1、药物制剂工程溶栓剂的研发现状及展望生技082邵丽2008054028溶栓剂的研发现状及展望摘要：由血栓引起的血栓性疾病是一种常见的心脑血管疾病。溶栓剂是预防与治疗心脑血管疾病的主要抗血栓药物。本文总结性地概述了目前国内外各种新型溶栓剂的溶栓机理、临床应用效果及其副作用等。其中，第三代溶栓剂组织型纤溶酶原激活剂变异体、导向溶栓剂、嵌合体溶栓剂。以及部分天然溶栓剂包括蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂、蛇毒纤溶酶原激活剂、水蛭素及其变异体等均通过将纤溶酶原激活为纤溶酶溶解血栓。临床实验结果表明它们在延长体内半寿期、增强对血纤维蛋白选择性和溶栓效率等方面有较大的改进，但溶栓治疗后的冠状动脉再栓塞，颅内出血等问题
2、仍是目前未解决的难题；而纳豆激酶及豆豉纤溶酶由于溶栓原理的不同，引起内出血的几率较低。溶栓剂未来的发展方向为如何综合不同药物的优点，使其更加安全与廉价。关键词：溶栓剂；现状；展望；血栓；纳豆激酶Thrombolytic agent status and prospects of developmentAbstract: Thrombosis caused by the thrombosis is a common cardiovascular disease. Thrombolytic agents is the prevention and treatment of cardiovascul
3、ar and cerebrovascular diseases, the main anti-thrombosis drugs. This summary overview of the current home and abroad, new thrombolytic agent thrombolytic mechanisms, clinical effects and side effects. Among them, the third-generation thrombolytic agent tissue plasminogen activator variant, oriented
4、 thrombolytic agents, thrombolytic agents chimera. And some natural thrombolytic agents, including bat saliva plasminogen activator, venom plasminogen activator, hirudin and its variants etc by plasminogen activator plasmin dissolves clots. Clinical results show that they extend in vivo half-life, e
5、nhancement of fibrin selectivity and efficiency of thrombolytic therapy have a greater improvement, but after thrombolytic therapy of coronary artery embolism, intracranial hemorrhage and other problems are still not currently solve problems; and nattokinase and tempeh plasminogen thrombolytic princ
6、iple because different lower risk of causing internal bleeding. The future development of thrombolytic agents for the how to integrate the advantages of different drugs, to make it more safe and cheap.Keywords: thrombolytic agent; the status quo; outlook; thrombosis; nattokinase由血栓引起的血栓性疾病是一种常见的心脑血管
