1、细胞培养操作指南1，原代 细胞培养原代培养需要严格要求：（1）取材时需要去除脂肪和坏死的组织(2)为减少对组织的损伤，需用锋利的器具(3)适度离心以去除用于解离的酶（4）由于原代培养组织细胞的存活率很低，故用于原代培养的细胞的密度应高于正常的传代培养的细胞密度。 （5）营养丰富的培养基比单一的培养基更可取，如果要添加血清，胎牛血清比牛马的血清更好。(6)对于取材部位易于感染（如皮肤）应先用 70%乙醇消毒，在无菌条件下切除组织，尽快转移入 BSS 或培养基中。不要再培养室取材，因为动物可引入微生物污染。若必须推迟，可保存在 4，72h。1. 剪切组织 先将所取得的组织，用 D-Hanks 或
2、Hanks 液清洗，以去除表面血污，并用手术镊去除粘附的结缔组织等非培养所需组织。再次清洗后，用手术剪将组织剪成若干小块，移入青霉素小瓶或小烧杯中，加入适量缓冲液，用弯头眼科剪，反复剪切组织，直到组织成糊状，约 1mm3 大小。静置片刻后，用吸管吸去上层液体，加入适当的缓冲液再清洗一次。2. 消化分离 消化分离的目的是将细小的组织块消化分离成细胞团或分散的单个细胞，以利于进一步的培养，常用的消化酶有胰蛋白酶和胶原酶。3. 培养细胞悬液用计数板进行细胞计数，用培养液将细胞数调整为2510 5 cellsm1，或实验所需密度。分装于培养瓶中，使细胞悬液的量以覆盖后略高于培养瓶底部为宜。置 CO2
3、培养箱内，5CO 2，37静置培养。一般 35d，原代培养细胞可以粘附于瓶壁，并伸展开始生长，可补加原培养液量 12 的新培养液，继续培养 23 d 后换液，一般 714 d 可以长满瓶壁，进行传代。 注意事项：1. 无菌操作 细菌或霉菌污染是培养失败的常见原因，必须加强各个环节的无菌操作观念，以预防为主，一旦污染，一般是很难消除。 2. 培养液所用的培养液必须满足细胞生存和生长的必要条件。由于细胞来源的动物种类、组织类型不同，对培养液的要求有一定的差异，必要时可用预实验的方法选择适当的培养液。3. 小牛血清 小牛血清对于维持培养细胞的生存和促进细胞增殖起着关键性作用。可选择多种不同批号的小牛
4、血清进行小样分析。一旦确定某一厂家的某一批号小牛血清后，就保持应用至实验完成。4. 胶原酶溶液 必须新鲜配制，贮存时间过长(即使是-20低温保存)，也将影响消化效力，导致消化时间过长，细胞损伤增加。5. L谷氨酰胺 几乎所有细胞对谷氨酰胺都有较高的要求，细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质，在缺少谷氨酰胺时，细胞会因生长不良而死亡。谷氨酸胺在溶液中很不稳定，加有谷氨酰胺的培养液在 4冰箱贮存两周以上时，就应重新加入原来量的谷氨酰胺。6. 静置培养 原代细胞在消化分离后，置于 CO2 培养箱的头 24-48h (必要时 72 h)内，应处于绝对静置状态，切忌不时地取出培养瓶观察生长状况，这将使原代分
5、离细胞难以贴壁，更谈不上伸展和增殖。这对初学者尤应注意。不必担心培养液中的营养成份会消耗光，在细胞增殖之前对营养的要求并不大。原代培养初期仅加一薄层培养液的目的也在于有利于细胞贴壁伸展。7. 消化时间 一般消化至肉眼尚可见微小组织颗粒即可，因为此时组织颗粒已经松散，略经吹打即成细胞团或单个细胞，过久的消化往往导致细胞损伤加重，细胞培养成活率降低。8. 其它生长因子经过以上处理，一般原代分离细胞培养均可以成功。对于少数特殊类型细胞也可以考虑加一些特殊的生长因子。如胰岛素能促使细胞摄取葡萄糖和氨基酸。另外,内毒素、EGF、 FGF 等均有促有丝分裂作用，但费用较高。原代外植（组织块培养）简介：组织
6、切碎并清洗，组织块接种于培养瓶或皮氏培养皿的表面，加入少量含高浓度血清（40%-50%）的培养基，表面张力使标本保持原位，直到他们自发地贴附于表面，随后细胞开始生长。此方法适合小量组织培养，如皮肤活检组织，为了尽可能减少细胞损失，而不用酶或机械方法。操作流程：切割细切沉淀清洗清洗后用吸管转入培养瓶倾斜培养瓶吸出平衡盐溶液然后加入一薄层培养基培养 2-3w,无菌材料：培养基（DMEM 与 F12 等体积混合，再加 20%胎牛血清） ；100ml 的 DBSS;9cm 皮氏平皿，非组织培养级别；尖头镊子，尖头手术刀；100ml 广口移液器；15 或 20ml 离心管；25 平方厘米的培养瓶或 5
7、厘米的皮氏培养皿，大约 100mg 组织用 5 个25 平方厘米的培养瓶。开始每瓶放 1ml 培养基，随后 3-5 天每瓶加至 5ml.操作步骤：1，将组织移入新鲜无菌 BSS 浸洗2，移入第 2 个培养皿切除多余组织，如脂肪或坏死组织，用手术刀交叉切成约 1mm3 的小块。3，用移液管（先用 BSS 浸润，否则组织块易贴壁）将组织块移入 15 或 50ml 离心管或普通容器中，让组织块静置沉淀。4，用 BSS 重悬冲洗组织块后静置，去除上清液，重复两次或更多5，将 20-30 个组织块接种在 25 平方厘米的培养瓶内（记住湿润移液管）6，将培养瓶静置放置一会，待组织块沉下去，然后稍微倾斜吸出
