1、1漳 州 师 范 学 院研究生课程考试答题本考生姓名 黄富英 考生学号 2010062023 系 别 化学与环境科学系 专 业 分析化学 考试科目 电分析化学 考试日期 2011 年 6 月 10 日 2蛋白质的电化学分析研究进展摘要：本文综述了蛋白质的电化学分析的进展及应用。从蛋白质的极谱行为、在固体电极上的电化学行为、催化氢波、与小分子物质的配合作用等多角度介绍了近期的研究热点，分析了蛋白质化学研究的意义与现状，并对今后的发展方向作了展望。关键词：蛋白质；电化学；极谱法；修饰电极；电分析电化学分析法(electrochemical analysis)是应用电化学原理和技术，利用化学电池内被
2、分析溶液的组成及含量与其电化学性质的关系而建立起来的一类分析方法。其特点是灵敏度高，选择性好，设备简单，操作方便，应用范围广。许多电化学分析法既可定性，又可定量；既能分析有机物，又能分析无机物，并且许多方法便于自动化，可用于连续、自动及遥控测定，在生产、科研和医药卫生等各个领域有着广泛的应用。在蛋白质结构和功能研究中，通常需要知道蛋白质溶液的准确浓度。同时，蛋白质含量的测定在药物、食品及临床分析中也具有重要意义目前，研究测定蛋白质的方法有凯氏定氮法、光化学分析法、免疫法、液相色谱法、电化学分析法等。其中分光光度法、荧光法、光散射技术等光学分析法测定蛋白质含量的方法是蛋白质测定研究最活跃的领域之
3、一 1 ，2 ，而以电化学分析法对蛋白质进行研究相对较少 3 。蛋白质的电化学行为研究是生物电化学的重要分支，常见的电分析方法有直接电化学分析和间接电化学分析法，又具体分为蛋白质的极谱分析、催化氢波、小分子电化学探针等方面。结合作者工作，本文就蛋白质的电化学分析的研究进行总结。1. 蛋白质自身的直接电化学分析蛋白质自身的氧化还原行为是指溶液中或吸附在电极表面的蛋白质直接或间接的与电极发生电子交换，这种电子转移在某种程度上类似于生命体内蛋白质与生物膜之间的电子转移过程，因此有关蛋白质的氧化还原等电化学机理的研究可用于解释和利用这些生物氧化还原系统。1.1 蛋白质的极谱分析蛋白质自身的极谱波主要产
4、生于分子内的双硫键或硫基。一般来说蛋白质可以产生3个双硫键的可逆还原波，其中2个双硫键与汞电极生成汞硫醇盐、亚3汞硫醇盐的表面还原波，峰电位分别约为-0.25V 和- 0.50V 。另一个为受扩散控制的双硫键还原波，峰电位为- 0.90V。Cecil 等人 4 对胰岛素等多种含双硫键的蛋白质的极谱还原波进行了研究，结果表明每种蛋白质的极谱行为会因pH 不同而各异。但在pH1.0 时，所有含双硫键的蛋白质在 - 0.25V 左右只产生一个还原波，此还原波电流随蛋白质的浓度增加而达到一极限值，极限电流与分子中双硫键数目有关。胱胺酸、牛血清白蛋白(BSA) 、免疫球蛋白IgA及IgG 、a-胰凝乳蛋
5、白酶和胰蛋白酶等蛋白质分子中双硫键的电极还原机理也被详细研究。胡绪英等人 5 通过调节人或牛血清白蛋白在pH10.0 ，并在4左右旋转30h ，诱导出重复性良好的极谱峰来进行蛋白质的极谱测定，对影响测定的因素进行了详细的研究，当蛋白质浓度低于1.010 - 5mol/ L时，峰电流与浓度呈直线关系。张正奇等人 6 发现在pH2.66 的B-R 缓冲溶液中，当有0. 07mol/ L KCl 存在时，BSA 在-1.90V 左右产生一良好的极谱波，利用此波测定微量 BSA 的线性范围为4.510 - 8mol/ L2.0 10 - 6mol/ L ，检测下限为2.7 10 - 8mol/ L 。
