1、天津科技大学研究生学位论文(申请硕士学位) 定向改造酿酒酵母积累丙酮酸的研究STUDY ON DIRECTELY TANSFORM SACCHAROMYCES CEREVISIAE FOR ACCUMULATE PYRUVIC ACID 专 业 名 称 ：发酵工程指 导 教 师 ：高年发 教授研 究 生 姓 名：邓旭衡申请学位级别：工学硕士论文提交日期：2011 年 1 月分类号：Q751 学校代码：10057密级：（秘密、机密、绝密） 研究生学号：08809005定向改造酿酒酵母积累丙酮酸的研究Study on Directly Transform Saccharomyces Cerevis
2、iae for Accumulate Pyruvic Acid 专 业 名 称 ： 发酵工程指 导 教 师 姓 名 ： 高年发 教授研 究 生 姓 名 ： 邓旭衡申 请 学 位 级 别 ： 工学硕士论 文 提 交 日 期 ： 2011 年 1 月论 文 课 题 来 源 ： 自选学 位 授 予 单 位 ： 天津科技大学天 津 科 技 大 学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究工作所取得的成果。除文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包括任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果内容，也不包括为获得天津科技大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。对本文研究
3、做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。作者签名：日期： 年 月 日知识产权和专利权保护声明本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师具体指导下并得到相关研究经费支持下完成的，其数据和研究成果归属于导师和作者本人，知识产权单位属天津科技大学；所涉及的创造性发明的专利权及使用权完全归天津科技大学所有。本人保证毕业后，以本论文数据和资料发表论文或使用论文工作成果时署名第一单位仍然为天津科技大学。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。作者签名：日期： 年 月 日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校
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5、的 方 法 主 要 有 化 学 合 成 法 、 生 物 催 化 法 和 生 物 发酵 法 。 化 学 合 成 法 、 酶 催 化 法 合 成 具 有 原 料 难 得 、 结 构 复 杂 、 成 本 较 高 ， 不 适 于 大规 模 生 产 ， 而 且 合 成 的 丙 酮 酸 酸 多 为 外 消 旋 混 合 物 等 缺 点 ， 因 此 利 用 微 生 物 法 合 成丙 酮 酸 酸 成 为 发 展 趋 势 。 发 酵 法 生 产 丙 酮 酸 的 主 要 研 究 思 路 和 目 标 是 ： （ 1） 减 少丙 酮 酸 的 进 一 步 降 解 及 转 化 ； （ 2） 加 快 发 酵 底 物 葡 萄
6、糖 的 酵 解 速 度 ， 提 高 生 产 强度 。酿 酒 酵 母 作 为 一 种 研 究 和 应 用 最 为 广 泛 的 真 核 微 生 物 ， 发 酵 生 产 乙 醇 具 有 极 好的 优 势 。 在 厌 氧 条 件 和 溢 出 代 谢 情 况 下 ， 经 糖 酵 解 生 成 的 丙 酮 酸 几 乎 全 部 或 大 部 分流 向 生 产 乙 醇 的 支 路 ， 从 而 产 生 乙 醇 的 积 累 ； 同 时 酵 母 细 胞 具 有 较 高 的 耐 受 性 ，可 以 积 累 较 高 浓 度 的 乙 醇 。 通 过 合 理 利 用 产 乙 醇 的 代 谢 流 向 ， 将 乙 醇 的 代 谢 流
7、 引 向丙 酮 酸 的 积 累 ， 为 丙 酮 酸 的 生 产 提 供 了 新 的 思 路 。 本 论 文 就 是 研 究 定 向 阻 断 酿 酒 酵母 丙 酮 酸 的 进 一 步 代 谢 ， 从 而 积 累 丙 酮 酸 。以 菌 株 S. cerevisiae Y2 为 出 发 菌 株 ， 把 pdc1 基 因 敲 除 片 段 用 电 穿 孔 转 化 法 转化 到 出 发 菌 株 S. cerevisiae Y2 中 ， 在 含 G418 抗 性 的 YEPD 平 板 上 筛 选 转 化 子 ， 通过 PCR 验 证 得 到 pdc1 基 因 的 敲 除 菌 株 S. cerevisiae
8、Y21。 然 后 把 pdc5 基 因 敲 除 菌株 敲 除 片 段 用 醋 酸 锂 转 化 法 转 入 到 S. cerevisiae Y21中 ， 在 YNBG 平 板 上 筛 选 转 化子 ， 通 过 PCR 验 证 得 到 pdc1 和 pdc5 基 因 都 缺 失 的 菌 株 S. cerevisiae Y215。 然 后用 southern blot 进 一 步 验 证 S. cerevisiae Y2 pdc1 和 pdc5 基 因 的 缺 失 。 为 比 较 丙 酮酸 脱 羧 酶 基 因 敲 除 后 酶 活 的 变 化 ， 分 别 测 定 S. cerevisiae Y2， S
9、. cerevisiae Y21和 S. cerevisiae Y215的 丙 酮 酸 脱 羧 酶 的 活 性 ， 结 果 发 现 S. cerevisiae Y21和 S. cerevisiae Y215的 丙 酮 酸 脱 羧 酶 的 活 性 较 S. cerevisiae Y2 分 别 减 少 了 31%和98%。对 基 因 敲 除 菌 株 和 出 发 菌 株 进 行 简 单 发 酵 实 验 ， 结 果 发 现 丙 酮 酸 的 产 量 有 显 著提 高 ， S. cerevisiae Y2， S.cerevisiae Y21和 S. cerevisiae Y215的 发 酵 120h 的