8、液体，然后以每 25 平方厘米生长面加入 1ml 的培养基，缓缓倾斜培养瓶让组织块均匀分布于生长面上。7，盖上瓶盖，放到 37培养箱中 18-24h.8, 如果组织块已经贴附，则可在未来 3-5 天内将培养基加至 5ml.先预温，以后每周更换一次，直到细胞已生长9，外植块可以自生长中心用镊子取出，用预先浸洗的移液管移入新的培养器皿中， ，然后盖上盖子，再继续培养。10.更换第一瓶的培养基直至细胞生长超过生长面积的一半，此时细胞可以传代。总结：此种方法贴壁率很低，但是可用通过一些方法进行改进。如在外植物的上方放一块盖玻片，或将外植物置于盖玻片的边缘， 2 酶的解离消化组织中细胞与细胞之间的粘附是
9、依靠多种相互作用的同类糖蛋白分子，其中部分粘附分子具有钙离子依赖性（钙粘素） ，故对 EDTA较为敏感，螯合素含有钙离子结合结构域，可结合到细胞外机制中的 RDG 序列。细胞间基质和基底膜中含有其他糖蛋白对蛋白酶较为敏感；选择消化液最容易的方法是从单一的消化液入手，过渡至复合的消化液，开始用胰蛋白酶或胰蛋白酶/EDTA 的混合物，后加入其他蛋白酶促进消化。由于新生和成年动物细胞经开始分化，纤维结缔组织及细胞外基质增多，未分化的增殖细胞减少。对组织进行分离时，损害愈严重（长时间的胰酶消化，搅拌） ，组织越易被破坏成碎片，为了保持最大活性，无论酶的纯度如何，应该最大限度的减少胰蛋白酶对细胞的作用时
10、间。当整块组织在 37的胰酶中消化时，已分离的细胞应每隔半小时收集一次，胰蛋白酶经离心去除，再以含血清的培养基中和。即可以应用冷消化或温胰酶消化。2.1 胰酶的温消化此技术适应于在相当短的时间消化大的组织尤其是整个小鼠胚胎或鸡胚。由于成年组织有大量纤维结缔组织，故成年组织不用此法。较敏感的细胞如上皮细胞也不用此法。无菌材料：组织 1-5g,DBSS50ml,用 PBSA 或正常生理盐水配制的 2.5%粗制胰酶；PBSA 200ml,含血清的生长培养基（DMEM/F12 加 10%胎牛血清） ；培养瓶，每克组织 5-10 个(根据培养的细胞不同而改变） ；9cm 皮氏平皿，非组织培养级别；两个5
11、0ml 离心管；250ml 锥形瓶；磁力搅拌子在试管中高压消毒；弯头镊子，2ml,10ml 移液管。非灭菌材料：磁力搅拌器，细胞计数板操作步骤：1，将组织块移入加有新配制的无菌 DBSS 皮氏培养皿中，清洗2，转入另一培养皿，切除多余组织如脂肪或坏死组织，用刀切成约 3mm3 小块3，用弯头镊将组织移入 15ml 或 50ml 无菌离心管或容器中，让组织块沉淀4，用 DBSS 清洗组织块，组织块沉淀，去除上清液，如此反复 2 次以上。5，将组织块转入一个空的锥形瓶中，去除多余液体，然后加入 180ml 的 PBSA，6，加入 2.5%的胰酶 20ml。以使胰酶最终浓度为 0.25%7, 在锥形
12、瓶中加入搅拌子8，封住锥形瓶，放到搅拌器上，在 37 摄氏度温箱内搅拌9，每分钟 100r, 30min10,30min 后，收集解离的细胞: 让组织块沉淀； 吸出上清液，置入离心管中，放在冰上，向锥形瓶中加入新的胰酶溶液消化剩余的组织块，继续搅拌并孵育 30min; 收集的细胞悬液以500g,5min 离心; 用 10ml 含血清培养基重悬细胞团，储存于冰浴中。11，重复第 10 步的过程直至消化完全为止（大约 3-4h)12, 收集冷的细胞悬液，用血球计数板进行细胞技术，并检测细胞活性13，将细胞悬液用培养基稀释，使每毫升培养基含有 1 x 106 个细胞。接种到培养瓶中，大约每平方厘米为
13、 2 x 105 个细胞。但是对于存活率不明确或难以预知时，细胞计数无价值。此时建议每毫升 5-25mg 组织的浓度接种。14，每隔 2-4 天更换一次培养基（以 PH 下降为标准） 。由于部分细胞粘附较慢甚至易于悬浮生长，所以更换上清液前要先检查上清液中存活的细胞。总结;此方法应该把握时间，减少对细胞的损伤。可以通过如下简单方法来减少细胞的损害：在 4将组织浸入胰酶，胰酶此时活性很小的条件下浸透组织，然后放在 37， 在很短时间即可将组织消化。2.2 胰酶的冷消化无菌材料：培养基（DMEM/F12 ，含 10%胎牛血清） ；DBSS; 0.25%粗制胰酶溶于无血清的 RPMI1640 或 M
