1、基因工程工具酶及应用,工具酶种类,限制性内切酶用于DNA分子的特异切割 DNA甲基化酶用于DNA分子的甲基化修饰 核酸酶用于DNA和RNA的非特异性切割 核酸聚合酶用于DNA和RNA的合成 核酸连接酶用于DNA和RNA的连接 核酸末端修饰酶用于DNA和RNA的末端修饰 其它酶类用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、检测等。,限制性内切核酸酶 Restrict endonuclease,细菌限制修饰系统的发现Werner Arber于1962-1968年发现，1968年分离到I型限制酶。 限制酶Hind II的发现Smith 和Wilox 于1970年首次从流感嗜血杆菌（H. influenzae
2、）中发现并分离到Hind II限制酶。 SV40 限制图谱和转录图谱的绘制Nathans（1971年）用Hind II绘制SV40的限制酶谱。,限制性内切酶的发现历史,I型：由三个基因编码，即：hsd R；hsd M；hsd S (host specificity for DNA restriction modification and specificity)位于染色体上，三个基因构成一个复合体(同一操纵子)，限制酶需要ATP、Mg2+、SAM(S-腺苷蛋氨酸)。II型：限制与修饰基因产物独立起作用，在E. coli中这两种基因位于质粒上。III型：修饰酶与I型酶相同，hsd M与hsd S
3、基因产物结合成一亚单位，限制酶是独立存在的。上述三个系统中，只有II型限制酶与甲基化酶具有相当高的核苷酸识别特异性，被广泛用于基因工程中。,限制修饰系统的种类,定义：广义指上述三个系统中的限制酶； 狭义指II型限制酶。 命名：限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。例如：Hind III 前三个字母来自于菌种名称H. influenzae，“d”表示菌系为d型血清型；“III”表示分离到的第三个限制酶。EcoR IEscherichia coli RI Hind IIIHaemophilus influensae d IIISac I (II)Streptomyces achroma
4、genes I (II),限制性内切酶的定义、命名,第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。,命名,EcoR I,Escherichia coli RY13株大肠杆菌 RY13株的第一种酶,识别顺序和酶切位点 -识别48个相连的核苷酸Mbo I N GATCN；Ava II G G(A/T)CC BamH I G GATCC Not I GC GGCCGC；Sfi I GGCCNNNN NGGCCFok I 5-GGATG (N)9-3 -富含GC,限制酶的特点,-对称性双对称EcoR I 5-G
5、A A T T C-33-C T T A A G-5 -切点大多数在识别顺序之内，也有例外-限制酶切后产生两个末端: 5-P和3-OH3-端突起 Pst I 5-CTGCAG-3 5-CTGCAOH PG-33-GACGTC-5 3-GP HOACGTC-55-端突起 EcoR I 5-GAATTC-3 5-GOH PAATTC-3 3-CTTAAG-5 3-CTTAAP HOG-5,平齐末端SmaI 5-CCCGGG-3 5-CCC GGG-33-GGGCCC-5 3-GGG CCC-5非互补的粘性末端切点在识别顺序之外的，如：Fok I5-GGATG(N)9-3 5-GGATG(N)93-
6、CCTAC(N)13-5 3-CCTAC(N)13能识别简并顺序的，如：Ava I5-CPyCGPuG-3CCCGGG; CTCGGG; CCCGAG; CTCGAG,相容性末端 如：BamH I G GATCCBgl II A GATCTMbo I, Sau3A I N GATCN它们产生的DNA片段仍可相连，由此形成的重组分子能被Mbo I和Sau3A I识别和酶切，但BamH I和Bgl II的识别机率只有1/16。BamH I和Bgl II(AGATCT)两种酶产生的相容性末端，相连后不能为两种酶所识别和酶切。,定义：能识别相同序列但来源不同的两种或多种限制 酶 特点：识别相同顺序切割
7、位点的异同Kpn I GGTAC C Asp718 G GTACCSst I CCGC GG Sac II CCGC GG,同裂酶(isoschizomer，异源同序酶),特点: 限制酶识别序列特异性降低发生星活性的限制酶和条件(见下一张)星活性的利用和避免限制性内切酶活性单位的定义：1个单位(u)酶指在建议使用的缓冲液及温度下，在20 l反应体系中反应1小时，使1g DNA完全消化所需的酶量(多数情况下用DNA来测试),限制酶的星活性 (star activity),表1 具有星反应的限制性内切酶与条件 限制酶 诱发星活性的条件a 识别序列 Ava I 1, 2, 4 BamH I 1 -