10、丙 酮酸 产 量 分 别 为 1.24g/L、2.894g/L、9.264g/L。 为 进 一 步 提 高 S. cerevisiae Y215的 丙酮 酸 产 量 ， 对 其 种 子 培 养 基 、 发 酵 培 养 基 和 发 酵 条 件 进 行 了 优 化 ， 优化后种子培养基为（g/L ）：葡 萄 糖 30， 蛋 白 胨 10， 酵 母 粉 5， KH2PO4 1， MgSO47H2O 0.5，醋 酸 钠 2， 玉 米 浆 0.5%， pH 5.6； 优化后发酵培养基为（ g/L）：葡萄糖 80，蛋白胨 20，酵母粉 10，醋酸钠 2.5，玉米浆 1%， KH2PO4 1， MgSO47
11、H2O 0.5， 金 属 离子 母 液 5mL， pH5.6；最佳发酵条件为：种龄 26h、接种量 12%、装液量70mL/250mL 三角瓶，发酵 96h。S. cerevisiae Y215在最佳发酵条件下丙酮酸的积累量为 24.85g/L，比优化前提高 168%。关 键 词 ： 丙 酮 酸 ； 基 因 敲 除 ； 酿 酒 酵 母 ； 代 谢 工 程 ； 丙 酮 酸 脱 羧 酶ABSTRACTPyruvic acid is an important organic acid, which widely used in production and research of chemical
12、raw materials, pharmaceutical and agricultural chemical reagents medicin and agrochemicals. Currently, the methods for product pyruvic acid include chemical synthesis, biocatalysis and biological fermentation. However, the common chemical synthesis and enzymatic synthesis are not suitable for mass p
13、roduction of pyruvic acid because they thave many shortcomings: the raw materials are rare, complex, costly and the products always is a racemic mixture, so the use of microbial synthesis of pyruvic acid is a trend. The main ideas and objectives of fermentative production of pyruvic acid are: (1) to
14、 reduce the further degradation and conversion of pyruvate; (2) To accelerate the glycolysis rate of fermentation substrate: glucose, increase production intensity.Saccharomyces cerevisiae is the most thoroughly investigated and the most widely used eukaryotic microorganism, which has excellent adva
15、ntages for fermentation production of ethanol. In anaerobic conditions and overflow metabolism, the pyruvate generated by glycolysis almost all or most of the slip flow to produce ethanol, resultied in the accumulation of ethanol; while yeast cells have a high tolerance on ethanol so it can be accum
16、ulated to a higher concentration. Through correct design of the flow of ethanol metabolism, change alcohol metabolism flow toward to the accumulation of pyruvate provides a new way for producr pyruvate. This paper is to study the directional blocking further metabolism of pyruvate in S. cerevisiae t
17、o accumulate pyruvate.The pdc1 knockout fragment was transformed into S. cerevisiae Y2 by using electroporation, transformants were screened on YEPD plates containing G418 resistant and were validated by PCR to get the pdc1 gene disrupted strain S. cerevisiae Y21. Then the pdc5 gene knockout fragmen
18、t was transformed into the Y21 by lithium acetate, transformants were screened on YNBG plates and were validated by PCR to get the S. cerevisiae Y215 with both pdc1 and pdc5 gene disrupted. The dispruption of pdc1 and pdc5 gene were further validated by southern blot. To compare the changes of pyruv
