度，其最基本的定义是指能产生一个确证在试样中存在被测组分的分析信号所需要的该组分的最小含量或最小浓度。 将表中的结果代入算式得出最小检出浓度为:DL=3S/b=3 x 0.0058/0.5702=0. 3ug/ml则样品的最小检出量为7.5g/ml。,（3）回收率实验,回收率实验是检验系统误差的方法之一，本实验采用标准加入法测定回收率，即测定了样品中甜蜜素的含量后，用相同的试样，加入一定量的1000.0g/mL甜蜜素标准储备液，按照样品预处理方法进行处理后，进行分析测定。取百事可乐样品进行回收率实验，添加浓度为10.00 g/mL
16、的甜蜜素溶液，结果如下表所示。,由上表中的测定结果可以看出，甜蜜素的回收率在102.3103.3%之间，样品回收率测定的相对标准偏差均小于5%，表明分析结果可靠，可以满足日常分析检测的要求。,(1) 根据我国食品添加剂使用卫生标准（GB 2760）的规定，“甜蜜素”可以作为 甜味剂，其使用范围为：一，酱菜、调味酱汁、配置酒、糕点、饼干、面包、雪糕、冰淇淋、冰棍、饮料等，其最大使用量为0.65g/kg；二，蜜饯，最大使用量为1.0g/kg；三，陈皮、话梅、话李、杨梅干等，最大使用量8.0g/kg。本法中甜蜜素的测定检出限为0.3ug/ml.足以检出食品中甜蜜素的含量。(2) 测定结果中，甜蜜素的
17、回收率在102.3%-103.3%之间，样品回收率测定的相对标准偏差均小于5%，表明分析结果可靠，可以满足日常分析检测的 要求。,四、实验条件优化,4.1 酸性介质的选择 由于本实验需要在酸性介质中进行，分别用磷酸、硫酸、盐酸作介质进行比较实验，按实验方法分别加入相同体积和浓度的磷酸、硫酸及盐酸溶液，测定其溶液吸光度，由实验测定的最大吸光度选择佳实验条件。如下图所示。,4.2 盐酸浓度、体积的选择,在一定的酸度条件下，甜蜜素和亚硝酸钠的反应是等摩尔数的氧化还原反应，甜蜜素生成环己烯，但如果酸度过高，甜蜜素则与亚硝酸钠生成环己醇亚硝酸酷，同时过量的I-容易被空气中的02氧化，影响测定结果的准确度
18、，为此本实验分别考察了盐酸的浓度和加入量对吸光度变化的影响，以确定其最佳条件。（1）盐酸浓度的选择 在相同的条件下，按照实验方法，考察了盐酸浓度分别为0.2, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0,2.5, 3.0, 3.5 mol/L时反应体系吸光度的变化，结果如下图所示。,从图中可知，当盐酸浓度较低时，甜蜜素与亚硝酸钠的氧化还原反应不易发生，在此条件下，亚硝酸钠更易与KI反应，生成I3-离子较多，因此A值较低。随着酸度增加，甜蜜素与亚硝酸钠的反应越来越完全，因此A不断升高，当达到2.5mol/L以上时，吸光度的变化趋于稳定，而且酸度太大时，副反应容易发生，为此本实验选择盐酸溶液的浓度为2.