14、EM/Stirrer salts(S-MEM)中； 9cm 皮氏平皿，非组织培养级别；直头，弯头镊子；剪刀；25ml 螺口锥形瓶；25cm 2、75cm 2 培养瓶；2ml,10ml 移液器非灭菌材料：冰浴操作步骤：1，将组织移入加有新配制的无菌 DBSS 的皮氏培养皿中，清洗。2，转入另一培养皿中，切除多余组织如脂肪和坏死组织，用手术刀细切成大约 3mm3 的小块，对于胚胎器官若小于 3mm3 可以全部保留3，用弯镊子将组织块移入 15ml 或 50ml 无菌离心管或普通容器中，让组织块沉淀4，用 BSS 重悬冲洗组织块，沉淀后去除上清，重复此步骤 2 次以上5，去除剩余液体，每克组织加入
15、10ml 溶于 RPMI1640的 0.25%胰酶，置于 4。6，在 4放置 6-18h,7,小心去除胰酶，余下组织及残余胰酶（若需要此时可以加入 1-2ml 其他酶）8,37，放置 20-30min9,加入温培养基，大约每 100mg 初始组织加 1ml，轻轻吹打混合物至组织完全分散开。10，若部分组织未分散，细胞悬液可以用无菌的平纹纱布或不锈钢（100-200 微米）或 falcon 70mm 细胞滤器进行过滤细胞。如果有较多的组织时，可在每克组织多加入 20ml 培养基促进沉淀和随后的悬液收集，通常 2-3min 就足以去除大多数的大块组织。11，用血球计数板测量并定量细胞密度12，将细
16、胞悬液用培养基稀释，使每毫升培养基含有 1 x 106 个细胞，接种培养瓶中同上要求。13，隔 2-4 天更换一次培养基（以 ph 下降为标准） 。由于部分细胞粘附较慢甚至易于悬浮生长，所以更换上清液前要先检测上清液中的存活细胞。总结：与温消化相比，冷消化可以获得较高的细胞存活率，24h 生存率。可保留更多的细胞种类。但是不适合大块组织（大于10g),可以用于小鼠胚胎的上皮细胞，胚鼠的肝脏血细胞培养。2.3 细胞传代时，细胞与培养皿的分离（1）传代时应检测细胞活力，活力好的细胞应该密度小，活力差的细胞应该密度高些。（2）吸出过多的细胞培养基，用不含有钙离子和镁离子的平衡盐溶液或 EDTA 溶液
17、冲洗细胞。从培养瓶中与细胞生长面相对的一侧加入冲洗液，摇晃培养瓶 1-2 分钟，冲洗细胞层倒掉冲洗液（3）按照 2-3ml/25cm2 的用量，从培养瓶中与细胞生长面相对的一侧加入所选的解离液，确保解离液可覆盖细胞层，将培养瓶置入 37条件下培养，轻轻摇晃培养瓶，通常细胞会在 5-15 分钟内解离。不同细胞系解离所需的时间可能有所差异。对于难以从基质上分离的细胞系，可通过拍打培养瓶的方式加速细胞分离。（4）细胞完全分离后，将培养瓶呈直立位放置，使细胞流至培养瓶底部，向培养瓶中加入完全培养基，反复吹打单层细胞表面，使细胞分散。计数细胞并传代。要求：对于大多数细胞系或强贴壁性细胞系，用不含钙离子和
18、镁离子的 PBS 进行冲洗，解离液用 0.25%的胰蛋白酶或胰酶+EDTA，以不含有钙镁离子的平衡盐溶液进行配制.2.4 原代组织中的细胞解离（1）首先无菌采集组织，切除不需要的组织，用无菌手术刀或者剪刀将余下的组织切成 2-4mm 大小的碎块。用不含有钙镁离子的平衡盐溶液重新悬浮组织碎块，进行清洗。待组织块沉淀后，吸出上清液。反复冲洗 2 至 3 次。（2）将装有组织块的容器置于冰上，吸出所有的上清液，加入含有 0.25%胰酶，不含钙离子和镁离子的平衡盐溶液（ 100mg 组织加入大约 1ml 胰蛋白酶溶液。（3）在 4下孵育至 6-18 小时，以便通过最小的胰蛋白酶活性获得最大的穿透效果。
19、（4）小心倒掉过量的胰蛋白酶溶液，将组织块与残留的胰蛋白酶溶液在 37条件下共同孵育 20-30 分钟。（5）向组织块中加入加热的完全培养基，轻轻吹打，使组织分散。如果使用无血清培养基，则还需要加入大豆胰蛋白酶抑制剂。（6）用灭菌的纱布或者无菌不锈钢纱网（100-200m）过滤细胞悬液，使残余的组织完全分散，计数并接种细胞。3 细胞传代培养传代当细胞密度（每平方厘米基质的细胞数）达到铺满整个瓶底的有效基质时，或者当细胞浓度（每毫升培养基的细胞数）超出培养基的能力时，细胞生长停止或生长速度大大放缓。这时就需要更频繁地更换培养基或者进行分瓶培养。传代标准：用于判定单层细胞是否需要传代（1）细胞密度
20、：正常细胞长至彼此汇合时需要传代。转化细胞同样如此（2）培养基耗尽：一般 ph 降低伴随着细胞密度的增加，这是需要传代的主要指标。（3）距上次传代的时间：常规穿戴最好依照严格的时间进行。若到了该传代的时间细胞还没有达到足够高的密度（即细胞没有彼此汇合） ，则应增加接种密度；相反，如果细胞很快彼此汇合，则要降低接种密度。从而使在一定的接种密度下细胞的周期性生长将与培养时间和细胞产量相一致。理性的细胞浓度是使细胞每 3-4 天更换培养基，每 7 天传代。传代所需无菌材料：完全生长培养基；以 PBS 配制的终浓度为 0.25%胰酶；培养瓶。非灭菌材料：血细胞计数板或电子细胞计数仪传代前准备：1.预热