8、5, 8 G GATCN, G PuATCC Bst I 2, 4 Bsu I 2, 4, 6 EcoR I 1, 2, 4 - 6 N AATTN Hae III 2, 4 Hha I 2, 4, 7 Hind III 6 Hpa I 1, 2, 4 Pst I 1, 2, 4, 7 Pvu II 2, 4 Sal I 1, 2, 4, 7 Sca I 4 - 6, 8 Sst II 2, 4 Xba I 2, 4, 7 a.1：亚乙二醇(45%)；2:甘油(12%)；3：乙醇(12%)；4：高酶/DNA比(25U/g)；5：Mn+代替Mg+；6:pH8.5; 7:二甲基亚砜(8%); 8:
9、无NaCl。,DNA重组 限制酶（物理）图谱绘制 突变分析（RFLP分析）,限制酶的用途,几个在分子克隆中应注意使用内切酶：CH3 Dpn I: GA TC Sap I: GCTCTTCNNNNCT AG CGAGAAGNNNN CH3,DNA 甲 基 化 酶 (DNA Methylase),限制修饰系统I、II、III型中的甲基化酶 三个系统中的甲基化酶可使细菌DNA分子中的胞嘧啶和腺嘌呤发生甲基化，形成5-甲基胞嘧啶和6-甲基腺嘌呤：在DNA重组实验中，常用的甲基化酶属于II型，它与相应的限制酶的识别顺序相同，其甲基化位点与限制酶作用位点可同可不同。如： 不同: M. EcoR I GA
10、mATTCC EcoR I G AATTC相同: MHpa I C mCGG Hpa I C CGG,甲基化酶的种类与识别顺序,Ecoli 的两类甲基化酶Dam: G mATC (甲基化位点为N6) Dcm: C mCA/TGG (甲基化位点为C5) 哺乳动物的甲基化酶 可使CG中的胞嘧啶甲基化，其甲基化反应与DNA复制、基因转录等过程有关。Ecoli中依赖于甲基化的限制修饰系统 Mrr(mA/A)、mcr(Am5CG)、merB(Pum5C),Dcm 和Dam甲基化酶对限制酶的影响 抑制某些限制酶的活性，不管两种限制酶的识别顺序是完全重叠还是边界重叠 如：完全重叠 Bcl IDam(GATC
11、)；ScrF IDcm(CCA/TGG)边界重叠 Cla IDam； Sau96 IDcm不能抑制某些限制酶活性，不管两者的识别顺序为何种重叠如：DamBamH I，Sau3A I，Bgl II，Pvu I； DcmBstN I,甲基化酶活性对限制酶活性的影响,表2 对甲基化敏感的限制性内切酶限制酶 识别序列* 甲基化酶 Ava II GG(A/T)CC(A/T)GG dcm Bcl I TGATCA dam Cla I GATCGAT dam EcoR II CC(A/T)GG dcm Hph I GGTGATC dam Mbo I GATC dam Nru I GATCGCGA dam S
12、au96 I GGNCC(A/T)GG dcm SauF I CC(A/T)GG dcm Stu I AGGCCTGG dcm Taq I GATCGA dam Xba I TCTAGATC dam*下横线字母表示限制酶识别序列, 绿色字母表示dam甲基化酶识别序列,红色字母表示dcm甲基化酶识别序列,抑制同种限制酶的活性 M.BamH I GGATmCCBamH I(GGATCC)M.EcoR I GAmATTCEcoR I(GAATTC)抑制不同种限制酶的活性a. 顺序完全重叠 如：M. Cla I(ATCGmAT)Taq I (TCGmA)b. 顺序边界重叠 如：M. BamH I(GG
13、ATmCC) Mep I (mCCGG)抑制不同种限制酶的部分活性M. Taq I(TCGmA)Hind II(GTPyPuAC)：GTCAAC，GTTAAC，GTCGmAC，GTTGAC,II 型甲基化酶对限制酶活性的影响,改变某些限制酶识别顺序的特异性，以便重组体的形成 在建立基因文库时，可先使DNA分子部分甲基化，然后再用限制酶切,甲基化酶的用途,表3 甲基化酶与识别序列 甲基化酶 识别序列a 受甲基化影响的限制酶bM.Alu I AGmCT Alu I, BamH II, Bsp1286Dde I,HgiA I, Nhe I, Pst IM.BamH I GGATmCC BamH I,
14、 Msp IM.Cla I ATCGmAT Cla I, Mbo I, Taq Idam GmATC c dcm CCA/TGG c M.EcoR I GAmATTC EcoR IM.HId GCNGC GGmCC Mst I, Pst I, Pvu IIM.Hae III GGmCC Ban II,Bgl I,Bsp1286,BstX I,Hae III, Msp I,Nae I,Nco I,Sac II, Sau96 IM.Hha I GmCGC Aha II, FnuD II, Hha IM.Hpa II CmCGG Aha II,Ava I,Ava II,Hpa II,ScrF IM.