19、5 mol/L。,（2）盐酸体积的选择,在盐酸浓度已经确定的条件下，按照实验方法，考察了盐酸体积分别为0.1, 0.2,0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0 mL,时反应体系吸光度的变化，实验结果如下图所示。,由实验结果可以看出，当盐酸加入体积为0.10.5 mL时，体系的酸度过低，甜蜜素与亚硝酸钠的反应不完全，因此过多的亚硝酸钠与KI反应，DA较小。当盐酸体积在 1.0 mL以上时反应体系的吸光度已基本达到稳定，而且盐酸体积过高时，副反应容易发生，在保证酸度的条件下，应尽量选择较低的体积，为此本实验选择盐酸体积为1.0 mL。,4.3亚硝酸钠反应时间的确定,由于本实验采用
20、的亚硝酸钠在反应中既作为与甜蜜素发生氧化还原反应中的氧化剂，同时也作为与KI发生氧化还原反应的氧化剂，因此它的稳定性和反应条件直接影响着分析结果的准确性，而亚硝酸钠自身在光照条件下容易分解，为了确定亚硝酸钠与甜蜜素反应的条件，本实验研究了在室温下明处和暗处分别放置5, I0, 15, 20, 25,30, 35, 40 min时反应体系吸光度变化情况，结果如下图所示。,从图中可以看出，当亚硝酸钠与甜蜜素在室温下明处放置反应时，所得到的A均大于在暗处放置反应时的，说明在明处放置时，亚硝酸钠除了和甜蜜素反应，在光照条件下自身也分解，参与反应的亚硝酸钠的量较小，使生成的I3一的的量减少，吸光度值降低
21、，因此，明处的A值较大。 当在暗处放置时，5一20 min内体系的A值不断增大，说明在实验条件下，随着时间的增加，甜蜜素和亚硝酸钠溶液的反应不断趋于完全，当20 min后反应体系吸光度的变化值基本上趋于稳定，30 min后A值有所降低，说明反应体系不再稳定，因此本实验选择甜蜜素与亚硝酸钠的暗处反应时间为20min。,4.4 亚硝酸钠加入体积的确定,根据实验原理，亚硝酸钠与甜蜜素反应完全后，剩余的亚硝酸钠继续与过量KI反应，因此亚硝酸钠的加入体积是重要的参数，若加入量过少，甜蜜素反应不完全，加入量过多，与KI反应的吸光度值过大，可能超出仪器可测定范围，不利于微量甜蜜素的测定。在相同的 条件下，考
22、察了亚硝酸钠加 入体积分别为0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 1.2, 1.4,1.6, 1.8 mL的 2.0 mmol/L的亚硝酸钠溶液， 按实验方法进行实验，并测 定其吸光度。如图所示。,结果表明，亚硝酸钠体积1.2 mL以下时，吸光度小于0.3，表明亚硝酸钠与甜蜜素反应不完全1.2 mL以上时，吸光度不断增加，说明溶液中剩余的亚硝酸钠的量不断增加，1.8 mL时吸光度值过大，不利于微量甜蜜素的测定，为保证亚硝酸钠充分过量，增大线性范围，本实验选用1.6 mL作为2.0 mmol/L亚硝酸钠溶液的用量。4.5试剂加入顺序的影响 为保证实验在一定的酸度条件下进行，按照实验方法，首先加
23、入盐酸，然后依照不同顺序加入试剂，测定溶液的吸光度，结果如下表所示。从表中可见试剂的加入顺序对溶液的吸光度有影响，表明在盐酸存在的条件下，如果先加入亚硝酸钠，在酸性条件下，亚硝酸钠极其不稳定，相对标准偏差较大。故本实验选择加液顺序为加入盐酸后依次加入甜蜜素、亚硝酸钠，最后加入KI 。,4.6 碘化钾浓度、用量及反应时间的选择,为了使反应进行完全，一般需要加入过量的显色剂，但对于有些显色反应，显色剂加入太多反而会引起副反应，影响测定结果。为此本实验对显色剂KI的浓度及加入量及反应时间分别进行了考察，以确定最佳条件。4.6.1碘化钾浓度的选择按实验方法，用浓度分别为0.01, 0.02, 0.05
24、, 0.10, 0.15, 0.20, 0.25 mol/L的碘化钾溶液进行条件实验，结果如下图所示。,由上图可见，当选用KI浓度低于0.05 mol/L时，溶液的吸光度低，说明亚硝酸钠与KI反应没有完全，随着KI浓度增加，溶液的吸光度不断增加，0.050 mol/L以上时吸光度达到最大值并月保持稳定。如果KI浓度过高，溶液中剩余I-浓度过高容易被空气中的O2氧化，使吸光度增加，而且KI溶液浓度越大，这种干扰越大。在保证KI溶液为充分的前提下，本实验选择KI溶液的浓度为0.050mol/L。4.6.2碘化钾用量的选择 本实验的原理中，KI是过量的，过量的KI可使I2完全形成I3一络离子，以减少
