1、1抗菌药物敏感性试验与细节耐药性监测来源：检验医学在线 2009-4-15 南网编辑 2010-7-6一、需氧菌及兼性厌氧菌的药物敏感试验(一)纸片琼脂扩散法纸片琼脂扩散法又称 Kirby-Bauer试验，是操作最简易、使用最广泛的抗菌药物敏感性试验。1试验原理 将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上。纸片中所含的药物吸收琼脂中的水分溶解后不断向纸片周围区域扩散形成递减的梯度浓度。在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制，从而形成透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的最低抑菌浓度(MIC)呈负相关关系，即抑菌圈越大，MIC 越小。2培养基和
2、抗菌药物纸片(1)培养基：水解酪蛋白(Mueller-Hin-ton，MH)培养基是 CLSI/NCCLS采用的兼性厌氧菌和需氧菌药敏试验标准培养基，pH 值为 7.27.4，对那些营养要求高的细菌如流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌、链球菌等需加入补充物质。琼脂厚度为 4mm。配制琼脂平板当天使用或置塑料密封袋中 4保存，使用前应将平板置 35孵育箱孵育，使其表面干燥。(2)抗菌药物纸片：选择直径为 6.35mm，吸水量为 20ul的专用药敏纸片用逐片加样或浸泡方法使每片含量达到规定所示。含药纸片密封储存 28或-20无霜冷冻箱内保存，-内酰胺类药敏纸片应冷冻储存，且不超过 l周。使用前将储存容器移至
3、室温平衡 l2h，避免开启储存容器时产生冷凝水。3细菌接种 细菌接种采用直接菌落或细菌液体生长方法。用 0.5麦氏比浊标准的菌液浓度。校正浓度后的菌液应在 15min内接种完毕。接种步骤如下：用无菌棉拭子蘸取菌液，在管内壁将多余菌液旋转挤去后，在琼脂表面均匀涂片接种 3次，每次旋转 60，最后沿平板内缘涂抹 1周；平板置室温下干燥 35min，用纸片分离器或无菌镊将含药纸片紧贴于琼脂表面；置 35孵育箱孵育 1618h 后阅读结果，对甲氧西林和万古霉素药敏感试验结果应孵育 24h。4结果判断和报告 用精确度为 1mm的游标卡尺量取抑菌圈直径(抑菌圈的边缘应是无明显细菌生长的区域)，当葡萄球菌对
4、苯唑西林的药敏试验或肠球菌对万古霉素的敏感试验，围绕纸片周围只要有极少细菌生长提示为耐药。对另外一些菌，在抑菌圈内散在菌落生长提示可能是混合培养，必须再分离鉴定及试验，也可能提示为高频突变株。变形杆菌迁徙生长使抑菌圈内生成的薄层菌可忽略不计。由于培养基内抗药成分使其对甲氧苄啶引起的轻微细菌生长，生长层小于 20可忽略不计。根据 CLSI/NCCLS标准，对量取的抑菌圈直径判断病原菌对该药物的敏感性形式(敏感/中度敏感/中介、耐药)。2(二)稀释法如果要进一步检测某种病原菌对多少剂量(浓度)的抗菌药物呈敏感时，就必须使用稀释法(dilution method)。稀释法包括两种：肉汤稀释法和琼脂稀
5、释法，分别介绍如下：1肉汤稀释法 有常量稀释法(mac-rodilution)和微量稀释法(microdilution)，前者含药肉汤含量每管l.0ml(通常 2m1)，后者每孔含 0.1ml。商品化的微量稀释板上含有多种经对倍系列稀释的冻干抗生素，操作方便，广泛应用于临床。(1)培养基：使用 M-H肉汤，需氧菌、兼性厌氧菌在此培养基中生长良好。在该培养液中加入补充基质可支持流感嗜血杆菌、链球菌生长。培养基制备完毕后应校正 pH值为 7.27.4(25)。离子校正的 M-H肉汤(CAMHB)为目前推荐的药敏试验培养液。(2)药物稀释药物原液制备：抗菌药物直接购自于厂商或相关机构，所需的溶液量或
6、粉剂量可根据下述两公式进行计算。质量(mg)=溶剂（ml）浓度（ug/ml）/分析效能（ug/mg）容积(m1)= 质量(mg) 分析效能（ug/mg）/浓度（ug/ml）配制各种抗菌药物的溶剂根据药物性能选择蒸馏水、pH 值为 6.0，0.1mol/L 磷酸盐缓冲液等。一般原液浓度不低于 1 000ug/ml或 10倍于最高测试浓度，原液应储存于-60以下，保存期不超过 6个月。稀释抗菌药物的制备：行 2倍系列稀释，使其终浓度(ug/m1)为 512、256、128、64、32、16、8、4、2、1、0、0.5、0.25、0.125 等。(3)菌种接种：配制 05 麦氏浓度菌液，用肉汤(常量