21、培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS 液和胰蛋白酶的瓶子放入 37水浴锅内预热。2.用 75酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。将试剂及材料置于超净台上，.正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。3.点燃酒精灯：注意火焰不能太小。4.准备好将要使用的消毒后的空培养瓶，放入微波炉内高火，8 分钟再次消毒。5.取出预热好的培养用液：取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。6.需要传代按以下操作从培养箱内取出细胞：注意取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，仔细检查培养物有无污染或衰退迹象，根据传代标准对该培养物进行观察并决定是
22、否需要传代，7.打开瓶口：将各瓶口一一打开，同时要在酒精灯上烧口消毒，弃去旧培养基，为了避免冲散细胞，沿培养瓶细胞对侧加入PBS（0.2ml/cm 2） ，清洗细胞，去除清洗液，以去除残留血清。加胰酶（0.1ml/cm 2）到培养瓶细胞面对侧，翻转培养瓶平放以确保胰酶完全覆盖细胞层，静置 15-30s,弃去大部分胰酶，只保留少量胰酶，主要不要使单层细胞脱落。使用 4的胰酶可以防止细胞的成片脱落。8，平直培养瓶孵育，直至细胞变圆隆起，竖直培养瓶，单层细胞就会从培养瓶表面滑落（通常发生在 5-15min 之后） ，注意不要消化过长时间，另一方面也不要在细胞消化好前强制将细胞吹打下来，这样将导致细胞
23、的成片脱落。9，加入培养液（ 0.1-0.2ml/cm2） ，用吸管反复吹打单层培养细胞面以分散细胞，最后将吸管的尖端放于培养瓶底角，上下吹打细胞几次，注意不要产生气泡。充分上下吹打以分散细胞使之处于单细胞悬浮状态。吹打的强度对于各个细胞系有所不同，有的细胞系很容易吹散，而有的则需要大力吹打才能分散。但若吹打力量过大，几 乎所有的细胞都会受到剪切力的机械损伤。原代或早期几代培养的细胞由于他们较脆弱和体积较大而尤其容易受到损伤，对于连续细胞系具有较大弹性，需要大力吹打才能完全解离。10，制备单细胞悬液有助于计算细胞增值率或贴瓶率或进行细胞克隆分离。11，用血细胞计数板进行细胞计数12，稀释悬液到
24、合适的接种浓度。方法一：加入适量细胞悬液到含有已知体积培养基的培养瓶中，此方法适合常规传代，传代瓶数不多且不需要准确的细胞计数和细胞增殖能力的检测。方法二，稀释细胞至所需的总体积，然后分装到各个培养瓶中。此方法适用于同时做多个相同的培养，因为操作的次数减少，而且每一培养瓶中细胞密度完全一致。13， 用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，放入 CO2 培养箱中继续培养。传代细胞 2 小时后开始贴附在瓶壁上。当生长细胞铺展面积占培养瓶底面积 25时为一个，占 50为，占 75时为。盖上培养瓶盖，将培养瓶放回孵育箱中，大约 1 小时后检查 ph 的变化，如果培养基在空气相中 ph 升高，则要将培养瓶移
25、至无菌区域内，向其中快速（1-2s)吹入 5%CO2，如果在5%CO2 培养条件下 ph 还是很高，则可以增加 CO2 浓度到 7%尝试。但是此方法不可常用，如果问题长存在可以在配置培养基时降低其ph，同时在培养箱中检查培养基的 ph.注意事项：1，在任何情况下，主要的细胞分离剂，不论是胰酶还是EDTA，仅做短暂停留，弃去大部分消化液后，仅留少量消化液进行孵育。如果在分离细胞及以后的制备单细胞悬液过程中遇到困难，可采用替代步骤如下。（1）对于有丝分裂期细胞及其他粘附较松的细胞，可以通过轻微机械振荡，摇晃，或大力吹打，进行细胞解离（2）对于不可用蛋白酶的细胞系如受体或细胞表面蛋白分析，以及可造成
26、一些细胞伤害，很难形成单细胞悬液的条件下，利用细胞刮刀进行刮擦。（3）多数的连续细胞系，在用 0.01-0.5%粗胰酶，并经完全去除培养基预处理条件下，可以只用胰酶即可将细胞分离。（4）某些粘附性强的连续细胞系和很多早期细胞，用0.25%粗胰酶，及 PBSA 作为培养基预处理后，可以通过清洗+胰酶方法将细胞解离。2，当把塑料培养瓶放入到培养箱中会因为培养瓶内空气的膨胀使得较大的培养瓶膨胀而不能放平。可以将培养瓶放入培养箱中 30min 后快速拧松瓶盖以减轻压力，或者可以在盖紧培养瓶前通过挤压培养瓶的顶部或底部来解决这问题。传代时的细胞浓度最好的确定方法是以不同的接种浓度接种后作生长曲线，依此选
