1、第七章 RNA加工与编辑,在细胞内，原初转录产物经过一系列变化转变 为成熟的 RNA分子的过程，称为转录后加工（post- transcriptional processing）原核生物mRNA一经转录通常立即进行翻译，除少数例外，一般不进行转录后加工。但tRNA和rRNA要经过系列加工才能成为活性分子。,RNA的加工成熟,一、真核生物 mRNA 的转录后加工,5-末端加帽：m7GpppNmNm 3-末端加尾：poly A（组蛋白基因转录产物例外） 剪接 ：外显子和内含子、断裂基因(interrupted gene) 编辑,成熟mRNA前体: 核内不均一RNA(heterogenous nuc
2、lear RNA, hnRNA)经转录后加工而来。,A B C D E F G,L 1 2 3 4 5 6 7,7.7 kb,47 185 51 129 118 143 156 1043,卵清蛋白基因,真核生物断裂基因及其转录、转录后加工,核内不均一RNA编码蛋白质的结构基因是在核浆中被转录的。核浆RNA要大得多，很不稳定，并且其顺序的复杂性也要大得多。由于它的大小很不一致，故称核内不均一RNA(hnRNA)。 细胞浆内的mRNA平均只有1800-2000个碱基。而哺乳动物的hnRNA平均有8000-10000个碱基，其范围很广泛，从2000-14000碱基均有，所以一般要比mRNA大4-5倍
3、。 mRNA在5端有一个”帽子”(5-Cap)，3端含多聚腺苷酸(polyA)序列。 hnRNA被切除内含子后即成为mRNA，并进入细胞浆内。 原核细胞的mRNA没有加帽或加尾修饰。,1 加帽： mRNA的5端帽子通式为m7GpppNm。 真核生物帽子可分为三种不同的类型:O型为m7GpppN；I型为m7-GpppN1mp，即转录出的mRNA的第一位碱基也被甲基化(C2甲 基化)；II型为m7GpppN1mpN2mp，即mRNA的第一个碱基和第二个碱基均被甲基化。 帽结构中m7Gppp与下一个核苷酸连接是以5与5相联的方式，称为相对核苷酸结构(confronted nucleotide str
4、ucture)。,5pppG,5 pG,ppi,pppG pi,5 GpppG,5 m7GpppG,（S-腺苷甲硫氨酸）CH3,磷酸酶,甲基化酶,mRNA,mRNA,mRNA,mRNA,三磷酸双鸟苷,1 5-末端帽子的生成 （免受核酸酶破坏）转录开始后-结束前，先于剪接加工,注：帽子结构中G未甲基化，翻译效果差，但稳定性不变,mRNA鸟苷酰转移酶,0号帽子、1号帽子、2号帽子,5帽子至少有两种功能:一是对翻译起识别作用。实验表明，含有5端帽子，翻译活性会下降。 一个功能是稳定mRNA的作用。mRNA的帽结构可保护mRNA5端避免外切核酸酶的攻击。,2 3-末端多聚腺苷酸的合成（加尾）,先于剪接
5、加工poly A polymerase 催化，转录后修饰点序列（AATAAA）提供信号一般长度为100200个腺苷酸,poly(A)聚合酶可以用ATP为底物，以加上poly(A)尾链。 多聚（A)尾巴不是由DNA编码的，而是转录后在核内加上去的。受polyA聚合酶催化，该酶能识别，mRNA 的游离3-OH端，并加上约200个A残基。 hnRNA的尾端要被切去一段，然后才加上poly(A)。因为RNA聚合酶在转录时即已通过了相当于加上poly(A)的位点，故hnRNA尾端的多余部分要由内切核酸酶切去，才能加上poly(A)。,AAUAAA GUGUGUG,AATAAA,GTGTGTG,RNA-p