15、Hph I TmCACC Hinf I, Hph I, Sau3A IM.Msp I mCCGG BamH I, Msp IM.Pst I CTGCmAG Alu I, Pst IM.Taq I TCGmA Alu I, Ava I, EcoRV, HinC II, Hinf I,Mbo I, Taq I, Xmn Ia.标在碱基的左上角的m表示该碱基被甲基化; b.所列出的限制酶均已商品化; c.参见表2; d.M.HI分离自噬菌体污染的细菌细胞，它可识别两个序列，GCNGC的甲基化位点尚未确定。,核 酸 酶 Nuclease,ds-DNA结构: 切口, 缺口, 断口,外切酶III (Exo
16、 III) 一般特点： 来自于E.coli，分子量28,000 kD 催化反应类型-外切酶活性：3 5，产生5-单磷酸核苷酸和具各种结构的 ds-DNA，pH 7.6-8.5-核酸酶H活性：除去DNA-RNA杂交分子中的RNA分子，pH 7.6-8.5-3-磷酸酶活性：除去3-磷酸基后形成3-OH端，有利于DNA聚合酶反应，pH 6.8-7.4-内切酶活性：在无嘌呤或无嘧啶处将DNA键切开，pH 7.6-8.5,外切酶活性特点- 反应底物：互补ds-DNA- 碱基释放速度：CA-TG - 反应产物：5-单磷酸核苷和具缺口或5-端突起的ds-DNA，过度反应将导致DNA降解 用途 - 核酸（DN
17、A）标记- 基因突变-缺失- DNA序列测定时作顺序缺失 使用注意事项- 正式使用前，测定在一定条件下酶的反应速度- 在一定条件下，ExoIII不能作用GC富集区(来自于cDNA加尾),Exo III的外切酶和RNase H的作用,大部分用于RNA的核苷酸序列分析或除去DNA样品或蛋白质合成系统中的RNA分子。- RNase A分离自牛胰脏，对热稳定，抗去污剂(100加热15min仍具活性), 用于除去DNA样品中的RNA分子- 核酸酶S7，亦称微球菌核酸酶，对RNA敏感，用于除去蛋白质合成系统中的内源mRNA,RNase,作用于DNA-RNA杂交分子中的RNA链，用于cDNA文库建立时除去R
18、NA链以便第二条链cDNA链的合成。,RNase H,特点：具内切酶活性，作用于ds -DNA，但无核苷酸序列特异型，产生5-P低聚核苷酸; Ca2+ , Mg 2+ 或Ca2+ , Mn2+可使酶活达最大值, 当酶浓度很低时，ds -DNA分子上将形成切口，不同类型二价阳离子对两条链上切口位置形成有以下影响：Mg 2+存在时，两条链上的切口独立无关Mn2+存在时，两条链上的切口几乎在同一位置 用途1) 切口移位，制备DNA探针2) 制备RNA样品时除去DNA分子3) 基因突变时产生切口,DNase I,DNA 聚 合 酶 DNA polymerase,E.coli 的DNA聚合酶系统Pol
19、I 参与DNA修复, 具35和53外切酶活性pol II 同上 具35外切酶活性pol III 参与DNA复制, 具35和53外切酶活性,E.coli DNA聚合酶I (pol I),E.coli pol I的特点- 具两种外切酶活性和DNA聚合酶活性，在蛋白酶作用下，该酶分裂成两个大小不同的片段，其中小片段具53外切酶活性，大片段具35外切酶活性(大片段亦称为Klenow片段, pol IK)- 聚合酶活性，53, 要求3-OH引物和模板DNA，其延续性受反应条件的影响- 外切酶活性,用途- 除去3-端突起的单链DNA（在无dNTP时）- 补齐5-突起端- 合成第二条cDNA- 切口移位制备