7、病，常表现为心肌梗死、缺血性脑梗死、静脉血栓栓塞，是中老年人易发的疾病之一，而且目前青年病人的数量也在上升。据世界卫生组织(WHO)估计。全世界每年死于心脑血管病的人数超过l 200万人。其中在美国，男性急性心肌梗死的死亡率达27，女性为44o LH在我国，每年需要进行溶血栓治疗的人数超过300万，每年死于心脑血管疾病的人数约为200万人，占因病死亡总人数的407，其比例远高于癌症，居各类死因之首J。因此，心脑血管疾病已成为对人类健康的最大威胁之一。溶栓剂是预防与治疗心脑血管疾病的抗血栓药物，主要通过纤溶酶原激活剂激活纤维蛋白溶解酶原转化成纤维蛋白溶解酶，纤维蛋白溶解酶催化血栓的主要基质纤维蛋
8、白水解；还有一些直接作用于纤维蛋白，使其水解，最终达到使血管再通的目的。在制定抗血栓形成的治疗策略时，首先要注意到溶栓剂治疗，因为溶栓剂可去除一个已形成的血栓，这种方法的优点是治疗后两周内死亡率较低。因此，寻找和研制效果好、副作用小的溶栓治疗药物，对于更有效地治疗严重危害人类健康的心脑血管疾病具有十分重要的意义J。本文就溶栓剂的发展及目前新型溶栓剂的类型特点做了总结和概述，展望了溶栓剂进一步发展的方向。1溶栓剂发展概述从溶栓剂开始作为药物使用到现在，溶栓剂的开发基本分为3代HJ。第一代溶栓剂包括链激酶(SK)和尿激酶(UK)。链激酶因治疗后病人体内能保持46个月高抗体水平，作为一种细菌蛋白，重
9、复治疗易引起过敏，重者导致病人死亡，因副作用较大，临床应用量逐年减少。而尿激酶近年的销售趋势稳中有升，约占国内溶栓药30的市场份额。链激酶和尿激酶对栓塞性疾病均有一定的疗效，且价格便宜，已经列入我国国家医保甲类目录。这两个品种的主要不良反应是引起机体广泛出血，尤其是发生颅内出血的危险性很大。它们虽然具有较好的溶栓效果，但缺乏纤维蛋白选择性，除了能激活血栓表面的纤溶酶原外也能激活血浆中游离的纤溶酶原，使a2一抗纤溶酶大量消耗及纤维蛋白原降解，产生全身性出血副作用5|。组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)、尿激酶原(proUK)和乙酰化纤溶酶原一链激酶激活剂复合物(APSAC)和葡激酶属于第二代溶栓剂
10、。tPA和pro-UK体外和动物实验中都有明显的纤维蛋白亲和性，出血副作用较小。APsAc为链激酶的换代产品，在体外无溶栓活性，进入血液后，与纤维蛋白结合后发生脱酰基水解反应，形成有活性的SK一纤溶酶原复合物，激活纤溶酶原。该类药物的纤溶作用均优于第一代溶栓药。但是总体来讲，无论是第一代还是第二代溶栓药物，都有纤维蛋白特异性差、体内半寿期短、需大剂量连续用药等缺点。为了克服现有溶栓剂的不足，人们想方设法对现有的溶栓药物进行改造，即第三代溶栓剂，包括SrAR、rtPA、K1K2Pu、K2P和TNKPA等，以及正在研制的新型溶栓剂。目前的研究方向是在增强或保持其催化活性的前提下，通过对某些特定氨基
11、酸残基的突变或是通过相关结构域的删除、增加或融合等手段，达到以下目标：1)提高对纤维蛋白的选择性；2)提高对纤溶酶原激活剂抑制剂的抗性；3)延长其在血液循环中的半寿期；4)导向溶栓性能；5)抗血栓形成。这些领域还有很多处于实验室研究阶段61。2代表性新型溶栓剂理想的溶栓剂应具备如下特点：高效(梗死动脉再通率高，并达到充分、持续再通)、安全(颅内出血发生率低)、低毒(无抗原性)、用药方便(如弹丸式给药法，且伴随用药简便)、易于获得、成本低廉等。可能的寻找途径：一是寻找符合上述特征的天然来源的溶栓药物，并将其转化为基因工程产品；二是用分子生物学理论和基因工程技术，对现有的溶栓剂进行分子重组和修饰，
12、研制新型溶栓剂，使之符合上述特征。下面介绍几种目前有代表性的新型溶栓剂。21组织型纤溶酶原激活剂变异体组织型纤溶酶原激活剂(Tissue type plasminogen activator，tPA)是最经典的纤溶酶原激活剂，它是一种分子量70 kD，由527个氨基酸残基组成的丝氨酸蛋白酶，基本分为5个独立的结构域：F区、EGF区、Kl、K2及蛋白酶区。Bennett等研究发现F区、EGF区和l(2区的突变对血纤维蛋白的亲和性和刺激作用都有影响【7。此外I(2区对血纤维蛋白的热稳定性及空间结构的维持也有重要贡献。另外F区和EGF区也与tPA在血液中的清除速率有关81。目前已应用现代分子生物学技