7、稀释法)、蒸馏水或生理盐水(微量稀释法)稀释菌液，使最终菌液浓度(每管或每孔)为 5105 CFUml，稀释菌液于 15min内接种完毕，35孵育 1620h，当试验菌为嗜血杆菌属、链球菌属孵育时间为 2024h，试验葡萄球菌和肠球菌对苯唑西林和万古霉素的药敏试验孵育时间必须满 24h以上。(4)结果判断：以在试管内或小孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为 MIC(ug/m1)。甲氧苄啶(甲氧苄胺嘧啶)或磺胺药物的肉汤稀释法敏感试验的终点判断，以细菌数为阳性对照的 80即可作为判断细菌生长指标。微量稀释法时，常借助于比浊计判别是否有细菌生长。2琼脂稀释法 琼脂稀释法是将药物混匀于琼脂培养基中，
8、配制含不同浓度药物平板，使用多头接种器接种细菌，经孵育后观察细菌生长情况，以抑制细菌生长的琼脂平板所含药物浓度测得 MIC。(1)培养基：M-H 琼脂为一般菌药敏试验的最佳培养基，调整 pH值在 7.27.4(25)，过高或过低的 pH值会影响药物效能。(2)含药琼脂制备：将已稀释的抗菌药物按 1：9(配制的药物溶液：琼脂培养基)加入，加热溶解琼脂，在 4550水浴平衡融化 MH琼脂中，充分混合倾入平皿，琼脂厚度为 34mm。室温凝固后的平皿装入密闭塑料袋中，置 28，储存日期为 5d，对易降解药物3如含头孢克洛，在使用 48h之内制备平板，使用前应在室温中平稳放于孵育箱或层流罩中30min以
9、使琼脂表面干燥。(3)细菌接种：将 0.5麦氏比浊度菌液稀释 10倍，以多头接种器吸取(为 12ul)接种于琼脂表面，稀释的菌液于 l5min内接种完毕，接种后置 35孵育 1620h(MRS、VRE 孵育时间需满 24h)，奈瑟菌属、链球菌属细菌置于 5C02、幽门螺杆菌置微需氧环境中孵育。(4)结果判断：将平板置于暗色、无反光表面上判断试验终点，以抑制细菌生长的药物稀释度为终点浓度(含甲氧苄啶平板上可见少许散在细菌生长)。试验菌的结果报告可用 MIC(ug/mg)或用敏感(S)、中介(I)和耐药(R)报告。(三)E 试验E试验(Epsilometer test)是一结合稀释法和扩散法原理对
10、细菌药敏试验直接定量的技术。1试验原理 E 试条是一条 5mm50mm的无孔试剂载体，一面固定有一系列预先制备的，浓度呈连续指数增长稀释抗生素，另一面有读数和判别的刻度。抗生素的梯度可覆盖有 20个 MIC对倍稀释浓度的宽度范围，其斜率和浓度范围对判断有临床意义的 MIC范围和分界点值具有较好的关联。将 E试条放在细菌接种过的琼脂平板上，经孵育过夜，围绕试条明显可见椭圆形抑菌圈，圈的边缘与试条交点的刻度浓度即为抗生素抑制细菌的特定浓度，又称抑制浓度(IC)，它与 MIC呈高度相关。2细茵接种和加样使用厚度为 4mmM-H琼脂平板，用 0.5麦氏浓度的对数期菌液涂布，待琼脂平板完全干燥，用 E试
11、验加样器或镊子将试条放在已接种细菌的平板表面，试条全长应与琼脂平板紧密接触，试条 MIC刻度面朝上，浓度最大处靠平板边缘。采用 CLSl/NCCLS AST执行标准推荐孵育条件。 3结果判断和报告 读取椭圆环与 E试验试条的交界点 IC值。E 试验 IC值与 CLSl/NCCLS的稀释法 MIC参考值高度相关，二者直接相对应，CLSl/NCCLS MIC 折点值适用于 E试验。但在判断结果时出现和细菌、药物、耐药机制和技术处理有关判断问题时应予以修正。二、苛养菌的药物敏感试验肺炎链球菌及其链球菌属、流感嗜血杆菌、奈瑟菌属等苛养菌不能在普通环境及普通MH培养基中快速生长，上述的药敏试验条件不适合
12、它们。它们需要更为复杂的培养基、孵育条件，在进行药敏试验时，质控菌株、药敏抗生素的选择、结果解释标准也有所不同。下面分别介绍几种重要苛养菌药敏试验的试验条件选择、质量控制方法和结果判断注意事项。各自的结果判断标准请参考 CLSl/NCCLS手册。4(一)嗜血杆菌属1试验条件(1)培养基：使用嗜血杆菌属试验培养基(hemophilus test medium，HTM)。(2)接种菌液：菌悬液终浓度为 5105CFU/ml。(3)孵育条件：35下孵育 2024h 观察结果。对于扩散法，35、57C0 2下孵育 l618h 观察结果。2质量控制 流感嗜血杆菌 ATCC49247、流感嗜血杆菌 ATC