27、择出延迟期短，能很快进入对数生长期（倍增时间短） ，并且下次传代时可以方便地到达 对数生长期最高点的最小接种浓度。对于新的培养物，可以先以高浓度接种，再逐渐降低接种浓度直至获得合适的生长周期而培养物又无衰退表现。1吸掉或倒掉培养瓶内旧培养液。2向瓶内加入胰蛋白酶液和 EDTA 混合液少量。以能覆盖培养 瓶底为宜。3置 37孵箱或室温（25温度）下进行消化,25min 后把培养瓶放在倒置显微镜下进行观察,当发现胞质回缩、细胞间隙增大后，应立即中止消化。4吸出消化液，向瓶内加入 Hanks 液少量，轻轻转动培养瓶，把残留消化液冲掉，然后再加培养液。如果仅使用胰蛋白酶消化,在吸除胰蛋白液后,可直接加
28、入少量含血清的培养液,终止消化。5使用弯头吸管，吸取瓶内培养液，按顺序反复轻轻吹打瓶壁细胞，使之从瓶壁脱离形成细胞悬液。吹打时动作要轻柔，以防用力过猛损伤细胞。6用计数板计数后，分别接种于新的培养瓶中，置 CO2 培养箱中进行培养。7细胞培养换液时间应根据细胞生长的状态和实验要求来确定。一般 23 天后应换一次生长液。待细胞铺满瓶皿底面，即可使用。也可继续传代扩大培养或换成维持液。注意事项：1. 掌握好细胞消化的时间，消化时间过短时，细胞不宜从瓶壁脱落，过长的消化会导致细胞脱落、损伤。2. 掌握好消化浓度，当消化液浓度过高时，消化时间应缩短，过低时细胞消化时间相对延长。4 细胞的冻存及复苏细胞
29、低温冻存是培养室常规工作和通用技术。细胞再次长到覆盖率 80-90%左右，将其消化后，常规冻存（冻存液要现配） 。细胞冻存在-196液氮中，储存时间几乎是无限的，若细胞冻存在-152，保存期为一年，一年内需复苏重新冻存，冻存复苏的原则是慢冻快融。1冻存细胞 （1）选对数增生期细胞(证明无支原体污染)，在冻存前 1d 换液。（2）按常规方法把培养细胞制备成悬液，计数，使细胞密度达 5106m1 左右密度，离心，去上清。（3）加入配制好的冻存液（培养液 6.8ml，小牛血清 2ml，DMSO 1ml，5.6%NaHCO 3 0.1ml） ，按与去上清相同的量一滴一滴加入离心管中,然后用吸管轻轻吹打
30、令细胞重悬。冻存细胞时培养液中加入保护剂 10二甲基亚砜(DMSO) 或甘油，可使冰点降低，使细胞内水分在冻结前透出细胞外。（4）分装于无菌冻存管中，每管加 1.5m1 悬液。（5）旋好冻存管并仔细检查，一定要盖紧，作好标记。（6）冻存：在特殊的仪器或简易的液氮容器中，按-1min 的速度,在3040 min 时间内,下降到液氮表面，再停 30 min 后，直接投入液氮中。要适当掌握下降冷冻速度，过快能影响细胞内水分透出，太慢则促进冰晶形成。或将细胞冻存于-152冰箱。操作时应戴防护眼镜和手套，以免冻伤。2. 复苏细胞细胞复苏的原则快速融化：必须将冻存在-196液氮中的细胞快速融化至37，使细
31、胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。(1) 实验前准备：1.将水浴锅预热至372.用75酒精擦拭紫外线照射30min 的超净工作台台面。3.在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。(2) 取出冻存管：1.根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号的冻存管。2.从液氮罐中取出细胞盒，取出所需的细胞，同时核对管外的编号。(3)迅速解冻：1.迅速将冻存管投入到已经预热的36-37水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化，3060s 内完成。2.约1-2min 后冻存管内液体完全溶解，取出用70%酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿
32、入超净台内,打开盖子,用吸管将细胞悬液注入离心管中,再滴加10 m1培养液。(4)平衡离心：用架盘天平平衡后，放入离心机中3000r/min 离心3min 或者低速离心(500 1000r min) 5 min，去上清后再用培养液洗一次。(5)制备细胞悬液：1.吸弃上清液。2.向离心管内加入10ml 培养液，吹打制成细胞悬液。(6)细胞计数：细胞浓度以 5105/ml 为宜。(7)培养细胞将复合细胞计数要求的细胞悬液分装入培养瓶内，将培养瓶放入37和 5CO2 的培养箱内 2-4 小时(或者 24-48 小时) 后换液继续培养培养，换液的时间由细胞情况而定。初学者易犯错误：1 水浴锅未预热或者
33、未预热到 37。2.水浴锅内冻存管太多，导致传热不佳，使融化时间延长。3.离心前忘记平衡，导致离心机损坏和细胞丢失。4.一次复苏细胞过多，忘记更换吸头和吸管，导致细胞交叉污染。5，冻存细胞数量要充分，密度应达到 107m1，在融后稀释 20 倍后，仍能保持 5105 个 m1 数量。5 ， 细胞计数实验原理：当待测细胞悬液中细胞均匀分布时，通过测定一定体积悬液中的细胞的数目，即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。具体操作：(1)准备工作：取一瓶传代的细胞，按照传代细胞培养(消化法) 中的传代方法繁殖细胞，待长成单层后以被使用。(2)细胞悬液制备：细胞悬液的制备方法是用 0.25的胰蛋白酶液