13、术对t-PA的5个结构功能区进行改造和优化，研制出了一系列tPA变异体，它们是第三代溶栓剂的代表。其主要特点为纤维蛋白特异性增强，抗纤溶酶原活化物抑制剂(Plasminogen activator inhibitor，PAl)活性增强，半衰期延长，便于静脉注射使用等。1)rPA(Reteplase) r-PA是由德国研制开发的tPA突变体，它删除了t-PA中与体内清除有关的F、E、K1区，延长了半寿期，并且保留涉及赖氨酸结合、血纤维蛋白结合和依赖于血纤维蛋白的纤溶酶原激活作用的l(2区9。其特点是对纤维蛋白的结合力较t-PA下降5倍，从而使药物更易自由扩散到血凝块中，起效迅速，血栓更易被溶解，
14、在同等溶栓能力时，所用剂量比t-PA小，但其对陈旧性血栓的溶解能力低于t-PA；其半衰期较长，间隔30 min分两次静脉推注给药即可，且无需随体重调节剂量，给药方便.。2)Monteplase(E26010) Monteplase是由日本研制开发的t-PA点突变体，其特点是激活纤溶酶原的能力在纤维蛋白存在时较无纤维蛋白时强149倍，作用持续，不产生抗体，半衰期长达20 min以上。动物模型显示其具有良好的再通率1I。3)TNKtPA(Tenecteplase，metalyse) I NKtPA是由美国研制开发的t-PA多点突变体，此突变体综合了提高血纤维蛋白专一性和降低对PAI-l敏感性的KH
15、RR296-299 AAAA突变(K)，降低体内清除速率、半寿期延长的Thrl03Asn突变(T)和缺乏高甘露糖侧链的Asnll7Gin突变(N)u2I。TNKtPA具有许多优良特性如半衰期长，仅需单次弹丸式静脉注射给药；纤维蛋白特异性增加14倍；PAI活性增强80倍；几乎不影响机体凝血系统，内在致血栓作用小于其他纤溶酶原激活剂等31。这些决定了其血管再通更迅速、更持久，血栓溶解作用更强、更完全，对富含血小板的血栓其作用更明显，并已得到多种动物实验证实。4)n-PA(Lanoteplase) n-PA是由美国研制开发的tPA缺失和点突变体，其特点是对纤维蛋白的亲和力降低，但其溶栓活性增强；肝脏
16、的清除率减慢，半衰期延长，可单次静脉给药，按体重调节剂量；其抗PAIl活性增强，因而再闭塞率降低4|。22导向溶栓剂导向溶栓是指将传统溶栓药物与抗纤维蛋白抗体或抗血小板表面蛋白抗体相结合形成复合物，因此该复合物既有血栓特异的结合位点，又有溶解血栓的效应位点，从而使溶栓药物导向性地浓集于血栓部位而发挥超强溶栓作用。导向溶栓是新型溶栓剂的研发热点，通常选择抗体和疗效均最强的药物来进行基因重组，溶栓效力可增强几倍至几十倍，比如将单克隆抗体与来自蛇毒的溶纤酶相联接等，主要不足是这些复合物分子均有潜在的抗原性，价格昂贵，均尚未用于人体。王红霞等研究用精一甘一天冬一丝氨酸(ArgGlyAsp-Ser，RG
17、DS)肽修饰的脂质体作为载体包裹溶栓剂而实现导向溶栓，有较好的临床应用前景。RGDS肽与活化的血小板膜糖蛋白bma受体相结合，是血栓形成的最后共同通路。RGDS肽分子量小，是机体内源性存在的物质(纤维蛋白原降解片段)，无免疫原性，而脂质体为磷脂双层分子层组成的环行封闭囊泡，对身体无明显的毒副作用，无免疫原性，是用于构建导向溶栓分子复合物的优良选择，目前还在实验研究阶段引。Runge等通过二硫键将tPA与抗纤维蛋白的单克隆抗体59D8偶联，杂合分子对纤维蛋白亲和性是UK的100倍，是t-PA的10倍。体内实验则显示杂合分子的溶栓能力比t-PA强28“-96倍。此外还将scuPA-32k与59D8
18、通过分子重组构建了I8CHPA-32k59D8，嵌合分子的溶栓能力比seuPA提高了6倍，体内导向溶栓的性能明显增强，并具有一定的抗栓能力6。Tanake等利用膜连蛋白V(Annexin V)构建了另一类导向型溶栓分子。由于在血栓形成过程中血小板活化后暴露出大量的磷酯酰丝氨酸，而AnnexinV对磷酯酞丝氨酸具有很强的亲和性。将AnnexinV和uPA的B链通过二硫键偶合到一起得到Annexin-uPA，体外溶栓实验表明杂合分子的活性与UPA相当，在大鼠肺栓塞的模型中的溶栓实验表明溶栓活性比u-PA高34倍.o。Jiang等着眼于血栓表面富含活化的血小板，将抗活化的血小板表面糖蛋白GMPl40