13、C49766、大肠埃希菌 ATCC35218(用于 -内酰胺抗生素/-内酰胺酶抑制剂)为推荐参考菌株。3结果判断注意事项(1)血液、脑脊液分离株仅需做氨苄西林、三代头孢菌素中的一种、氯霉素和美罗培南。(2)耐氨苄西林和阿莫西林的流感嗜血杆菌大多产 TEM型 -内酰胺酶。大多数情况下，直接检测 -内酰胺酶更快。(3)-内酰胺酶阴性而氨苄西林耐药(-Lactmase-negative，ampicillin-resistant，BL-NAR)的流感嗜血杆菌株少见。然而，不论其体外药敏试验是否出现敏感，均应考虑为阿莫西林/克拉维酸、氨苄西林/舒巴坦、头孢克洛、头孢盂多、头孢尼西、哌拉西林/他唑巴坦耐药
14、。(二)肺炎链球菌1试验条件(1)培养基：肉汤稀释法使用离子校正的马冻融血培养基。(2)接种菌液：菌悬液终浓度为 l05CFU/ml。(3)孵育条件：35下孵育 2024h。2质量控制 肺炎链球菌 ATCC49619、大肠埃希菌 ATCC35218(用于 -内酰胺抗生素/-内酰胺酶抑制剂)为推荐参考菌株。3结果判断注意事项(1)对青霉素敏感者，均可认为对氨苄西林、阿莫西林、阿莫西林/克拉维酸、阿莫西林舒巴坦、头孢克洛等三代头孢菌素敏感；青霉素中介或耐药株，不推荐做上述药物的药敏试验，因为对青霉素耐药的肺炎链球菌对上述抗生素治疗的疗效很低。应当及时通知临床医生，然后应报告对头孢曲松、头孢噻肟和美
15、罗培南的 MIC。(2)静脉注射高浓度青霉素(肾功能正常的成人 2106U/4h)或氨苄西林(29/6h)对青霉素中介的肺炎链球菌是有效的。标准剂量的头孢曲松、头孢噻肟对中介的肺炎链球菌也有临床疗效，但在发现该菌株引起的脑膜炎时常用最大剂量治疗。(三)肺炎链球菌外链球菌属1试验条件(1)培养基：肉汤稀释法同肺炎链球菌，琼脂稀释法用含 5羊血琼脂。5(2)接种菌液：菌悬液终浓度为 5105CFU/ml。(3)孵育条件：35下孵育 2024h。琼脂稀释法需 5C0。2质量控制 肺炎链球菌 ATCC49619为推荐质控菌株。3结果判断注意事项(1)化脓性链球菌一般不需做青霉素药敏试验，该菌目前对青霉
16、素仍为敏感株，只有某些无乳链球菌可能会对青霉素产生中介结果。(2)对青霉素敏感的链球菌，同时被认为对氨苄西林、阿莫西林、阿莫西林/克拉维酸、阿莫西林/舒巴坦、头孢克洛、头孢吡肟、头孢噻肟、头孢曲松、头孢唑肟等敏感，毋需对这些抗生素进行药敏试验。(3)青霉素或氨苄西林中介的菌株，需用氨基糖苷类联合用药进行治疗。(4)对红霉素耐药者或敏感者常提示对阿奇霉素、克拉霉素、地红霉素耐药或敏感。 三、分枝杆菌的药物敏感试验(一)结核及慢生长分枝杆菌的药物敏感试验由于结核及慢生长分枝杆菌生长缓慢，在生长前，药物已扩散至培养基中，不能有效影响其生长。故不适用于需氧或兼性厌氧菌的药敏试验。结核及慢生长分枝杆菌药
17、敏试验的药敏培养基、含药浓度、接种菌量、结果解释等都有其特殊性。比例法是 WH0/IUATLD全球结核病耐药监测方案中推荐的方法，目前国外普遍采用此法。国内多采用绝对浓度法，据报道，该法比比例法的耐药菌检出率要低 510。某些微生物自动鉴定和药敏系统则采用放射核素等方法。1绝对浓度法(absolute concentration method)该法以“无生长”为终点或为最低抑菌浓度(MIC)来判断耐药与否，每种药物需制备两种不同浓度的含药培养基，同时用不含药培养基作为对照，接种菌液最终浓度为 1ug/ml，37培养 4周观察结果。判断标准为对照培养基上细菌生长良好，含药培养基上菌落20 个判为
18、耐药。(1)试验条件培养基：改良罗氏培养基(Lowenstein-Jensen，L-J)。试验药物：试验用药物和药物浓度(表 6-2)。接种菌液：多点刮取培养物少许，置于磨菌器中，用磨菌捧捻磨，使呈乳酪样，以 0.5Tween-80 生理盐水稀释，与比浊管比浊，配制成 lmg/ml菌悬液，然后以灭菌生理盐水稀释至 l0-2mg/ml。试验时每点接种 lOOul。孵育条件：37下孵育 4周。(2)质量控制：结核分枝杆菌 H37RvATCC 27294为一线、二线药的敏感质控菌株；结核分枝杆菌 H37Rv ATCC35820为链霉素耐药质控菌株；结核分枝杆菌 H37Rv ATCC35822为异烟肼
