1、实验内容,1. PCR产物与T载体的连接2.感受态细胞的制备， 连接产物的转化,实验一、PCR产物与T载体的连接,T vector 1 l 10ligation buffer 1 l PCR回收产物 7 l T4 DNA Ligase 1 l,轻弹管底混合，离心机甩一下，置25oC水浴12h。 连接产物可以直接用于转化，也可以置-20oC保存备用。 （低温连接效果比室温好） 。,1. 连接反应,2. TA克隆原理,TagDNA 聚合酶的一个功能：使PCR产物的3端突出一个A。,商业设计的T载体：在3端多出一个T。,两者的粘性末端可以互补配对。,应用时避免反复冻融，防止T的断裂丢失。如果与T载体
2、连接后主要以自身环化为主，要考虑T可能已经丢失。,其他说明：1） 连接反应的关键是目的基因片段与载体的比例，一般片段与载体比例为2:1 或3:1（摩尔比），根据片段大小决定比例。2）平端连接平端连接通常需要先将载体的5端磷酸去掉，然后再进行连接，这样可以防止载体的自身环化。当载体的5端磷酸去掉后，片段与载体的连接就会留下一个缺口，连接酶由于载体5端缺乏磷酸而无法形成磷酸二酯键，转化入细胞后，细胞内的酶会将缺乏的磷酸基团加上，再形成磷酸二酯键。,实验二、感受态细胞的制备及转化,培养至对数生长期的大肠杆菌在低渗 CaCl2 存在的情况下，细菌变得膨胀而易于外源基因的导入。另外，钙离子溶液处理的细胞
3、对外源DNA的摄取能力增强。,1. 感受态细胞制备原理,2.注意事项：1）感受态细胞的膜已经很脆，应该超低温保存。如果反复冻融会使细胞活力受影响，而且细胞膜的变化可能复原，由感受态细胞状态回转到普通细胞状态，失去接受外源DNA的能力。2）无菌操作。在火焰附近操作，火焰附近是无菌区。各种器具均需消毒。,无菌操作的注意事项,枪头、EP管、试管、平皿等，各种试剂都是经过高压灭菌后在超净台中专用的，但加样器需要自带。 取饭盒中的枪头、EP管时，都要用在酒精灯上烧灼后的镊子夹取。 烧瓶、试管、玻璃棒等玻璃器具，使用前和盖盖儿前要在酒精灯上烧灼一下瓶口。 塑料制品，如枪头和EP管不能用酒精灯烧灼。 手臂尽
4、量不要在敞开的容器上方移动，以免落入杂菌。 超净台事先要打开紫外灯照射至少20 min进行消毒，使用时要打开风机，。 操作前要用酒精擦拭手臂或带手套。,（超净台内操作）,无菌超净工作台,1） 将大肠杆菌在LB琼脂培养基上划线，37oC12-16小时。 2） 次日从琼脂平板上取一单菌落于2ml LB培养基中，37oC，225rpm速度震荡培养12-16小时。3） 取1ml上述培养物接种于100ml LB培养基中，37oC， 225rpm的速度震荡培养直至OD值为0.5左右(约3小时)。（上述13步骤已经由实验室完成）,水浴摇床,3. 感受态细胞的制备过程,5）弃上清，除净剩余液体，然后加入100
5、ul 冰冷的 100mmol/L CaCl2 致敏液悬浮细胞，冰浴5分钟。 6）6000rpm，离心5分钟，回收细胞，弃上清，加 入100ul冰冷100 mmol/L CaCl2溶液，悬浮细胞。 7）4oC可保存1-2周；长期保存， 可加甘油至终浓度为15%，置-70oC备用。,注意：（无菌操作）,4） 取1ml 菌液冰浴5min，然后6000rpm，离心5 min ，收集菌体。,1）将200l感受态细胞置冰上融化，然后加入3l DMSO, 混合后，加入10l连接反应液(含重组质粒), 温和混匀，置冰上10分钟。 (目的：防止细胞被胀破。)2）42oC，45秒，然后迅速放回冰中1-2分钟。,1. 转化的实验步骤,3）加入1 ml LB培养液， 37oC，225rpm摇荡培养30min。,连接产物的转化,4） 6,000rpm，离心10秒钟，倒掉上清，用剩余的约 200l LB培养液重悬菌体。5）将残存菌液轻轻混匀， 铺于含有氨基苄青霉素的LB琼脂培养板上涂匀，室温放置5-10min，倒置于37孵箱中培养14-16小时。,注意事项：转化后的平皿面朝下放置： 防止水蒸气形成的水滴影响细菌单菌落的形成。,实验结束后整理实验台, 值日生值日!,
