1、色谱法,4-5次课 基础 气相色谱 液相色谱 毛细管电泳和毛细管色谱,第十二章 色谱法基础 Basics of Chromatography,Overview,目前混合物最有效的分离、分析方法。 色谱法是一种分离技术，试样混合物的分离过程也就是试样中各组分在称之为色谱分离柱中的两相间不断进行着的分配过程。其中的一相固定不动，称为固定相；另一相是携带试样混合物流过此固定相的流体（气体或液体），称为流动相。 当流动相中携带的混合物流经固定相时，其与固定相发生相互作用。由于混合物中各组分在性质和结构上的差异，与固定相之间产生的作用力的大小、强弱不同，随着流动相的移动，混合物在两相间经过反复多次的分配
2、平衡，使得各组分被固定相保留的时间不同，从而按一定次序由固定相中流出。 与适当的柱后检测方法结合，实现混合物中各组分的分离与检测。,Michael Tswett(1872-1919), a Russian botanist , discovered the basic principles of column chromatography. He separated plant pigments by eluting a mixture of the pigments on a column of calcium carbonate. The various pigments separate
3、d into colored bands; hence the name chromatography.,1906年他为了分离植物色素，将植物绿叶的石油醚提取液倒入装有碳酸钙粉末的玻璃管中，并用石油醚自上而下淋洗，由于不同的色素在碳酸钙颗粒表面的吸附力不同，随着淋洗的进行，不同色素向下移动的速度不同，形成一圈圈不同颜色的色带，使各色素成分得到了分离。他将这种分离方法命名为色谱法（chromatography）。,在色谱发展史上占有重要地位的英国人A.J. P. Martin(马丁)和R.L.M. Synge(辛格)，他们提出色谱塔板理论；发明液-液分配色谱；预言了气体可作为流动相（即气相色谱）
4、。 1952年，因为他们对分配色谱理论的贡献获诺贝尔化学奖。,(1910-2002),(1914-1994),History,色谱法起过关键作用的诺贝尔奖研究工作,微观分离过程,色谱法的优缺点,（1）分离效率高 复杂混合物，有机同系物、异构体。手性异构体。 （2） 灵敏度高 可以检测出g.g-1(10-6)级甚至ng.g-1(10-9)级的物质量。 （3） 分析速度快 一般在几分钟或几十分钟内可以完成一个试样的分析。 （4） 应用范围广 气相色谱：沸点低于400的各种有机或无机试样的分析。 液相色谱：高沸点、热不稳定、生物试样的分离分析。不足之处： 被分离组分的定性较为困难。,色谱法分类,1按
5、两相状态分类气体为流动相的色谱称为气相色谱（GC），根据固定相是固体吸附剂还是固定液（附着在惰性载体上的一薄层有机化合物液体），又可分为气固色谱（GS C）和气液色谱（GLC）。液体为流动相的色谱称液相色谱（LC）。同理，液相色谱亦可分为液固色谱（LSC）和液液色谱（LLC）。超临界流体为流动相的色谱称为超临界流体色谱（SFC）。随着色谱工作的发展，通过化学反应将固定液键合到载体表面，这种化学键合固定相的色谱又称化学键合相色谱（CBPC）。,2.按分离机理分类,利用组分在吸附剂（固定相）上的吸附能力强弱不同而得以分离的方法，称为吸附色谱法。利用组分在固定液（固定相）中溶解度不同而达到分离的方法
6、称为分配色谱法。利用组分在离子交换剂（固定相）上的亲和力大小不同而达到分离的方法，称为离子交换色谱法。利用大小不同的分子在多孔固定相中的选择渗透而达到分离的方法，称为凝胶色谱法或尺寸排阻色谱法。最近，又有一种新分离技术，利用不同组分与固定相（固定化分子）的高专属性亲和力进行分离的技术称为亲和色谱法，常用于蛋白质的分离,3按固定相的外形分类 固定相装于柱内的色谱法，称为柱色谱。固定相呈平板状的色谱法，称为平板色谱，它又可分为薄层色谱和纸色谱。,色谱流出曲线及有关术语,一流出曲线和色谱峰,如果进样量很小，浓度很低，在吸附等温线的线性范围内，色谱峰如果对称，可用Gauss正态分布函数表示：,式中：C