19、耐药质控菌株；结核分枝杆菌 K37Rv ATCC35826为环丝氨酸耐药质控菌株；结核分枝杆菌 H37Rv ATCC35827为卡那霉素耐药质控菌株；结核分枝杆菌 H37Rv ATCC35828为吡嗪酰胺耐药质控菌株；结核分枝杆菌 H37Rv ATCC35830为乙硫异烟胺耐药质6控菌株；结核分枝杆菌 H37Rv ATCC35837为乙胺丁醇耐药质控菌株；结核分枝杆菌 H37Rv ATCC35838为利福平耐药质控菌株。(3)结果判断注意事项：每周阅读平板 1次。根据 CLSI/NCCLS药敏测定时间，结核分枝杆菌为 3周，慢生长分枝杆菌为 2周，到 4周末终止培养。结果报告方式分敏感、低浓度
20、耐药、高浓度耐药和实报菌落数 4种。判断标准如下：敏感。含药培养基上无菌落生长。低浓度耐药。低浓度含药培养基上菌落数20 个，高浓度含药培养基上无或极少菌。高浓度耐药。低浓度含药培养基上菌落茂盛，高浓度含药培养基上菌落数20 个(+菌落数约占斜面面积 l/4；+菌落数约占斜面面积 l/2；+菌落数约占斜面面积 3/4；+菌落呈菌苔样生长)。实报菌落数。低浓度含药培养基上菌落数2 为拮抗作用。(二)联合杀菌试验1时间一杀菌曲线法采用杀菌动态曲线用于评价一种抗菌药物对测试菌的杀菌速率，也可评价两种及两种以上抗菌药物对测试菌联合杀菌活性。方法如下：(1)无菌试管标记为 Oh、4h、8h、24h 和生
21、长对照五组。(2)每管加入肉汤培养基 lOml。(3)每管中加入定量的测试药物。(4)每管中加入 0.1m1 0.5麦氏比浊度标准的菌液，使细菌终浓度为 106CFU/ml。11(5)加入菌后，立即将 0h管和生长对照管游涡混匀 15s，并用生理盐水稀释 1 000倍。取出 0.1ml涂布于血琼脂平板上，35孵育过夜后计数菌落数。(6)其他组试管按时培养后同法计算菌落数。(7)将各时间点测的平均菌落数在半对数坐标纸上绘制杀菌曲线图。读取杀菌速率。2最低杀菌浓度测定最低杀菌浓度(minimal bactericidal concentration，MBC)是指能杀灭 99.9以上测试菌量的最低药
22、物浓度。由于影响杀菌的因素较多，某些菌株在体外可表现出对杀菌药物的耐受现象或反常效应，使 MBC测定结果重复性差，并且难以确定杀菌终点。与 MIC测定法不同的是：生长对照用 MH肉汤稀释至 103CFU/ml，取 0.1ml涂布于 2个血平板上，孵育过夜，计算菌落数，得到最初接种的菌落数。测试管孵育 20h，将无肉眼可见菌生长的各管混匀 15s后再孵育 4h，再次混匀后从无肉眼可见菌生长管中取 0.1ml涂布于 2个血平板上，孵育过夜，计算菌落数。当无肉眼可见生长管中的菌落数1：8 常提示治疗方案有效。但对于某些严重感染，如细菌性心内膜炎，血清抑菌力/杀菌力比值的标准应64，才能提示治疗方案有
23、效。九、特殊菌的耐药性监测（一）耐甲氧西林葡萄球菌12在体外抗菌药物敏感性试验中，对 30ug头孢西丁纸片的抑菌圈直径19mm 或苯唑西林 MIC4ug/ml 的金黄色葡萄球菌以及对 30ug头孢西丁纸片的抑菌圈直径24mm 或苯唑西林 MIC0.5/ug/ml 的凝固酶阴性葡萄球菌，称耐甲氧西林葡萄球菌(methecillin resistance staphylococcus，MRS)。1、耐药性产生机制69l00的 MRS均含有 macA基因，mecA 检测结果和表型检测有较好的相关性。曾有学者建议将 mecA作为判断耐甲氧西林葡萄球菌的标准。macA是定位于 MRS染色体的一段 213
24、0bp的 DNA序列，与一段 4060kb 的外源 DNA一起整合于葡萄球菌染色体上。mecA 基因在生物界起源尚不清楚，但多数实验结果支持为水平传播，且可经噬菌体转导。mecA 基因编码产生 78kD的青霉素结合蛋白 2(PBP2)，其与 -内酰胺类药物的亲和力低，致使细菌在较高的药物浓度下仍继续生长繁殖表现其耐药性。研究发现，存在 mac操纵子，在 mecA基因的上游存在有操纵基因 mecRI和 mecI。其中，mecI 编码抑制蛋白，mecRI 编码诱导蛋白。此外，mecA 基因的表达还依赖于甲氧西林耐药表达辅助基因，如 femA、femB、femD 和 femE，它们固有存在于染色体中
25、。目前至少发现两种 mecA表达的调节机制：低度耐药株：诱导物和诱导蛋白与 meeRI结合，活化了meeRI，直接或间接破坏抑制蛋白 mecI和 mecA的结合状态，去阻遏 mecA的表达。高度耐药株：由质粒介导的 -内酰胺酶调控蛋白 BlaI、BlaRI 代替 mecI、mecRI 的作用。此时，PBP2产生不受 mecA操纵基因控制。临床上分离的多重耐药 MRSA，大多兼有 mec操纵基因的破坏和质粒 -内酰胺酶基因的调控。2、耐药性监测试验1）基因监测(1)核酸探针杂交技术：目前，mecA 基因已克隆，以据此设计的探针标记 32P、地高辛和酶等即可进行菌落原位杂交、斑点杂交和 South