20、探针,特点：53聚合酶活性，1500 nt/min, 为pol I的两倍 35外切酶活性，可作用于ss-DNA和dsDNA, 其切除速度分别为40和 4000nt/min 用途：制备高比活性探针(1010 cpm/g DNA); DNA末端修饰-缺失,T4 DNA聚合酶,外切酶活性 聚合酶活性,无dNTP dNTP, AMV(Avian myeloblastosis virus)反转录酶-结构与酶活性 反转录酶以，形式存在，其中(无活性)P32(内切酶活性)+聚合酶 + P24(RNase H活性)，各步反应由蛋白酶催化 -聚合酶活性a. RNA，DNA引物(大于8 nt)cDNA链bDNA，
21、RNA引物互补DNA链,反转录酶, M-MuLV(Moloney murine leukemia virus)反转录酶-特点：不具内切酶活性; RNase H活性低; 稳定性差-与AMV反转录酶比较a合成短链cDNA(0.6 kb)时，两者相同，但M- MLV反转录酶需要量大，可能与其稳定性差有关b合成长链cDNA(4.5-7.5 kb)时，它比AMV反转录酶有效得多，这与它无内切酶活性有关。-用途a. cDNA合成，建立文库; b. 制备cDNA探针; c. DNA序列分析; d. 填补5-突起末端以获平端,特点：分离自古细菌嗜热水生菌(Thermus aquaticus)，分子量为94,0
22、00，最适反应温度75，对95高温具良好稳定性，该酶不存在35外切酶活性，错配几率为8.9x10-51.1x10-4。,Taq DNA聚合酶,用途：主要用于DNA的体外扩增，经25次循环后才进入酶的反应稳定期，一个DNA 分子因而可被扩增4106倍DNA扩增技术又称为聚合酶链式反应，它包括以下三个步骤：DNA模板变性(95) 与DNA引物退火(4560) 引物延伸(72),Taq Pol 和PCR,5 3 变性,3 5,5 3 引物,3 5 复性,5 3 5 3,3 5 引物 3 5,5 3 延伸 5 3,3 5,3 5,Vent DNA pol: 由火山口分离的嗜热高温球菌中分离，具有35外
23、切酶活性，具有较高的保真度(比Taq DNA pol高515倍)。Pfu DNA pol: 来自激烈热球菌(Pyrococcus fariosus)，具有35外切酶活性，具有更高的保真度。,其它DNA聚合酶,RNA 聚 合 酶 RNA polymerase,特点：依赖于DNA的RNA聚合酶，具SP6启动子特异型 用途：主要用于RNA分子的体外合成，RNA分子可用于：- RNA分子的拼接研究;- 标记的RNA常用于杂交，RNA-DNA比DNA-DNA分子更稳定，两条链均可标记，产生的RNA具高放射比活性;,SP6 RNA聚合酶,- DNA的定序分析;- 基因结构的研究，其中包括内含子数目，长度和
24、位置;- 还可以用于蛋白质的合成研究.,连 接 酶 Ligase,特点：只连接ds -DNA分子，要求3-羟基和5-磷酸基 用途：- 相同或相容粘性末端的连接;- 平末端的相连;DNA平端来源：限制酶作用结果; 限制酶与其它酶共同作用结果 。平端的连接比粘性末端的连接要困难得多，所需的酶量也多! 抑制剂：PO43-5mM; NaCl25mM; Ca2+0.1mM,T4 DNA连接酶,活力单位：一般采用Weiss单位来定义其活性：在37下20 min催化1 nmol 32P从焦磷酸根置换到32PATP所需的酶量。而NEB连接酶单位定义为：在20l反应体系中于16 ，使Hind III切过的DNA
25、(300 g/ml)在30 min内连接50%所需的酶量为1 NEB单位。1 NEB单位=0.015 Weiss单位，1 Weiss单位=67 NEB单位。 反应条件：-16 、4 h- 4 、O/N (overnight)- RT 、 5 min(特殊设计),5-AAGCTT-3 5-AOH PAGCTT-3 PAGCTT AOH 3-TTCGAA-5 3-TTCGAP HOA-5 HOA TTCGAP 退火5-AHOPAGCT T AHOPAGCT T-33-T TCGAPOHA T TCGAPOHA-5或5-AHOPAGCT T AHOPAGCT T-33-T TCGAPOHA T TC
