1、 解脂假丝酵母自溶条件及神经酰胺的提取概要：采用细胞自溶法对影响解脂假丝酵母 33M(candidalipolytlca)细胞中神经酰胺含量的条件进行了研究。分别应用薄层色谱（TLC）方法和高效液相色谱蒸发光散射器（HPLC-ELSD）对其进行定性和定量分析，结果表明：解脂假丝酵母的最佳自溶条件为：自溶时间 24 小时，PH8.0，自溶温度为 50。真核细胞中普遍含有神经酰胺，作为一种信息和结构分子存在于细胞膜中，它可以保持水分以及促进水分的吸收，从而起到延缓衰老，抗皱纹的功效。从酵母中提取神经酰胺是一种方便和经济的方法，且得到的产品具有天然活性。酵母细胞壁破碎的方法很多，如自溶法 高压匀浆法
2、 超声波破碎发等。我们研究了自溶发对解脂假丝酵母 33M 中神经酰胺含量的影响，方法和结果如下：1. 材料方法菌种：解脂假丝酵母 33M 由清华大学微生物实验室保存。培养基：YPD 培养基。试剂：神经酰胺标样 V 有广州 cosmoferm 公司提供。2. 方法解脂假丝酵母自溶步骤：33M 接种 YPD 斜面培养基，30培养 24 小时，将斜面菌种接种到 100 毫升 YPD 液体培养基，200r/mim3024h，将 10ml 液体菌种转接于100mlYPD 液体培养基，200r/mim30培养 24h，6000r/mim 离心 20mim，用蒸馏水悬浮细胞，洗 2 次得到酵母湿细胞，加 2
3、 倍蒸馏水制成菌悬液，用 2NnaOH 调PH 为 8.0，50水浴自溶 24 小时。加入 8 倍体积的氯仿 50 摄氏度水浴 30 分钟，加入 4 倍体积的甲醇 50水浴 30 分钟，加入 3 倍体积的水使氯仿：甲醇：水的体积为 8:4:3,10000r/min 离心 10min 倒出上清液，细胞残渣重新提取一次。把第一二次抽提液合并，10000r/min 离心 10min，弃上清液，下层液体真空干燥，TLC.HPEC-ELSD 分析。1.2.2 解脂假丝酵母自溶条件1.2.2.1 自溶时间：将解脂假丝酵母湿细胞加 3 倍蒸馏水（W/W ）制成悬液，用 2N Na0H 调 PH5.5,60自
4、溶 8.16.24 小时提取神经酰胺，测定其含量。1.2.2.2 自溶温度：将解脂假丝酵母湿细胞加 3 倍蒸馏水（W/W ）制成菌悬液，用2N NaOH 调 PH5.5，分别在 50.55.60条件下自溶 24 小时，提取神经酰胺，测定其含量。1.2.2.3 PH 将解脂假丝酵母湿细胞加 3 被蒸馏水(W/W) 制成菌悬液，分别用 2N NaOH 和 0.1M HCI 调 PH4.5 5.5 8.0，在 60的条件下自溶 24 小时，提取神经酰胺，测定其含量。2.分析方法2.1 神经酰胺的定性: TLC 法：将样品溶于不同的氯仿中，取 20uI 样品上样。展开剂为氯仿 19：甲醇 0.9：冰乙
5、酸 0.1，展开后的硅胶板用硫酸铜溶液显色，晾干后160烘 20min。2.2 神经酰胺的定量：高效液相色谱-蒸发光散射法（HPLC-ELSD） 。此仪器为美国的 TSP 公司的 SpectraSystemP2000.检测器采用了蒸发光散射检测器 Sedex75 型（Sedere,法国） ，检测器温度 40，空气压力 3.5*10 次方 Pa，检测灵敏度为 8.色谱柱为 AIItimaCN 柱（ 5uI,4.6mm*250mmAIItech 美国）洗脱剂为正己烷 99：乙醇1，流速 1.0mI/min。定量分析时以样标浓度 C 和样品峰面积 A 为参数做出双对数曲线，对神经酰胺进行定量。3.结果在 PH 为 8.0，自溶温度为 50，自溶 24h，神经酰胺含量最高。酵母中含有 4 种蛋白酶中 3 种酶的最适作用温度为 5060 摄氏度，35以下不利于蛋白酶发挥作用，而且自溶过程中容易发生腐败变质，温度过高，会使酶失活。因此，50时神经酰胺含量最高，在此温度下，酵母细胞死亡，各类细胞酶原被激活，使菌体大分子物质降解为各种生物小分子并溢出细胞，从而使神经酰胺的含量大大增加。酵母细胞中含有的内原酶有其最适 PH，低于或高于最适 PH，则酶活降低，PH大于 8.0，自溶过程中容易发黄变臭。最适 PH 为 8.0，继续升高是否会影响神经酰胺的含量，有待进一步研究。