26、ern印迹等检测。(2)PCR技术：mecA 基因具有高度保守性，可选择无或少潜在突变位点、GC 含量约为 50的基因区域设计 PCR引物。2）表型检测 MRS 的耐药监测有四种方法：K-B 纸片扩散法、稀释法、E 试验法和琼脂筛选试验。CLSI/NCCLS 规定了试验的条件、质量控制和结果的判断。推荐质控敏感株为ATCC29213，耐药菌株为 ATCC433300。值得注意的是，苯唑西林 MIC值为 28ug/ml 被判为 MRSA的金黄色葡萄球菌可能具有mecA基因，也可能是因为产高水平 -内酰胺酶，以至缓慢水解苯唑西林。临床治疗 MRSA引起的感染首选万古霉素，而治疗产高水平 -内酰胺酶
27、菌株所致感染，则应使用对酶稳定的 -内酰胺类药物或 -内酰胺/-内酰胺酶抑制剂合剂。因此，MIC 值为 28ug/ml的金黄色葡萄球菌应以 PCR方法确证。（二）耐万古霉素和高水平氨基糖苷类肠球菌13肠球菌对多种抗生素固有耐药，其引起的感染，如细菌性心内膜炎，一般都需要联合应用 -内酰胺类/多肽类与氨基糖苷类两类抗生素协同治疗以提高杀菌作用。若肠球菌对多肽类抗生素或高水平氨基糖苷类抗生素耐药，就没有有效的治疗方案。所以临床实验室需及时检测耐多肽类抗生素或高水平氨基糖苷类菌株，以指导临床医生使用有效的抗生素。1）耐药性产生机制1耐高水平氨基糖苷 肠球菌对氨基糖苷类的耐药性分为天然耐药和获得性耐药
28、两种。天然耐药主要为摄入药物减少，表现为低、中等剂量的耐药。获得性耐药主要是产生质粒编码的修饰酶、核蛋白体靶位改变(如对链霉素耐药)。2耐万古霉素肠球菌对万古霉素的耐药性也分为天然耐药和获得性耐药两种 天然耐药，又称 VanC型耐药，主要包括鹑鸡肠球菌、铅黄肠球菌和微黄肠球菌，其对万古霉素呈低水平耐药，对替考拉宁敏感。获得性耐药从其表型分为两类：VanA 型和 vanB型。VanA型对万古霉素和替考拉宁均高度耐药，VanB 型对万古霉素呈不同水平的耐药性，对替考拉宁敏感。2）耐药性监测试验1耐高水平氨基糖苷类肠球菌 肠球菌若对庆大霉素耐药，则对除链霉素以外的其他氨基糖苷类均耐药，所以常规耐药性
29、检测试验主要是庆大霉素和链霉素的药敏试验。CLSI/NCCLS推荐的试验方法有琼脂稀释法、微量肉汤稀释法和纸片扩散法。MIC 判定界值庆大霉素为 500ug/L，链霉素为 2 000ug/L，链霉素试验时，若 24h为阴性，则还须继续培养 24h，再读结果。纸片扩散法则使用 120ug/片的庆大霉素和 300ug/片的链霉素，中介结果需补做 MIC。推荐质控敏感株为粪肠球菌 ATCC 29212，耐药株为粪肠球菌 ATCC 51299。2耐万古霉素肠球菌 临床有许多方法可检测耐万古霉素肠球菌，包括纸片扩散法和自动化仪器(Vitek 和 MicroScan系统)，但在检测低水平耐万古霉素肠球菌(
30、VanB 和 VanC型)时，敏感性降低。因此，CLSI/NCCLS 推荐琼脂筛选法作为耐万古霉素肠球菌检测的经典方法。琼脂筛选法的敏感性和特异性分别为 9699和 l00。琼脂筛选法用 6ug/ml万古霉素脑心浸液琼脂。推荐质控敏感株为粪肠球菌 ATCC 29212，耐药株为粪肠球菌 ATCC 51299。（三）耐青霉素肺炎链球菌肺炎链球菌对青霉素 MIC2ug/ml判为耐药，0.122.Oug/ml 间判为中介。青霉素耐药机制是青霉素结合蛋白(PBP)的改变，肺炎链球菌对青霉素敏感，也对其他 -内酰胺类药物敏感；对青霉素耐药，则可能对一种或多种其他 -内酰胺类药物耐药。1、耐药性产生机制1
31、4肺炎链球菌耐青霉素主要在于 PBP(最主要 PBP2)的改变，减低了对 -内酰胺类的亲和力。肺炎链球菌包含 6种 PBP(1a、1b、2a、2x、2b 和 3)。在青霉素敏感株，这些 pbp基因高度保守(20mm，说明此株菌对青霉素敏感，也对其他 -内酰胺类药物敏感；但是，抑菌圈直径19mm，不能轻易地归为耐药，要测定此菌的 MIC值而定。例如，许多菌株青霉素 MIC值为 0.06ug/ml(敏感)，但抑菌圈直径19mm。因此，如果做了苯唑西林筛选试验，而无 MIC试验支持，有可能造成潜在的不恰当的治疗方案，特别是在青霉素耐药刚形成时，MIC 很可能是在中介范围内的。（四）产超广谱 -内酰胺