34、消化、PBS 液洗涤后，加入培养液(或 Hanks 液或 PBS 等平衡盐溶液) ，吹打制成待测细胞悬液。(3)细胞计数：1.盖好盖玻片：取一套血球计数板，将特制的盖玻片盖在血球计数槽上。2.制备计数用的细胞悬液：用吸管吸 5 滴细胞悬液到一离心管中，加入 5 滴台盼蓝染液(0.4)或苯胺黑，活细胞不会被染色，加入染液后就可以在显微镜下区别活细胞和死细胞。3.将细胞悬液滴入计数板：将待测细胞悬液吹均匀，然后吸取少量悬液沿盖片边缘缓缓滴入，要保证盖片下充满悬液，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。4.统计四个大格的细胞数：将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察，并移动计数板，当看到镜中
35、出现计数方格后，数出四角的四个大铬(每个大格含有 16 个中铬)中没有被染液染上色的细胞数目。5.计算原细胞悬液的细胞数:按照下面公式计算细胞密度：(细胞悬液的细胞数)/ml ( 四个大格子细胞数/4) 2104说明：公式中除以 4 因为计数了 4 个大格的细胞数。公式中乘以 2 因为细胞悬液于染液是 1：1 稀释。公式中乘以 104 因为计数板中每一个大格的体积为：1.0mm(长)1.0mm(宽)0.1mm(高)0.1mm3 而 1ml1000mm3(4)细胞计数要点：1.进行细胞计数时，要求悬液中细胞数目不低于 104 个/ml，如果细胞数目很少要进行离心再悬浮于少量培养液中；2.要求细胞
36、悬液中的细胞分散良好，否则影响计数准确性。3.取样计数前，应充分混匀细胞悬液，尤其时多次取样计数时更要注意每次取样都要混匀，以求计数准确；4. 数细胞的原则是只数完整的细胞，若细胞聚集成团时，只按照一个细胞计算。如果细胞压在格线上时，则只计上线，不计下线，只计右线，不计左线。5. *作时，注意盖片下不能有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中，否则要重新计数。(5)初学者易犯的错误：1. 计数前未将待测悬液吹打均匀。2. 滴入细胞悬液时盖玻片下出现气泡。3. 滴入悬液时的量太多，至使细胞悬液流入旁边的槽中。本实验特殊试剂的配制：4台盼蓝母液：称取 4 克台盼蓝，加入少量蒸馏水研磨，加双蒸水至 100
37、毫升，用滤纸过滤，4保存。使用液：使用时，用 PBS 稀释母液至 0.4即可。6 用滤膜滤器过滤液体除菌1、将滤膜放入去离子双蒸水中浸泡。用镊子取出滤膜，装入小滤器中，扭紧后再松开一圈（不锈钢滤器螺丝不要拧太紧）。高压蒸气灭菌，其后自然干燥。2、使用前先拧紧小滤器，10ml 注射器接上小滤器上口，加入 2ml 待滤液体，推上针芯，并保留数毫升气体。推压针芯，液体滤尽后，继续适当用力推压，针芯有弹性并不能将气体推尽，则表明此滤器滤膜是安装完好的。3、正式过滤待滤液体。滤完后再次推空气，如有阻力，表明过滤过程中滤膜保持完好。打开小滤器，再次检查滤膜是否完好。如果发现滤膜破损，应重新过滤。注：1小滤
38、膜器使用方便，适于少量液体过滤（也可选用一次性滤器）；2有些有机物质（如 DMSO）可溶解滤膜，因而不能使用；3市场上有成品出售，可直接应用，但仍应在过滤前后用推注气体的方法检测滤膜是否完好；一些大分子蛋白质可以粘在滤膜上，损失很大，可以先用少量血清或蛋白质冲洗一下滤膜，可减少这种损失。7，ph 对溶液的关系酚红，在 ph7.4 时，呈红色；ph 7.0，呈橘红丝；ph 6.5 呈黄色；低于 6.5 为柠檬黄；ph7.6,呈桃红色；ph7.8 紫红色。由于颜色的判断具有较高的主观性，因此制作一个标准色阶很必要ph 标准色阶的制备材料：Hanks 平衡盐溶液（HBSS)，10 倍浓缩液或粉剂，不
39、含碳酸盐或葡萄糖，含有 20mmol/l HEPES9 个瓶子（大小与最长使用的培养基或培养瓶相似） ，超纯水，灭菌的 0.1mol/l 氢氧化钠（用超纯水配制，过滤除菌）操作步骤：1，配制 ph6.5 的 BSS，分装至 7 个大小适宜的瓶子中。2，使之与空气达到平衡3，用无菌的 0.1mol/l 氢氧化钠调节 ph 至 6.8,7.0,7.2,7.4,7.6,7.8以 ph 计测定。4，将调节好的 BSS 过滤除菌，然后存放于培养瓶中5，保持无菌和密封。10，培养基的更换需要更换的四个指标：（1）PH，当 ph 从 7.0 降到 6.5 时大多数细胞就停止生长；当ph 在 6.5 和 6.