7、不同时间t时某物质的浓度，C0进样浓度，tr保留时间，标准偏差。,二、基线 baseline,是柱中仅有流动相通过时，检测器响应讯号的记录值。稳定的基线应该是一条水平直线. ,三、峰高 peak height,色谱峰顶点与基线之间的垂直距离，以h表示。,四、保留值 retention value,1死时间 dead time, tM 不被固定相吸附或溶解的物质进入色谱柱时，从进样到出现峰极大值所需的时间称为死时间。因为这种物质不被固定相吸附或溶解，故其流动速度将与流动相的流动速度相近。,试样从进样开始到柱后出现峰极大点时所经历的时间，称为保留时间。它相应于样品到达柱末端的检测器所需的时间,2保
8、留时间 retention time, tR,3调整保留时间tR 某组份的保留时间扣除死时间后称为该组份的调整保留时间，即 tR = tR-tM,由于组份在色谱柱中的保留时间tR包含了组份随流动相通过柱子所需的时间和组份在固定相中滞留所需的时间，所以tR实际上是组份在固定相中停留的总时间保留时间可用时间单位（如s）或距离单位（如cm）表示。保留时间是色谱法定性的基本依据，但同一组份的保留时间常受到流动相流速的影响，因此色谱工作者有时用保留体积等参数进行定性检定,4死体积 VM 指色谱柱在填充后，柱管内固定相颗粒间所剩留的空间、色谱仪中管路和连接头间的空间以及检测器的空间的总和当后两项很小而可忽
9、略不计时，死体积可由死时间与流动相体积流速F0（Lmin）计算： VM = tMF0,5保留体积 VR 指从进样开始到被测组份在柱后出现浓度极大点时所通过的流动相体积。保留体积与保留时间t。的关系如下：,6调整保留体积VR某组份的保留体积扣除死体积后，称该组份的调整保留体积，即 VR= VR- VM,VR = tRF0,7相对保留值21 或选择因子,由于相对保留值只与柱温及固定相的性质有关，而与柱径、柱长、填充情况及流动相流速无关，因此，它是色谱法中，特别是气相色谱法中，广泛使用的定性数据必须注意，相对保留值绝对不是两个组份保留时间或保留体积之比 .,某组份2的调整保留值与组份1的调整保留值之
10、比，称为相对保留值：,色谱峰的区域宽度是组份在色谱柱中谱带扩张的函数，它反映了色谱操作条件的动力学因素度量色谱峰区域宽度通常有三种方法：,1. 标准偏差 即0.607倍峰高处色谱峰宽的一半2. 半峰宽W1/2 即峰高一半处对应的峰宽，它与标准偏差的关系是：W1/2 = 2.354,五、区域宽度,即色谱峰两侧拐点上的切线在基线上的截距，如图中IJ的距离它与标准偏差的关系是：,3.基线宽度W,从色谱流出曲线上，得到信息是：,（l）根据色谱峰的个数，可以判断样品中所合组 份的最少个数（2）根据色谱峰的保留值(或位置），可以进行定性分析(3) 根据色谱峰下的面积或峰高，可以进行定量分析（4）色谱峰的保
11、留值及其区域宽度，是评价色谱柱分离效能的依据（5）色谱峰两峰间的距离，是评价固定相(和流动相)选择是否合适的依据,色谱法的基本原理,色谱分析的目的是将样品中各组分彼此分离，组分要达到完全分离，两峰间的距离必须足够远，两峰间的距离是由组分在两相间的分配系数决定的，即与色谱过程的热力学性质有关。但是两峰间虽有一定距离，如果每个峰都很宽，以致彼此重叠，还是不能分开。这些峰的宽或窄是由组分在色谱柱中传质和扩散行为决定的，即与色谱过程的动力学性质有关。,一、分配系数K和分配比k,1分配系数K 如前所述，分配色谱的分离是基于样品组分在固定相和流动相之间反复多次地分配过程，而吸附色谱的分离是基于反复多次地吸
12、附一脱附过程。这种分离过程经常用样品分子在两相间的分配来描述，而描述这种分配的参数称为分配系数见它是指在一定温度和压力下，组分在固定相和流动相之间分配达平衡时的浓度之比值，即,2.分配比k,分配比又称容量因子，它是指在一定温度和压力下，组分在两相间分配达平衡时，分配在固定相和流动相中的质量比。即,k值越大，说明组分在固定相中的量越多，相当于柱的容量大，因此又称分配容量或容量因子。它是衡量色谱柱对被分离组分保留能力的重要参数。k值也决定于组分及固定相热力学性质。它不仅随柱温、柱压变化而变化，而且还与流动相及固定相的体积有关。,式中CS，Cm分别为组分在固定相和流动相的浓度； Vm为柱中流动相的体