32、酶细菌超广谱 -内酰胺酶(ESBL)主要见于肠杆菌科细菌，是目前肠杆菌科细菌(尤其是肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌和产酸克雷伯菌)对广谱头孢菌素产生耐药性的最主要原因，它由质粒介导，可使细菌对青霉素和一、二、三代头孢菌素以及单环菌素耐药，但对头霉素、碳青霉烯及酶抑制剂(克拉维酸)复合制剂敏感。1）产生和分类ESBL属于 Bush功能分类的 2be亚组，分子结构分类中的 A类酶，包括 TEM、SHV 起源ESBL和非 TEM、SHV 起源 ESBL。前者是由广谱 -内酰胺酶 TEM-1/2和 SHV-l经 14 个点突变，增强了对广谱 -内酰胺类抗生素的催化能力和亲和力而形成，也是现在世界各地最主要的
33、流行类型。后者主要包括 CTX-M系列和 PER-1等，这些酶在世界某些地区有少量报道。2）耐药性监测试验不同种类的 ESBL由于突变点不同，其介导的耐药表型也不一致，但 CLSI/NCCLS规定不管体外药敏结果如何，只要确定为产 ESBL菌株，对所有三代头孢菌素和氨曲南均应报告耐药。ESBL的实验室检测主要是基于它可被酶抑制剂克拉维酸所抑制的原理。同时选用多种抗生素，如头孢曲松、头孢他啶、头孢噻肟、头孢泊肟和氨曲南，作为检测底物能提高检15出率。需注意的是，由于抗生素使用的差异，在我国用头孢噻肟作为检测底物对 ESBL的检出率明显高于用头孢他啶作为检测底物，正好与欧美等西方国家相反。CLSI
34、/NCCLS已经规定了肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌和大肠埃希菌 ESBLS检测的初步筛选和表型确证试验，需要注意的是，CLSI/NCCLS 强调，CLSI/NCCLS 文件所描述的测试仅适用于肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌和产酸克雷伯菌，虽然其他肠杆科细菌以及某些非肠杆菌科细菌也能产生 ESBLs。下面仅介绍非 CLSI/NCCLS规定 ESBL检测方法。1双纸片协同试验 按标准纸片扩散法进行操作，将待检菌菌液均匀涂布于平板。待平板稍干后，中央贴上阿莫西林/克拉维酸纸片，然后在距该纸片 25mm(中心-中心)处分别贴上头孢曲松、头孢他啶、头孢噻肟和氨曲南等药敏纸片作为指示剂，35孵育 1618h观察结
35、果。若指示剂在朝向阿莫西林/克拉维酸方向有抑菌圈扩大的现象(协同现象)，则说明待检菌产生超广谱 -内酰胺酶。双纸片协同试验检测 ESBL应注意纸片的距离，缩小两纸片问的距离可提高试验的敏感性，但抗生素纸片的抑菌圈会因纸片距离太近而发生融合，影响结果的判断。2三相水解试验分为直接法和间接法 按标准纸片扩散法进行操作，将待检菌菌液均匀涂布于平板。待平板稍干后，贴上头孢曲松、头孢他啶、头孢噻肟和氨曲南等药敏纸片作为指示剂，然后在距离抗生素纸片 3mm的位置挖一个直径 2mm的孔，在孔中加入 30ul 0.5麦氏浓度的待检菌菌液，35孵育 l618h 观察结果。若抗生素纸片周围的抑菌圈形状发生改变，试
36、验为阳性，说明待检菌产生超广谱 -内酰胺酶。如果在上述抗生素周围的抑菌圈很小或观察不到抑菌圈时，应改用间接法。间接法与直接法的不同之处在于，间接法涂布的不是待检菌菌液，而是对上述抗生素均敏感的大肠埃希菌 ATC/2 25922的菌液。三相试验在操作上较困难，敏感性也不是很高，限制了其常规应用。3E-test E-test 检测 ESBL是基于检测 MIC值的原理，共包括 4种抗生素药物试条：头孢他啶、头孢他啶+克拉维酸、头孢噻肟和头孢噻肟+克拉维酸。其操作方法与常规纸片法药敏试验的操作相同。当头孢他啶与头孢他啶+克拉维酸的 MIC比值或头孢噻肟与头孢噻肟+克拉维酸的 MIC比值大于或等于 8(
37、即 3个对倍稀释度)，即判定为此细菌产生 ESBL。4自动化仪器 MicroScan、Vitek 等都有检测 ESBl。的专用试条和专家系统。其原理也是基于先测定细菌对抗生素的 MIC值。判断标准同 E-test法。5其他方法 可利用等点聚焦电泳、PCR、基因测序等生化和分子生物学方法检测、鉴定、监测 ESBL。（五）产头孢菌素酶细菌头孢菌素酶即 AmpC伊内酰胺酶，属于 Bush分类 l组(C 类)丝氨酸头孢菌素水解酶，可介导细菌对三代头孢菌素的耐药，且不能被酶抑制剂克拉维酸所抑制，并且克拉维酸是其很强的诱导剂。-内酰胺类抗生素中仅对四代头孢菌素、碳青霉烯类抗生素仍敏感。1、产生和分类16A