40、0 之间时细胞开始失去活性。如果培养基从红色变成橙色，再变成黄色，那么就需要更换培养基了。可以通过颜色变化估计 ph 变化率，如果 ph 为 7.0 的培养物每天降低 0.1ph 单位，那么在换液前多放置一两天没什么关系，但若培养物每天降低 0.4ph单位，那么需要在 24-48h 内换液。（2）细胞密度（3）细胞类型：正常细胞如二倍体成纤维细胞在高密度时停止分裂，此时细胞停滞在细胞周期的 G1 期，根据情况换液。（4）形态衰退，通过长期定期观察形成经验来判断。培养细胞时，培养基的体积与表面积比通常为 0.2-0.5ml/cm2，其最适比例是由该细胞的需氧量决定，需氧量高的细胞在较浅的培养基中
41、生长较好（如 2mm） ，需氧量较低的细胞在较深的培养基中生长较好（如 5mm）更换培养基的无菌材料：移液管，培养基操作步骤：（1）准备好超净工作台，以 70%乙醇浸泡的纱布擦拭超净工作台及实验所需的试剂及材料，并将擦拭过的试剂及材料立即放到超净工作台。（2）仔细观察培养物是否有污染或衰退迹象。（3）考察上述判别是否需要更换培养基的标准，即 ph 和细胞密度或浓度，如果需要则按下不操作。(4)将培养物放于无菌工作区域（5）吸除旧培养基（6）加入同体积的新鲜培养基。最好将培养基预热至 37 摄氏度。（7）将培养物重新放回培养箱注意：当培养物密度过低或生长缓慢时最好进行半量换液，即在第5 步仅仅吸
42、出一半旧培养基，在第 6 步补入相同体积的新鲜培养基。即使是高密度的细胞群体，更换培养基也会刺激细胞进行有丝分裂，因此当不需要有丝分裂时可使用维持培养基。维持培养基是血清浓度降至 0.5%-2%或完全不加血清的常规培养基。12， GIEMSA 染色GIMSA 是一种多色的血涂片染料，进行血图片染色时，常与 May-Grunwald 染液结合使用，但不用于细胞的染色。染色后核呈粉红或紫罗兰色，核仁呈蓝黑色，细胞质呈浅灰蓝色。所染细胞必须乙醇或甲醇固定，制备过程中必须彻底脱水，否则不能正常染色。非灭菌材料：PBSA; PBSA：甲醇（1:1） ；未稀释的 GIEMSA 染液；甲醇；去离子水操作步骤
43、：1，吸去培养基2，用 PBSA 冲洗单层细胞，去掉冲洗液3，加入 PBSA/甲醇液 0.2ml/cm2，静置 2min,然后去掉 PBSA/甲醇液4，加新甲醇 5ml,静置 10min.5, 弃掉甲醇液，用无水甲醇，冲洗单层细胞，去掉甲醇。6，此时，培养瓶经干燥可储存，也可直接进行染色。即使是干的培养瓶，用新配的无水甲醇冲洗后直接染色时非常重要的。如果甲醇倒出，培养瓶静置了一段时间后，残留的甲醇会吸收水分，从而妨碍下一步的染色。7，加入纯度 GIEMSA 染液，0, 。08ml/cm 2,确保覆盖整层细胞。8,2min 后，用 8ml 水稀释染液，并轻轻晃动 2min.9,用水置换染液，游走
44、浮渣，用自来水冲洗细胞，直到去除片状粉色本底（沉积） ，10，将水倒掉，用去离子水冲洗，在单层细胞仍处于湿润状态时，用显微镜观察细胞，干燥，保存染色，观察时应重新使它湿润。13，结晶紫染色非灭菌材料：PBSA;PBSA/甲醇（1:1） ； 甲醇；结晶紫；过滤漏斗和滤纸，大小适合于每个培养皿中盛载 5ml 的染液；回收染液的瓶子。操作步骤：1，吸去培养基2，用 PBSA 冲洗单层细胞，弃掉冲洗液3，每 25cm2 加入 PBSA/甲醇 5ml,静置 2min,弃掉 PBSA/甲醇4，加入新甲醇 5ml, 静置 10min5,弃掉甲醇，将培养皿中的液体倒干净，使其干燥6，每 25cm2 加入 5m