19、的单克隆抗体SZ51，与低分子量尿激酶原(seuPA-32k)或尿激酶原(scuPA)融合后获得了嵌合分子，体外分析表明两种嵌合分子与血小板具有很高的亲和性3。另外，Ruef等将抗纤维蛋白的单克隆抗体59D8和抗血小板表面糖蛋白GPIIba的单克隆抗体7E3与尿激酶进行偶联，获得了抗纤维蛋白-抗血小板一尿激酶的偶合蛋白(BAAUC)。偶合分子对血小板、GPIIbIIIa以及纤维蛋白的亲和性分别是尿激酶的10倍、58倍和13倍。偶合分子不但能高效地溶解富含纤维蛋白的血凝块，而且高效地溶解富含血小板的血栓，从而使导向溶栓的效果更明显、更理想。23嵌合体溶栓剂将分别属于2种溶栓剂的不同结构域有选择地
20、进行分子嵌合而构建成新的溶栓剂称为嵌合体溶栓剂，旨在结合2种溶栓剂的优点而提高溶栓效能，并减少或消除不良反应，是研制新型溶栓药物的又一新方向。现有的K1K2Pu嵌合体(Amediplase)为意大利Menarini公司研制开发，它是由t-PA分子上Kl三角域和K2三角域(Serl-GIIl3，Asp87-Phe274)与单链尿激酶(scu-PA)分子上的丝氨酸蛋白酶域(Serl38-Leu41 1)构建而成的嵌合体。K1 K2Pu嵌合体兼有t-PA和scu-PA两种分子的优点，其半衰期较t-PA和8euPA延长620倍，溶栓活性增强3一16倍，且不溶解纤维蛋白原，不激活全身溶栓系统。这些特性已
21、在多种动物栓塞模型上得以证实，并已开始进行期临床试验J。24天然溶栓剂指的是天然存在的、非人工合成的具有溶栓活性的物质，可来源于微生物、动植物等。1)葡萄球菌激酶(Staphylokinase，Sak)Sak是由金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)分泌的一种具有血纤维蛋白专一性，应用于临床并不会引起系统激活和出血副作用，是一个比较理想的纤溶酶原激活剂。由于其来源少且制剂纯度不高，现采用基因重组技术制成重组葡萄球菌激酶，即r-Sak。rSak不能直接将纤溶酶原转化为纤溶酶，而是与纤溶酶原形成复合物，该复合物无活性，只有在血栓表面微量纤溶酶的作用下，转变成Sak一纤溶酶复合
22、物，才能激活游离的纤溶酶原转化为纤溶酶而溶解血栓。r-Sak的半衰期短，需2次静脉注射给药。作为来自细菌的蛋白，rSak用于临床最大的缺陷是具有较强的抗原性。病人在用药一周后，会发生抗体介导的中和反应，抗原性较高导致了STAR在临床上不能连续注射，限制了其应用。如何降低该蛋白的抗原性就显得比较重要。近两年的研究发现其重组突变体SYl61免疫原性降低，而溶栓效力不变，可弥补这一不足，现正处于期临床试验阶段心11。此外，rSak是目前分子量较小的溶栓药物，还可制成口服制剂用于血栓病的预防。国产r-Sak已初步完成了其期临床试验忸J。2)蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂(DSPA，batPA)DSPA是吸血蝙
23、蝠唾液中的一种能促使伤口出血、血液流动的因子，其中DSPAal和DSPAa2与人tPA具有85的同源性，但它们不含怼区和纤溶酶作用部位，在动物溶栓试验中，DSPAotl优于tPA，其溶栓活性提高了25倍，半衰期延长了3倍，清除速率减慢了48倍。DSPAl3缺失F区，DSPA7缺失F和E区，与t-PA相比，这两种形式的纤溶酶原激活剂具有相当高的纤维蛋白特异性及较强的抗纤溶酶原激活剂抑制剂作用口引。虽具有潜在的免疫刺激性，但无变态反应发生。德国PAION公司研制开发了重组DSPAod，商品名为desmoteplase，半衰期长达28 h，可确保单次静脉推注给药，其用于急性缺血性脑卒中溶栓治疗的期临
24、床试验证实，剂量为125 mgkg的desmoteplase安全、有效，目前正处于期临床试验阶段J。3)蚓激酶(e-PA，Lumbrokinase) 正蚓科蚯蚓的水提物有直接溶解纤维蛋白及纤溶酶原激活作用，被称为蚓激酶(ePA)。中国科学院生物物理所研制了其口服胶囊制剂并已上市，目前国内外主要研究方向是将各种同工酶分离纯化，开发成水针剂型，并利用基因重组技术来生产ePA。我国已对脑梗塞患者完成了其胶囊制剂的期临床试验，临床上主要用于防治缺血性脑血管疾病、纤维蛋白原增高及血小板凝集率增高等患者。国外动物实验发现，e-PA对直径3 mm的微小移植血管具有良好的抗栓效应嗌1。4)蛇毒纤溶酶原激活剂(