13、积，近似等于死体积。Vs为柱中固定相的体积，在各种不同的类型的色谱中有不同的含义。例如：在分配色谱中，Vs表示固定液的体积；在尺寸排阻色谱中，则表示固定相的孔体积。,3. 分配系数K与分配比k的关系,其中称为相比率，它是反映各种色谱柱型特点的又一个参数。例如，对填充柱，其值一般为635；对毛细管柱，其值为60600。,4分配系数K及分配比k与 选择因子a的关系,根据对以上公式处理，对A、B两组分的选择因子，可用下式表示,通过选择因子a把实验测量值k与热力学性质的分配系数K直接联系起来， a对固定相的选择具有实际意义。如果两组分的K或k值相等，则a =1，两个组分的色谱峰必将重合，说明分不开。两
14、组分的K或k值相差越大，则分离得越好。因此两组分具有不同的分配系数是色谱分离的先决条件。,最早由Martin等人提出塔板理论，把色谱柱比作一个精馏塔，沿用精馏塔中塔板的概念来描述组分在两相间的分配行为，同时引人理论塔板数作为衡量柱效率的指标。,二 塔板理论（plate theory）,L: 色谱柱长度 H: 每一块塔板的高度 n: 理论塔板数,（i）在柱内一小段长度H内，组分可以在两相间迅速达到平衡。这一小段柱长称为理论塔板高度H。（ii）以气相色谱为例，载气进入色谱柱不是连续进行的，而是脉动式，每次进气为一个塔板体积（Vm）。（iii）所有组分开始时存在于第0号塔板上，而且试样沿轴（纵）向扩
15、散可忽略。（iv）分配系数在所有塔板上是常数，与组分在某一塔板上的量无关。,塔板理论,根据上述假定，在色谱分离过程中，该组分的分布可计算如下：开始时，若有单位质量，即m=1（例1mg或1g）的该组分加到第0号塔板上，分配平衡后，由于k=1，即ns=nm故nm=ns=0.5。当一个板体积（lV）的载气以脉动形式进入0号板时，就将气相中含有nm部分组分的载气顶到1号板上，此时0号板液相（或固相）中ns部分组分及1号板气相中的nm部分组分，将各自在两相间重新分配。故0号板上所含组分总量为0.5，其中气液（或气固）两相各为0.25而1号板上所含总量同样为0.5气液（或气固）相亦各为0.25。以后每当一
16、个新的板体积载气以脉动式进入色谱柱时，上述过程就重复一次(见下表)。,按上述分配过程，随着脉动进入柱中板体积载气的增加，组分分布在柱内任一板上的总量（气液两相中的总质量）,由塔板理论可建流出曲线方程：,m为组分质量，VR为保留体积，n为理论塔板数。当流动相体积V=VR 时，C值最大，即,理论塔板数与色谱参数之间的关系为：tR应与W采取一样的单位，如时间或距离。,从上两式可以看出，色谱峰W越小，n就越大，而H就越小，柱效能越高。因此，n和H是描述柱效能的指标。通常填充色谱柱的n103，H1mm。而毛细管柱 n=105106，H0.5mm由于死时间tM包括在tR中,而实际的tM不参与柱内分配,所计
17、算的n值尽大,H很小,但与实际柱效能相差甚远.所以,提出把tM扣除,采用有效理论塔板数neff和有效塔板高Heff评价柱效能。,塔板理论仅仅是一种经验理论，它能够在热力学的观点上定量说明了流出曲线的形状以及提出了评价色谱柱效的参数。但是，它缺乏动力学上方面的考虑。,塔板理论的特点和不足,(1)当色谱柱长度一定时，塔板数 n 越大(塔板高度 H 越小)，被测组分在柱内被分配的次数越多，柱效能则越高，所得色谱峰越窄。,(2)不同物质在同一色谱柱上的分配系数不同，用有效塔板数和有效塔板高度作为衡量柱效能的指标时，应指明测定物质。,(3)柱效不能表示被分离组分的实际分离效果，当两组分的分配系数K相同时，无论该色谱柱的塔板数多大，都无法分离。,(4)塔板理论无法解释同一色谱柱在不同的载气流速下柱效不同的实验结果，也无法指出影响柱效的因素及提高柱效的途径。,