6、李汉杰等人 7 发现人白蛋白在pH3.0 的0.1mol/ L 柠檬酸钾-310 - 6mol/L Ti4 + 聚乙烯醇底液中产生一个灵敏的极谱络合不可逆波，人白蛋白在6.610 - 7mol/ L1.3 10 - 6mol/ L 范围内与波高呈线性关系，用于血样中人白蛋白的测定，结果满意，相对偏差小于1.6 % ，检测限为4.910 - 7mol/ L 。1.2 蛋白质在固体电极上的电化学行为由于蛋白质的空间结构庞大，电活性中心深埋于多肽键的内部难以直接与电极表面交换电子，且蛋白质易在电极表面强烈吸附造成电极钝化和蛋白质的变性，因此难以得到有效的电极响应，对蛋白质在裸电极上的电化学行为研究造
7、成一定的阻力。人们在不断采用各种手段来进行研究，研究对象多集中于血红蛋白、辣根过氧化物酶、细胞色素C、肌红蛋白等氧化还原蛋白质。最早的方法是采用合适的媒介剂和促进剂来加速电极上的电子交换速率。初步认为促进剂和媒介剂能与蛋白质相互作用形成复合物使多肽链被伸展，疏水结构被打开而使电活性中心被暴露在电极表面。常用的促进剂有金属络阳离子、双官能团试剂、表面活性剂等。林琳等人 8 发现血红蛋白在pH = 5.0 的0.3mol/ L NaAc - HAc 缓冲溶液中，于+ 0.4- 0.1V 范围内循环扫描，会产生一对氧化还原峰，在四甲基氯化铵促进下裸银电极测定血红蛋白时，峰电位之差为0114V ，氧化
8、4还原峰电流与血红蛋白浓度在2.010 - 7mol/ L1.510 - 6mol/ L 范围内有良好的线性关系。何亚楠等人 9 利用十二烷基硫酸钠做为促进剂在裸银电极上测定血红蛋白，可以得到良好的电流响应。血红蛋白氧化峰电流与其浓度成正比，浓度范围5.010 - 7mol/ L5. 010 - 8mol/ L ，可直接用于血红蛋白的分析测定。修饰电极也被用于研究蛋白质的电化学行为。在电极表面按照人们的意图设计固定上一些具有特定功能的官能团，可以达到对待测物质的分子识别。已用的修饰电极有自组装单层膜修饰电极、生物膜模拟修饰电极、堆积双层膜修饰电极、无机材料双层膜修饰电极、LB膜修饰电极等。这些
9、修饰电极的构造目的都是使蛋白质的构象和空间取向等利于使电活性中心更加接近于电极表面，从而实现二者之间的直接电子转移 10 - 12 。2. 蛋白质的催化氢波H+ (H3O+ ) 在汞电极上有很大的超电压，当某些有机物或金属络合物存在时能降低H +的超电位而产生催化氢波。蛋白质的催化氢波一般可分为两大类: 第一类是蛋白质自身的“钠前催化氢波”，是指结合有质子的蛋白质在汞电极表面会降低氢的超电位，催化H + 提前放电发生氢波，这类催化电流在非常稀的蛋白质溶液中都很容易检测到 13 ；另一类是金属离子存在时蛋白质的催化氢波，如Co () -氨体系的催化氢双波和Rh (III)存在下的催化氢波 14
10、，15 等，催化氢波电流与蛋白质浓度在一定范围内呈线性关系，可用于蛋白质的检测分析。宋俊峰等人 16 - 19 报道了一种蛋白质硫键的有机平行催化波。在氧化剂如KIO 3 、K 2S2O8 和 H2O2等存在下人血清白蛋白(HSA)、溶菌酶等蛋白质的催化氢波能被进一步催化产生新的动力波，该动力波是一种氢的平行催化波，它是由氢离子电化学还原和上述氧化剂氧化中间产物原子氢使其化学再生而产生的。如在pH8.58 的0.4mol/L NH 3 - NH4Cl 0.01mol/ L K2S2O8的体系中观察到HSA 的催化氢波，K 2S2O8进一步催化，产生新的动力波，峰电位为 -1.85V(vs. A