25、TSV-PA) 是我国首次发现的一种天然纤溶酶原激活剂，现已研制出重组产品。它是从竹叶青蛇毒中分离得到的专一激活纤溶酶原的蛋白酶，是一种典型的蛇毒丝氨酸蛋白酶，目前尚处于实验研究阶段。TsV-PA只含有t-PA和尿激酶的催化结构域而不含有其他结构域，因此它只对纤溶酶原高度特异，缺乏与PAl1相互作用的序列，具有天然抗PAl1的能力哺j。重组聊PA在兔脑血栓模型中显示了其良好的体内溶栓活性，对AMI的疗效有待进一步研究。5)水蛭素(Hirudin) 首先从欧洲医蛭的唾液中分离出来的，现在用重组DNA技术生产。水蛭素是含有65个氨基酸残基的小分子多肽，具有特异直接抑制凝血酶功能，不受活化的血小板影
26、响。水蛭素和含20个氨基酸的水蛭肽均可用于冠脉形成术患者，4 312例临床应用表明，水蛭肽或水蛭素组的出血及其它副作用的发生率均比肝素组低。水蛭素与拮抗剂Integrelin小剂量联合疗法，可使冠脉血流由单独使用水蛭素的26 min提高到92 min，使血管再阻塞率下降至25。尽管水蛭素临床应用还不多，但由于它可延长或防止血管重新栓塞，比肝素具有更大优点，因此很有发展前景27。6)纳豆激酶(Nattokinase，NK) 1987年由须见洋行从日本传统食品纳豆中分离到的一种具有强烈纤溶活性的酶m J。该酶具有强大的溶栓效力，其溶栓时并不激活纤溶酶原，而是直接作用于纤维蛋白，同时能激活内皮细胞产
27、生纤溶酶原激活剂而间接溶栓，其纤溶活性为纤溶酶的4倍以上。该酶可使重组PAI-1失活，其失活后引起的间接纤溶效果比直接纤溶效果强。它半衰期长，可静脉注射，临床用法简便；此外，它具有抗胰酶水解能力，且分子量小，是一个单链蛋白质，易于被消化道吸收J。因此不仅可以静脉注射，制成口服剂型效果也好，并已经动物实验证实。而且，它来源于食品，无抗原性，安全性好；对纤维蛋白原不敏感，不水解血浆纤维蛋白质，故不易引起出血倾向；可用细菌进行液体发酵生产，造价低廉，若利用基因工程技术构建基因工程菌的方法还可大幅度提高产量，是一种十分理想的溶血栓药物。7)豆豉纤溶酶我国研究人员从豆豉中分离出多种具有高度纤溶活性的酶，
28、其半衰期长，无毒副作用，不引起内出血，具有十分重要的开发价值。其中，彭勇等从豆豉中首次筛选出具有纤溶酶活性的一株解淀粉芽孢杆菌DC-4，发酵液纤溶活性达520 IUml。DC-4分泌的纤溶酶对纤维蛋白具有较高的底物特异性，能高效地溶解体外血栓，并且不水解血细胞。DC-4纤溶酶分子量为28 kD，与纳豆激酶的氨基酸同源性865，核苷酸同源性为80。豆豉纤溶酶在分子水平和生化特性上均与NK和CK存在差异，是一种新的纤溶酶J。3展望近年来，我国人口老龄化程度日益加剧，生活水平的逐步提高，血栓性疾病的发生率不断上升，我国的抗血栓药物市场销售规模自2001年以来一直稳步增长，2004年市场增长率达为20
29、0l；2005年抗血栓药物销售同比增长了1792；到2008年，市场规模已扩充至30亿元以上【311。另外，抗血栓药物虽然品种繁多，但是离真正的安全、高效、低毒还有一定的距离。随着对溶栓剂分子空间结构和功能区域的研究，许多具有高效溶栓能力的新一代溶栓剂相继被开发出来，使用溶栓剂后带来的出血倾向，以及溶栓剂使用后再栓塞形成的趋势也在一定程度上得到克服。可是，应用现代分子生物学设计出的溶栓剂的高昂价格却不是我国普通民众所能够接受的。因此，研究开发低成本溶血栓药物具有显著的经济效益和重大的社会意义。理想的溶栓剂是综合各种优点于一体的完美结合，将几个理想的溶栓剂的优点综合到一起的一种广阔发展前景的溶栓
30、剂。这也正是大多数溶栓实验室现在需要去做的，总之，对溶栓剂的设计和开发有待于进一步探索。1American Heart AssociationStatistical supplementRDallas：American Heart Association，19972刘永军基因工程产品reteplaseOL(2002-07-23)2009-03-01hup：wwwhx863eom3Haber E，Queaennous T，Matsueda G R，et a1Innovativeappoaches to plasminogen activator therapyJScience，1989，243(
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43、it in the specific ecosystem and enironmentAs in the field of bionomicstourist rcso or attractions caIl also beseen a8 a biological unit in the field of tourismtouristun orattractionsThey also have a variety of ecological relationshipsthebiological units，for example the niche overlapTake the main ri
