1、第二节 分配色谱,一、基本原理,1、吸附色谱的局限性 （1）吸附色谱不适合于分离强极性的亲水性物质（成分）； （2）吸附剂的含水量对吸附剂的吸附能力影响较大，常使结果重现性较差； （3）易出现拖尾峰。,2、分配色谱原理 （1）固定相为液体 将某种溶剂涂布在吸附剂颗粒表面或纸纤维上，形成一层液膜，称为固定相。 吸附剂颗粒表面或纸纤维叫载体或担体。 根据组分在两相中的溶解度不同而分离。 （2）“相似相溶”原则 极性物质在极性溶剂中溶解度大，K大； 非极性物质在非极性溶剂中溶解度大，K大。 （3）分配定律与分配等温线 （4）分配色谱的特点： a、重现性 b、峰对称 c、无强烈滞留现象. 几乎适用于各
2、种类型的化合物，特别适宜于亲水性物质，如极性较大的生物碱、苷类、有机酸、糖类及氨基酸的衍生物等。,二、载体,只起负载固定相的作用。 要求：惰性、无吸附能力、纯净、颗粒均匀。 种类1）硅胶：重现性差2）硅藻土：应用最多3）纤维素：纸色谱,三、固定相和流动相的选择,正相分配色谱：固定相的极性大于流动相的极性； 固定相：水、缓冲溶液、稀硫酸、甲醇、丙二醇等；按一定的比例与载体混匀后填装于色谱柱。 流动相：石油醚等 洗脱顺序:极性大的组分保留作用强；极性小的组分保留作用弱,反相分配色谱：固定相的极性小于流动相的极性。 固定液：硅油、液体石蜡等极性较小的有机溶剂。 流动相：水、各种水溶液（酸、碱、盐及缓
3、冲液）、与水混合的有机溶剂。 洗脱顺序:极性小的组分保留作用强；极性大的组分保留作用弱,四、分配色谱操作注意事项,1、两相溶剂的处理 2、上样量与样品前处理。 3、柱色谱 4、纸色谱,第三节 离子交换色谱法 (ion exchange chromatography),一、基本原理 1、离子交换剂与离子交换过程 （1）离子交换剂 为一种固体状可在水溶液中浸润和溶胀的多孔颗粒，其表面有许多可电离的基团，在水中电离时，有一种离子可在水中自由移动，而另一种则在固定相上不能自由移动。 可自由移动的离子可以被其它同类离子置换，即离子交换。,（2）离子交换过程 水溶液中（流动相中）的各种离子，可与离子交换树
4、脂上固定的离子基团结合，使原来与其结合的离子被置换，进入流动相而发生置换。,带负电的交换基团（固定的离子基团，如磺酸基、羧酸基）：用于阳离子分离； 带正电的交换基团（固定的离子基团，如季胺盐）：用于阴离子分离。,2、分离机理 （1）不同的离子与交换树脂的结合力不同，从而固定相对它的保留能力不同，从而造成差速迁移。 （2）离子交换平衡：,K 大，Na+易与固定相结合，移动慢；反之，移动快。 tR = tm(1+K) VR = Vm(1+K) = Vm+KVS K为分配系数,平衡时,K 为选择性系数（交换平衡常数）,二、离子交换树脂,1、离子交换树脂的构成 由苯乙稀和二乙烯基苯聚合而成的网状结构，
5、不溶于水和有机溶剂，性质稳定。,苯乙烯组成长链； 二乙烯基苯为交联剂,2、离子交换树脂的类型 （1）阳离子交换树脂 可交换的离子为阳离子。 氢型、钠型 强酸型、弱酸型、中强酸型（COOH、PO3H、SH）例如：磺酸型 R-SO3H+ (pH范围宽)* 应注意pH范围，否则交换容量急剧下降。 （2）阴离子交换树脂 可交换的离子为阴离子。 按不同碱性分：强碱型（季胺基团）NR3+ (pH11)NH2, NHR,NR2等 (pH8) 按可交换的离子分：氢氧型、氯型,3、离子交换树脂的特性 交联度：表示交联剂在离子交换树脂中所占的百分含量，通常使用412%的树脂。 交联度大：树脂孔小，刚性强，孔穴多，
6、离子基团多，溶胀小。适合于体积较小的无机离子的分离 交联度小：树脂孔大，刚性差，渗透性好。适合于体积较大的有机离子的分离 溶胀：树脂内极性基团吸水性极强，大量的水进入树脂内部，产生膨胀，叫溶胀。 溶胀程度与树脂类型、交联度有关。因此，严禁干法装柱。, 交换容量：每克干树脂中真正参加交换反应的基团数。 常用单位：mmol/g,mmol/ml等 影响因素：pH、交联度、溶胀特性、分离对象，只能以实际测量为准。 粒度：离子交换树脂颗粒的大小（指溶胀状态）,三、经验规则（亲和力大小规则）,对小离子亲合力大 水合离子半径越小，亲合力越大 对电荷多的离子亲合力大A4+ B3+ C2+ D+ 大分子量的有机