11、g/ AgCl) ，该催化波具有较高的灵敏度，二阶导数峰电流与浓度在2.610 - 7mol/ L9.6 10 - 8mol/ L 范围内呈线性关系，可用于血清样和尿样中HSA的测定。3. 蛋白质与小分子相互作用的电化学研究蛋白质与有机小分子结合方式是多种多样的。现在普遍认为:在蛋白质的碱性氨基酸的残基中，精氨酸和赖氨酸残基上的NH 4+与染料离子上的SO -3 靠静电5引力相结合；在蛋白质的疏水氨基酸中，色氨酸残基与疏水阴离子靠疏水作用相结合。在许多情况下，蛋白质与有机小分子反应不仅是某一种力的单独作用，而是多种力协同作用的结果。这些力包括静电引力、疏水作用力、范德华力等。其中静电力起着重要
12、作用。焦奎等人 20-25 开展了蛋白质的电化学探针的研究工作，选择多种具有电活性的物质作为探针，考察其与蛋白质相互作用的模式，并建立了检测蛋白质的电化学新方法。如以有电活性的有机染料茜素红S 作为蛋白质的电化学探针 20 ，进行蛋白质的定量测定，茜素红S在pH4.2 的062mol/ LBritton - Robinson 缓冲溶液中，于- 0.29V(vs. SCE)处有一良好二阶导数极谱峰，加入人血清白蛋白后峰高下降，通过检测茜素红S 反应前后电流的变化测定HSA ，其下降值与蛋白质浓度呈良好的线性关系，检测范围为2.0mol/ L6.0mg/ L ，检测限为1.0mg/ L ，用于人血
13、清样品检测，结果与考马斯亮蓝法一致。以铍试剂III 21 为电化学探针，检测人血清白蛋白的线性范围为10.mol/ L 40.0mg/L ，可用于人血清白蛋白、牛血清白蛋白的测定。另外，对溴甲酚绿、溴甲酚紫、溴百里香酚蓝等电化学探针与蛋白质作用的电化学行为也进行了详细的研究，建立了电活性探针与蛋白质相互结合的模型，探讨了相互作用的机理。韩英强等人 26 报道了蛋白质- 荧光素复合物单扫极谱波的形成条件，复合物使荧光素在- 5. 58V 处的还原峰电流增大，峰电流的增大值与加入的BSA或HSA 的浓度在一定范围内呈线性关系。BSA 在2 g/ mL24g/ mL 范围内呈线性关系，检出限为1g/
14、 mL ；HSA 在2g/ mL22g/ mL 范围内呈线性关系，检出限为0.8g/ mL 。罗登柏等人研究了金属离子与蛋白质相互作用后形成的稳定配合物的极谱行为。如对Zn () - 蛋白质络合物的极谱行为进行研究 27 ，蛋白质在60的NaOH - 盐酸胍溶液中与Zn () 生成稳定的络合物，在pH = 9.4的NaOH - NH4Cl 缓冲溶液中于单扫描示波极谱仪上- 0. 60V 左右产生一灵敏的极谱波。而在-0.6V 左右，其一阶导数波高与蛋白质浓度呈线性关系，相关系数达0.998以上， 检测限为0.1g/mL 。又如铜() - 蛋白质配合物在硫酸溶液中的阳极吸附波 28 ，BSA 、
15、HSA 的浓度在9.010 - 9mol/L6.010 - 7mol/ L 范围内与其波高呈线性关系，检测限均为3.010 - 9mol/ L ；溶菌酶的浓度在4.210 - 8mol/ L1.810 - 6mol/ L 范围内与其波高呈线性关系，检测限为61.410 - 8mol/ L 。蛋白质的电化学分析的发展可以促进生物电化学、生物电分析化学、生物电子学等多学科的交叉发展，促进人们对蛋白质的结构、功能及作用的更深入了解。以后的发展方向可能包括以下几个方面: 蛋白质的仿生电化学； 蛋白质结构与功能的电化学表征； 蛋白质与外源分子作用机理的电化学研究； 利用蛋白质如酶的催化活性高灵敏电化学新
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