19、ate decarboxylase activity in gene knockout, the PDC activity of S. cerevisiae Y2, Y21 and Y215 were measured. The resilts showed the PDC activity of S. cerevisiae Y21 and Y215 were respectively reduced by 31% and 98% compared to S. cerevisiae Y2.Throgh the simple fermentation we found the yield of
20、pyruvic acid of S. cerevisiae Y2, Y21and Y215 is 1.24g/L, 2.894g/L, 9.264g/L in 120h, respectively. To further enhance the pyruvate production of S. cerevisiae Y215, the seed medium, fermentation medium and conditions were optimized. The optimal seed medium is (g/L): glucose 30, peptone 10, yeast ex
21、tract 5, KH2PO4 1, MgSO47H2O 0.5, sodium acetate 2, corn steep liquor 0.5%, pH 5.6; the optimal fermentation medium is (g/L): glucose 80, peptone 20, yeast extract 10, sodium acetate 2.5, corn steep liquor 1%, KH2PO4 1, MgSO47H2O 0.5, metal ions liquor 5mL, pH5.6; the optimal culture conditions is:
22、seed age 26h, 12% inoculum, medium volume 70mL/250mL flask, culture for 96h. In the end, S. cerevisiae Y215 accumulated 24.85g/L pyruvate at the optical condition, which increased by 168% compared to the condition before optimization.Key words: pyruvic acid, gene knockout, Saccharomyces cerevisiae,
23、matabolic enginerring, pdc geneI目 录1 前 言. .11.1 丙酮酸简介.11.2 丙酮酸(盐) 及其衍生物的 应用11.2.1 在化工制药领域 .11.2.2 在食品保健领域 .11.2.3 其他方面的应用.21.3 丙酮酸（盐）的生产方法 .21.3.1 化学催化合成法 .21.3.2 生物催化法 .21.3.3 微生物发酵法 .31.4 发酵法生产丙酮酸研究现状及发展趋势 .41.5 酿酒酵母代谢 .61.5.1 酿酒酵母. 61.5.2 酿酒酵母菌株改造. 71.5.3 酿酒酵母的葡萄糖代谢 .91.5.4 酿酒酵母的丙酮酸代谢 .121.5.5 调节
24、丙酮酸代谢节点上的代谢流量 .151.6 酿酒酵母生产丙酮酸可行性分析 .161.7 基因敲除 .161.8 本课题立题依据及研究内容 171.8.1 立题依据 .171.8.2 主要研究内容 .182 材料与方法 .192.1 实验材料 .192.1.1 菌种和质粒 .192.1.2 主要试剂 .192.1.4 培养基和溶液 .212.2 分析方法 232.2.1 酿酒酵母细胞浓度测定 .232.2.2 丙酮酸含量测定 .232.2.3 葡萄糖浓度测定 .232.3 实验方法 232.3.1 酿酒酵母生长曲线的绘制 .232.3.2 大肠杆菌质粒提取 .23II2.3.3 质粒 Not酶切
25、.242.3.4 酶切片段回收 .242.3.5 酿酒酵母的转化 .242.3.6 酿酒酵母基因组提取 .252.3.7 酿酒酵母丙酮酸脱羧酶活性测定 .252.3.8 Southern blot .252.3.9 引物合成和 PCR 扩增 262.3.10 酿酒酵母的培养方法 .303 结果与讨论 .313.1 酿酒酵母 Y2 的 pdc1 基因的敲除 313.1.1 酿酒酵母 Y2 生长曲线的测定 313.1.2 电击穿孔法转化酿酒酵母 Y2 .313.1.3 酿酒酵母转化子 Y21的筛选与鉴定 .323.1.4 转化子遗传稳定性 .333.2 酿酒酵母 Y21的 pdc5 基因的敲除 .
26、333.2.1 醋酸锂转化法转化酿酒酵母 Y21 .333.2.2 酿酒酵母转化子 Y215的筛选和验证 .333.2.3 转化子遗传稳定性 .353.3 酿酒酵母丙酮酸脱羧酶活力测定 .363.3.1 蛋白质浓度标准曲线 .363.3.2 酿酒酵母 Y2，Y 21，和 Y215丙酮酸脱羧酶活性比较 .363.4 Southern blot 验证酿酒酵母基因敲除菌株 373.4.1 酿酒酵母基因组酶切 .373.4.2 探针的标记 .373.4.3 杂交和检测 .383.5 酿酒酵母发酵产酸实验 393.5.1 丙酮酸测定 .393.5.2 摇瓶产酸实验 .413.6 酿酒酵母 Y215丙酮酸发酵的优化 .423.6.1 Y215生长曲线的绘制 .423.6.2 种子培养基的优化 .433.6.3 发酵培养基的优化 .443.6.4 发酵条件的优化 .504 结 论 .545 展 望 .55III6 参考文献 .567 攻读硕士学位期间发表论文情况 648 致 谢 .65