38、mpC-内酰胺酶可由染色体或质粒介导。几乎所有肠杆菌科细菌(除了沙门菌属和克雷伯菌属的某些种)和铜绿假单胞菌都可产生染色体 AmpC酶。染色体 AmpC酶可分为诱导型和非诱导型。前者主要存在于阴沟肠杆菌、枸橼酸杆菌、吲哚阳性变形杆菌、黏质沙雷菌和铜绿假单胞菌，在自然状态下细菌产生此种酶的量很少，但在 -内酰胺类抗生素(尤其是头孢西丁和亚胺培南)或肛内酰胺酶抑制剂(如克拉维酸)的作用下可大量诱导 AmpC酶的产生(增加 l001 000 倍)。而且其调控基因的突变率很高，突变后将使酶不需诱导而持续大量产生，成为持续高产型菌株。后者主要存在于大肠埃希菌和志贺菌，由于调控基因缺陷，无论诱导剂是否存在
39、，此种酶的产量都很少，临床意义不大。但突变后酶也可持续大量产生，成为持续高产型菌株。染色体 AmpC酶的持续大量表达与调节基因突变有关。天然状态下的染色体 AmpC酶是典型的诱导酶，受 amp复合操纵子的调控，其诱导调控机制已基本阐明。amp 复合操纵子的诱导表达与细菌细胞壁肽聚糖循环有关，它由 4个不连续基因即 ampC、ampR、ampD 和 ampG组成。ampD 的某些突变，可导致 AmpD蛋白活性下降或缺失，使菌体内 N-乙酰胞壁酰三肽(细胞壁肽聚糖降解产物)大量累积，从而激活 AmpR启动 ampC基因的表达。ampR 的某些突变可降低 AmpR对 ampC表达的阻遏作用。质粒 A
40、mpC酶主要位于肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌、大肠埃希菌、奇异变形杆菌、伤寒沙门菌和产气肠杆菌中。迄今为止共发现 25种质粒 AmpC酶，并且以每年 12 个新型别的速度增加。通常，质粒 AmpC酶不需诱导便可持续大量表达。且质粒能够在不同细菌间播散，将引起比染色体 AmpC酶更严重的问题。根据质粒 AmpC酶和染色体 AmpC酶的氨基酸序列的同源性，将质粒 AmpC酶按其染色体起源分为多个组：来源于弗劳地枸橼酸杆菌染色体的，包括 LAT-1/2/3/4、CMY-2/3/4/5/6/7/8/9和 BIL-1；采源于铜绿假单胞菌染色体的，包括 CMY-1/8、FOX-1/2/3/4/5/6和 MO
41、X-1/2/3；来源于阴沟肠杆菌染色体的，包括 MIR-1、ACT-1；来源于摩根菌染色体的 DHA-1；来源于黏质沙雷菌色体的 ACC-1。2、耐药性监测试验由于诱导型染色体 AmpC酶基因几乎存在于所有肠杆菌科细菌中，所以通过诱导检测染色体 AmpC酶通常没有临床意义。临床上，对有可能产诱导型 AmpC酶的菌株(阴沟肠杆菌、枸橼酸杆菌、吲哚阳性变形杆菌、黏质沙雷菌和铜绿假单胞菌)应严格控制头孢菌素等酶诱导剂的使用。非诱导持续表达 AmpC酶的检测方法尚未标准化。比较好的方法有间接三相试验和多重PCR。间接三相试验方法如下：将 50ul 0.5麦氏浓度的待检菌菌液加入 12ml胰蛋白肉汤，3
42、5孵育 4h，离心收集沉淀，反复冻融 5次获得酶粗抽液。将大肠埃希菌 ATCC 25922的菌液按标准纸片扩散法均匀涂布于平板，平板中心贴上一张头孢西丁纸片，用无菌手术刀片由距纸片边缘 5mm处以辐射状方向向外划一道长的沟槽，然后将 2530ul 酶粗抽液由内向外均匀加入沟槽(不要溢17出，以免假阳性)，35孵育过夜。若沟槽和抑菌圈的交界处出现抑菌圈的缺损，则为阳性结果。（六）多重耐药结核分枝杆菌世界卫生组织(WHO)估计全球受结核分枝杆菌(MTB)感染的人数达 20亿，其中有 5 000万人感染了耐药结核分枝杆菌，至少又有 1/3以上有发生多重耐药结核病(MDR-TB)的危险。MDR-TB
43、治愈率低，治疗费用高，已成为 20世纪后期全球结核病回升的主要原因之一，也是当今全球结核病研究的重点和难点。我国是结核病高发国家，耐药率很高，其中多重耐药更为严重。1、耐药性产生机制1）细胞膜或壁渗透阻碍 MTB 细胞壁含极丰富的脂质(3060)，构成了 MTB的通透性屏障。分枝杆菌的某些特性如抗酸性、生长速率缓慢和对广范围抗菌药物的固有耐药，在很大程度上被认为与细胞壁渗透阻碍有关。2）药物靶蛋白编码基因突变 近年的研究表明，抗 MTB药物靶蛋白的染色体编码基因发生突变是 MTB耐药的主要分子机制。已确定耐药的抗结核药物主要是利福平(RFP)、异烟肼(INH)、链霉素(SM)、吡嗪酰胺(PZA