45、l 结晶紫，静置 10min.7,过滤漏斗放置在瓶上8，将染液倒入漏斗9，用自来水冲洗培养皿，然后用去离子水冲洗，干燥培养皿。14，涂片制备无菌材料：用 50%-100%血清悬浮的浓缩细胞悬液；血清非无菌材料：显微镜载玻片；甲醇；电扇操作步骤：1，在载玻片一端滴一滴血清，用第二张载玻片末端蘸取这滴血清，并在第一张载玻片上移动，在玻片表面形成一薄层血清。2，用电扇使血清干燥3，用 50%-100%血清悬浮细胞，细胞浓度为 106/ml,取一滴血清滴在载玻片一端，用第二张载玻片末端蘸取这滴细胞悬液，在第一张载玻片上移动，形成一薄层细胞的分布4，迅速干燥载玻片，甲醇固定。15,染色体制备固定阻滞在
46、M 期的细胞，在低渗培养基中会发生膨胀，将细胞滴在载玻片上，染色，观察无菌材料： 对数期的培养细胞；用 PBSA 配制的 10-5mol/l 秋水仙胺；PBSA;0.25%的粗提胰蛋白酶非灭菌材料：低渗溶液：0.04mol/l KCL; 0.025mol/l 枸橼酸钠；醋酸甲醇固定液；一份冰醋酸加三份无水甲醇或乙醇，新鲜配制并在冰上保存；Giemsa 染液；DPx 或 permount 封固剂；冰；离心管；巴斯德吸管；载玻片；盖玻片#00；载玻片盒；低速离心机；涡流混悬器。操作步骤:1,将细胞浓度为 2 x 104 至 5 x 104/ml 的培养液 20ml 放入75cm2的培养瓶（每平方厘
47、米 4 x 103至 1 x104个细胞）中培养。2，约 3-5 天后，细胞处于对数生长期，以 1：100（v:v)加入 1 x10-5mol/l 秋水仙胺（终浓度 1 x 10-7）于培养瓶内已有的培养基中。3,4-6h 后，轻轻去掉培养基，加 5ml 0.25% 胰蛋白酶，孵育10min.4,胰蛋白酶西邻悬浮细胞，弃掉上清液中胰蛋白酶。5，以 5ml 低渗溶液重新混悬细胞，37，静置 20min.6,加入等量新鲜配制的冰冷的醋酸甲醇，不停地混合，然后以100g 速度离心 2min7,弃掉上清混合物，在涡流混悬器上振荡细胞团块，再慢慢边混匀边加新制备的醋酸甲醇。8，细胞在冰上静置 10min
48、.以 100g 速度离心细胞 2min.9,弃掉上清中的醋酸甲醇，在 0.2ml 的醋酸甲醇溶液中重新振荡以混悬细胞团（例如，将试管底部置于振荡器上） ，直到细胞均匀分散。10，用吸管吸一滴细胞悬液到吸管尖部，从 30cm 处滴到凉的玻片上，倾斜玻片，让流滴流下并铺开。11，将玻片在烧杯的沸水上迅速干燥，然后用相差显微镜观察。如果细胞均匀铺展而没有相互接触，则以同样浓度的细胞制备更多片子。如果细胞成堆重叠出现，则稀释悬液 2-4 倍之后，再准备一张滴液玻片。12，进行 Giemsa 细胞染色：将玻片浸入纯净的染液中 2min; 将染色缸放在水池中，加入大约 10 倍体积的水，让过多的染液从玻片
49、染色缸的顶端溢出；玻片静置 2min;用自来水置换出其余染液，然后用自来水逐张冲洗玻片去除染液沉淀（使玻片上呈现粉红色，不透明的外观） ；显微镜下观察染色情况，对于满意的则将载玻片彻底干燥，用#00 盖玻片及 DPX 或 Permount 封片。16，清洁培养箱非灭菌材料水中含有 2%新吉尔灭或类似的真菌抑制剂，将上述水溶液注入水盘中；替代的 CO2 温箱或塑料盒和封口的胶带；去污剂（10%新吉尔灭或另一种灭菌去污剂，70%乙醇）操作步骤：1，将全部培养物移至另一个二氧化碳温箱；或包装培养物，并通 CO2，然后将其放置在普通培养基或温室中。2，将准备清洁的温箱断开电源3，将温箱中所有的隔板及水盘和可拆卸的部件取出4，用含有去污剂的溶液清洗温箱内部，尽可能擦抹每个角落及缝隙处5，用清水冲洗6，用 70%乙醇擦洗温箱内部7，在保持门打开的状态下，加热（不是加 CO2）直至温箱干燥。8，用去污剂擦洗隔板及各部件，然后用清水冲洗，用 70%乙醇擦洗9，将隔板及各种部件放回温箱中10，放回水盘，注入含有 2%新吉尔灭的水11，关门和接通 CO2 气体12，当温度和 CO2 已趋于稳定，将