25、I2的挥发。若溶液中I-浓度偏低，I2不能完全转化生成I3-;而I-浓度过高时，极易被空气中的02氧化，而造成测定结果的误差。 在相同条件下，分别移取0.050 mol/L的KI溶液0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5,4.0 mL，按实验方法进行显色实验，并测定其吸光度，结果如下图所示。,实验结果表明，碘化钾用量为0.5 mL时，吸光度小于0.3，说明与亚硝酸钠反应的KI用量不足，当加入量1.02.0 mL时，吸光度在0.70.8范围内变化，其变化率小、且稳定，随着碘化钾的体积不断增加，溶液中I-的浓度过高易被溶解氧氧化，吸光度不断增加，影响实验结果的准确性，故
26、实验选用2.0 mL作为0.050 mol/L的 KI溶液的用量。,4.6.碘化钾的反应时间4.6.3碘化钾反应时间的选择不同的化学反应完成的时间是不同的，有些化学反应瞬间完成，反应很快达到稳定状态，并在较长时间内保持不变;有些化学反应虽能迅速完成，但反应产物很快开始发生副反应;有些化学反应进行缓慢，溶液颜色需经过一段时间后才能稳定。因此应根据实际情况，确定最合适的测定时间。 按照拟定的分析步骤，在室温条件下，溶液定容以后，于避光处分别放置5, 10,15, 20, 25, 30 min后测定溶液的吸光度，结果如下图所示。,实验结果表明，过量的NO2-与I一在室温下即可发生反应，由于NO2-与
27、I一在光照下不稳定，容易发生副反应，因此于避光处放置，从图可以看出在5 20 min内，光度基本保持不变，20 min以上时，吸光度有所增加，说明溶液体系不再稳定。为节省分析时间，本文选定溶液放置10 min之后进行其吸光度的测量。,4.7干扰实验 由于食品中通常加入不止一种添加剂，它们的存在可能对甜蜜素的测定造成干扰。为此在所确定的反应条件下，考察了食品添加剂糖精钠、咖啡因、葡萄糖、蔗糖、山梨酸、苯甲酸、柠檬酸存在下对甜蜜素(浓度为60g/50 mL，吸光度为1.197)测定的影响，结果如下表所示。,从表中可以看出，常见的食品添加剂对分析结果均不产生干扰，即都不干扰g级甜蜜素的测定。当被测组
28、分中含有具有还原性大于甜蜜素的抗坏血酸等物质时，应该先通入氧气，使其提前被氧化，而不影响甜蜜素的测定。因此实验确定的方法具有良好的抗干扰能力，可以满足不同类型样品的分析要求。,五、实验的优缺点,1、紫外光度法与HPLC-RID的比较 采用两种方法在辉山巧克力乳饮料和健怡可口可乐中均检出了甜蜜素，比较样品测 定的结果，同时进行F检验和t检验，计算结果见下表。,由表可知,紫外光度法与HPLC-RID所测的甜蜜素的结果F检验计算结果分别为2.03和2.01,小于F表，表明两种方法的精密度无显著性差异，t检验计算的结果分别为1.17和2.12，小于t表，表明两种方法测定的平均值无显著性差异。,2、本实
29、验的优点,(1)建立了间接测定食品中甜蜜素含量的紫外光度方法，首次采用了亚硝酸钠与碘化钾间接测定甜蜜素的显色体系，该显色体系稳定、灵敏、选择性强，为食品中甜蜜素含量的测定提供了新的分析手段。(2)确定了测定甜蜜素的最佳实验条件:加入2.5 mol/L HCL1.0 mL, 2.0 mmol/L亚硝酸钠1.6 mL，暗处反应20 min后，加入0.05 mol/L的ICI溶液2.0 mL，暗处放置10 min后进行测定。(3)甜蜜素在1.014.0 g/mL范围内遵守比尔定律，线性方程为A=0.5702 c-0.0006=0.9984，最小检出浓度为0.3 g/mL，样品的最小检出量为7.5 g
30、/g，平均回收率为102.3%一103.3%，相对标准偏差0.7%一1.3%。,(4)干扰实验结果表明方法具有良好的抗干扰能力和选择性。本研究所建立的紫外光度法准确、可靠，所用仪器成本低，其结果经F检验和样品前处理相对简单，适合于各类实验室对食品中甜蜜素的常规检测。3、本实验的不足（1）紫外光度法在样品处理后，要经过显色过程，因此步骤较繁琐。（2）紫外一可见分光光度计每次测定样品的时候，需要手工将样品装入比色皿中，自动化程度差。（3）紫外光度法显色时间较长，线性范围窄，且只能测定甜蜜素一种食品添加剂。,六、参考文献,1、林雁飞，胡小钟，王鹏等.气相色谱一质谱联用法测定维生素C泡腾片中的甜蜜素J
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