44、vers of Fuzhou 88 study obj，this paper analyzes the Fuzhou main rivefrom the perspctive of niche，in order to analyze the ecological relatonship among the rivers，thereby to identify its location in order toprovide relevant basis for the nogoing improvement and tourist development of Fuzhou main river
45、sFirst of all，it sunlg up and“hackles”aU the rclated literatures on the ecological niche and tourist ecolhethen combines the specific situation of Fuzhou main riverswith the analysis of the niche phenomenon of current improvement，repairs and future development。wellpoints out their problemsFinally，ac
46、cording to every rivers characteristics，it finds the tourist niche position and puts forward the niche strategies，which includejungle adventure in Baima river，history quest in Antai river，athletics and show in Jinan river and happy atmosphere in Xihu lakeInthis research，it is considered that the nic
47、he theory can provide a new view to the research of destination，tourist product andmrceMeanwhile，the niche strategeis can provide referecnce to other tourist developments about aquitiKey words：niche theory；tourist ecological niche；the tourism development of main rivers；niche strategy；Fuzhou Abstract
48、：Arterial thrombosis is the underling cause of a wide variety of cerebrocardiovascular diseasesAll the currently used thrombolyticagents a弛very efficient in restoring the blood flowThe recent development in thrombolytic drugsincluding the thirdgeneration thromblytic agents and natural thromblytic agents，is presented in this articleThe thrombolytic mechanism，adverse reaction andthe clinical application of these dnl98 ale especially introducedMost of the thirdgeneration thromblytic agents tile variants of tissuetype plasmino-gen activat