44、)、乙胺丁醇(EMB)和喹诺酮类。(1)利福平耐药的分子机制：利福平属一线抗结核药物，是快速杀菌剂。其作用机制是通过与 RNA聚合酶 B亚基(rpoB 基因编码)结合，干扰转录的开始和 RNA延伸。MTB耐利福平的机制可能与 RNA聚合酶 t3亚基空间构象发生变化，以致不能与 RFP结合有关。研究表明，95左右的 rpoB突变发生在 507-533位置 27个氨基酸密码子(81bp)组成的区域内。突变率最高的是 531位(丝氨酸-亮氨酸)，次之为 526位(组氨酸-酪氨酸)等。目前，rpoB 突变已作为 MTB耐利福平的遗传标志。(2)异烟肼耐药的分子机制：异烟肼是重要的一线抗结核药物。近年的
45、研究表明，MTB耐异烟肼可能与以下因素有关。过氧化氢酶-过氧化物酶编码基因(KatG)突变：KatG 基因含 2 223个核苷酸，其表达的过氧化氢酶一过氧化物酶，在异烟肼抗 MTB作用中起关键作用。若 KatG缺失或突变，使过氧化氢酶一过氧化物酶活性丧失或降低，将导致 INH耐药。研究表明，5070的耐异烟肼 MTB菌株有 KatG突变，最常见的突变位点是 463位(精氨酸-亮氨酸)和 315位(丝氨酸-苏氨酸)。1024的 MTB临床分离株 KatG完全缺失。inhA 基因突变：inhA 基因编码一种与分枝杆菌酸生物合成有关的还原酶。其产物为 32kD的蛋白质。目前发现，inhA 基因的突变
46、主要为 94位的丝氨酸-丙氨酸的置换。烯酰基还原酶基因(ahpC)突变：它控制过氧化氢酶-过氧化物酶的编码基因 KatG和烷基过氧化氢酶的编码基因 ahpC等的表达。目前发现 ahpC基因突变可导致 ahpC表达增强，但其与耐异烟肼的关系尚不清楚。(3)链霉素耐药的分子机制：链霉素也是目前治疗结核病的一线药物。它主要作用于 MTB的核糖体，诱导遗传密码的错读，抑制 mRNA转译，从而抑制蛋白质合成。近年来的研18究表明，大多数菌株耐链霉素是由于核糖体蛋白 Sl2编码基因(rpsL)和或 l6SRNA编码基因(rrs)突变所致。rpsL 基因的突变，主要是 43位密码子上一个单碱基的置换。rrs
47、 基因的突变，主要是 513、516 位的碱基插入。(4)吡嗪酰胺耐药的分子机制：吡嗪酰胺作为一线抗结核药物已有近 50年的历史。吡嗪酰胺是半休眠的杀菌剂，因而可缩短抗结核疗程。研究表明，MTB 耐吡嗪酰胺是由于其吡嗪酰胺酶编码基因(pncA)突变，使吡嗪酰胺酶活性丧失或降低，而不能将吡嗪酰胺转变成活性型的吡嗪酸而发挥杀菌作用。研究发现约 72的 MTB耐吡嗪酰胺菌株有 pncA突变，大多数为点突变，少数为插入或缺失突变。pncA 基因全长 561bp，其 47、85 和 70位是突变率较高的部位。但有 28的耐吡嗪酰胺菌株在 pncA基因及其上游 85bp区域内末发现突变，说明还存在其他耐药
48、机制。(5)乙胺丁醇耐药的分子机制：乙胺丁醇的作用机制和 MTB耐乙胺丁醇的机制还不十分清楚。已知乙胺丁醇是一种阿拉伯糖类似物，作用于靶分子阿拉伯糖基转移酶，抑制了细胞壁分枝菌酸-阿拉伯半乳聚糖-肽聚糖复合物的形成，使靶分子在细胞内的药物(如利福平)更容易进入细胞，因此乙胺丁醇与利福平联合治疗结核病有协同作用。MTB耐乙胺丁醇与阿拉伯糖基转移酶的编码基因(embABC)操纵子突变有关。该操纵子约 l0.2kb，由 embC、embA 和 embB三个基因组成。研究发现，约 70的 MTB耐乙胺丁醇分离株有 embB基因突变，突变位点以 306位多见。embB 基因约 3246bp，编码一个糖基
49、转移酶，embB 突变影响了乙胺丁醇和糖基转移酶的相互作用。余下 30乙胺丁醇耐药株无 embB突变，说明存在其他耐药机制的可能。(6)喹诺酮类药物耐药的分子机制：喹诺酮类药物作用于 MTB的 DNA旋转酶，抑制其活性，使 DNA双链不能被解开，DNA 复制停止，达到杀菌作用。DNA 旋转酶由 A、B 亚基组成。A 亚基编码基因(gyrA)长 2517bp，位于 B亚基编码基因(gyrB，长 2060bp)下游 36bp处。9yrA 的 67106 位点被认为是喹诺酮类药物的作用位点。研究表明，MTB 耐喹诺酮主要是 gyrA突变所致。目前报道的细菌耐哇诺酮基因突变几乎都位于该区域，因此该区域被称为喹诺酮耐药决定区。现已发现的 gyrA突变点主要有 94、90、88 位等。尚未见 9yrB突变的报道。(7)多重耐药的分子机制：一般认为 MTB的多重耐药主要是由于各种药物作