7、离子,有较高的亲和力,四、流动相,1、组成：一般为盐类的缓冲水溶液（有一定的pH值）。 2、对分离的影响,2、对分离的影响 流动相主要影响组分离子和交换基团形成离子对的过程 pH对弱酸、弱碱的影响 影响其离解平衡，即控制了组分形成离子的程度：离子组分，则K； 离子组分，则K 不同离子交换剂的pH适用范围： 强酸型：较宽; 强碱型：pH6; 弱碱型：pH8, 离子强度的影响(盐类浓度) 离子强度，溶剂强度，洗脱能力。 平衡离子(即流动相中的盐类)的影响 它的种类可影响分离的选择性，浓度影响溶剂强度；它们与树脂的亲合力不同，从而影响组分的相对保留值： a. 离子浓度相同时，高电荷离子与交换基团亲合
8、力大 b. 同价离子，原子量增大亲和力增加 c. 水合离子半径越小，亲和力越大。,3、流动相的选择（淋洗液） 用去离子水溶解淋洗剂配制而成 淋洗剂为电解质（含阳离子、阴离子），其中对分离起实际作用的称淋洗离子： 如NaCO3水溶液为流动相，分离无机阴离子时，Na2CO3是淋洗剂，CO32是淋洗离子。 选择的基本原则： 理论上：淋洗离子与树脂的亲和力应接近或稍高于被测离子。 实际：样品组分中有强保留离子和弱离子时，若选择与保留最强的离子的亲和力接近的淋洗离子，弱保留的离子会很快流出色谱柱，不能达到分离。 所以根据样品组成，通过实验选择。,五、应用,1、除去干扰离子 2、测定盐类含量 3、痕量元素
9、富集,第四节 空间排阻色谱 （凝胶色谱）,利用大小不同的分子在多孔固定相（凝胶）中的选择性渗透来分离。适用于分离分子量不同的大分子物质（Mr 2000）,一、基本原理 1、分离机理 （1）前三种是亲和力不同而分离； （2）凝胶色谱中组分与固定相之间无作用力，只是根据分子量大小来分离； （3）凝胶 有一定的孔径分布范围的多孔物质。组分进入柱内后，全向固定相的孔中扩散，保留程度取决于孔和组分分子的大小。 小分子:将全部渗入细孔中,在流经柱时,经历的路程最长. 中等大小分子:渗入部分较大的孔隙,而被较小的孔隙排斥,经历的路程居中. 大分子:完全被排斥在空隙外,经历的路程最短.,所以洗脱次序仅是分子大
10、小(分子量)的函数。 分子大小受分子量,分子几何形状（环球形、螺旋形或棒形）组分分子间的缔合程度、组分与流动相分子间的缔合程度有关。,Size Exclusion Chromatography,2、分配系数和保留值 (1) 分配系数K 组分进入柱子，从高浓度的流动相中向固定相孔隙内扩散，扩散平衡时,a、小分子平衡时，一半组分在孔隙内，一半组分在孔隙外。 CS=Cm K=1 b、大分子（直径大于固定相孔径时），被全部排斥在固定相孔隙之外 CS=0 K=0 c、中等大小分子，直径介于以上两种极限之间，0K1 所以在凝胶色谱中 0K1,（2）保留值 保留方程 VR = Vm + KVS 在凝胶色谱中
11、 Vm：外水体积（V0） VS：内水体积（Vi） 当 K = 1 时，VR Vm VSV0ViK = 0 时，VR Vm V0 所以，所有组分均在 （Vi+V0） 体积内流出。,二、凝胶类型 （自学） 1、葡聚糖凝胶 2、聚丙烯酰胺凝胶 3、琼脂糖凝胶 4、多孔玻璃凝胶14 用于亲水性样品的分离 5、聚苯乙烯凝胶（非水溶液样品亲脂性）,三、实验条件的选择,分子量较正曲线 将分子量不同的组分混合物注入柱子，经分离后，分别测得它们的保留体积，以分子量对保留体积作图，得一曲线，称分子量校正曲线。 图中，A、B两点反映了该固定相能够分离的组分分子量的上限(排斥极限)、下限(全渗透极限)，只有分子量在A、B对应量之间的组分才能被分离。,1、凝胶的选择（主要通过选择凝胶来改善分离）,2、凝胶的溶胀 干凝胶+10倍吸水量的洗脱剂中，缓慢搅拌； 注意：时间足够长，不易过稀。 3、装柱：不应有气泡。 柱长100cm 4、样品的制备 组别分离（粗分）：上样量可以是柱体积的2530%。 K值相近的物质（细分）：上样量可以是柱体积的25。 5、洗脱：洗脱剂应与溶胀凝胶的溶剂相同。 洗脱剂：水、不同离子强度的溶液、不同pH的缓冲液、水有机溶剂混合液。 6、应用：测定大分子物质的分子量（如Pr）,