26、GAPOHA-5T4 DNA连接酶5-AAGCTT AAGCTT-33-TTCGAA TTCGAA-5或5-AAGCTT AAGCTT-3 3-TTCGAA TTCGAA-5,T4 DNA连接酶的连接反应(两种插入方向),+,只能连接具粘性末端DNA分子，以NAD作辅助因子,E.coli DNA连接酶,参与单链RNA分子的连接。主要用于提高T4 DNA连接酶在连接反应中的连接效率（20倍）,HO P HO P HO P,5 3 5 3 5 3,RNA连接酶活性,T4 RNA连接酶,核 酸 末 端 修 饰 酶,特点- 除去ss-DNA，ds-DNA 和RNA分子两端的3-和5-磷酸基;- 对热稳
27、定. 用途- 载体DNA的去磷酸化，防止自我连接，以增加重组频率;- 核酸末端标记.,细菌碱性磷酸酶 (Bacterial alkaline phosphatase, BAP),磷酸酶(I)与磷酸激酶(II)活性,磷酸激酶的交换反应,牛小肠碱性磷酸酶(Calf intestinal alkaline phosphatase, CIP)与BAP相同，只是CIP对热敏感,载体去磷防止自连的应用示例,P,OH,P,OH,OH,OH,OH,OH,P,OH,P,OH,OH,OH,OH,OH,连接酶,连接酶,连接酶,碱性磷酸酶,CIP,寄主修复缺口,载体自连或产生二具体等,催化反应类型- 激酶活性(5-磷
28、酸化酶)：可将ATP中的位的磷酸基转移到ss-DNA，ds-DNA和RNA分子的5-羟基端，在这反应过程中可有两种方式进行(pH7.58).转移反应； .交换反应- 3-磷酸酶活性(pH 56),T4 多聚核苷酸激酶 (T4 polynucleotide kinase),用途- 5-端末端标记; - 分子克隆过程中以获得5-磷酸基末端，便于连接酶反应.,其 它 酶 类,原生质体的制备酶类制备原生质体目的：外源DNA导入；核酸和蛋白质的提取 溶菌酶， zymolyase，glusulase，NovoZyme，溶壁酶，纤维素酶 蛋白质降解酶类蛋白酶K 检测酶类抗生蛋白链素-半乳糖苷酶, 碱性磷酸酶
29、, 辣根过氧化物酶,基因疗法治疗帕金森病首次在临床上取得成功,帕金森病病患丘脑下核中一种化学物质-氨基丁酸（GABA）的浓度会减少。英国帝国理工学院的基因疗法专家尼克勒斯马萨拉基斯领导的研究团队制造出了一种病毒，该病毒能使用一个基因来“感染”细胞，增加患者体内GABA的浓度,知识窗：最新进展,AAV2-GAD gene therapy for advanced Parkinsons disease: a double-blind, sham-surgery controlled, randomised trial,The Lancet Neurology, Early Online Publi
30、cation, 17 March 2011,Background Gene transfer of glutamic acid decarboxylase (GAD) and other methods that modulate production of GABA in the subthalamic nucleus improve basal ganglia function in parkinsonism in animal models. We aimed to assess the effect of bilateral delivery of AAV2-GAD in the subthalamic nucleus compared with sham surgery in patients with advanced Parkinsons disease.,