6、ol II,Pause,3processing,AAUAAA - poly A,mRNA,3,A,真核生物的转录终止及加尾修饰,加尾时间：转录后，当mRNA还未离开胞核时就加上去的。 组蛋白mRNA，呼肠弧病毒及一些植物病毒mRNA上没有poly(A)。 加尾信号：AAUAAA序列 加尾功能：还不太清楚，初步认为与hnRNA从核内移出有关和抵抗外切核酸酶从3端降解mRNA。,利用多个加poly（A）位点和不同的剪接方式产生不同的蛋白质。这类基因5末端虽只有一个转录起始位点，但有两个或多个加poly（A）位点，因此可通过不同的剪接方式得到不同的蛋白质。,3 mRNA的剪接1）hnRNA 和 sn
7、RNA,hnRNA 成熟 mRAN 前身（含非编码内含子）snRNP(small nuclear ribonucleoprotein，小分子核糖核蛋白体) 由snRNA和核内蛋白质组成，作为RNA剪接场所。,2）外显子(exon)、内含子(intron)和断裂基因(splite gene),外显子 在断裂基因及其初级转录产物中出现，并表达为成熟RNA的核苷酸序列。内含子 隔断基因线性表达而在剪接过程中被除去的核苷酸序列。断裂基因 由若干内含子和外显子互相隔开，但又连续镶嵌的基因。,分 类 分 布 拼接方式I 类 线粒体、叶绿体及某些低等真 自我拼接（核酶活性）核生物的rRNA基因 II类 线粒
8、体（某些真菌）、叶绿体 自我拼接（本身具催化内基因，转录产物是mRNA 功能）III类 大多 mRNA基因，转录后常形 需snRNA和辅助蛋白成套索结构剪接IV类 tRNA基因及其初级转录产物 酶促拼接（特殊核酸内切酶、RNA连接酶）,真核生物内含子分类及分布,注：广义上说，翻译加工也存在内含子概念，如胰岛素的C肽基因。,3）内含子分类,（1）剪接接口（边界序列） 内含子5-末端的GU和3-末端AG，也即5 GUAG-OH 3 。（2）剪接体（splicesome） 由snRNP与hnRNA结合的复合体。其功能：致内含子形成套索，并使上、下游外显子靠近的。,4）mRNA的剪接机理,（3）基本过
9、程：,5）mRNA 编辑（mRNA editing） 指在转录水平上发生改变 RNA 编码序列，致一种基因产生不止一种蛋白质的加工方式。,二、tRNA的转录后加工,保守序列：TGGCNNAGTGC,GGTTCGANNCC,RNApol III转录的基因及其转录初级产物,A-OH C C,RNase P 及 内切酶,tRNA核苷酸转移酶及 连接酶（ATP、CTP）,注：tRNA 的剪接是酶促反应，切除内含子的核酸内切酶由tRNA 基因内含子编码,tRNA 的拼接和修饰过程,RNase P由RNA和蛋白质两部 分组成，但起催化作用的是RNA， 而不是蛋白质。,（约4.5S),（约4 S),前体,成
10、熟tRNA,3 N N,5,碱基修饰 甲基化,tRNA的修饰过程包括：1、甲基化 在tRNA甲基转移酶催化下，某些嘌呤和核糖2-OH被甲基化，如：A mA，G mG。（约占1%）2、还原反应：U DHU3、核苷分子内转位反应：U 4、脱氨反应：5、3-末端加CCA-OH,A,I,腺苷酸脱氨酶,RNA酶P,E.coli中还有一种RNA酶P，它是一种内切核酸酶，负责切割所有tRNA分子的5端，不论是在其与5前导序列的接头处，还是在顺反子之间的序列处。 RNA酶P是一种不寻常的酶。它由蛋白质和RNA二者组成，分子中RNA有375个碱基长(约130KD);而蛋白质组分要小得多，大约只有20KD。 在E
11、.coli中，基因rnpA编码其蛋白质组成，而rnpB编码RNA部分。这两个基因相隔甚远。 RNA和蛋白质这两个组分对RNA酶P的催化活性似乎都是必须的。,tRNA前体的加工,RNA酶D,RNA酶D，它能从RNA的3端一个一个地切去碱基，以产生tRNA的真正的3端(5端由RNA酶P产生)。 另一个也带有外切核酸酶活性的酶是RNA酶，它能够将tRNA完全分解完。以前认为它亦tRNA加工有关，但目前认为它可能仅和RNA的分解代谢有关。,在细菌中有两种tRNA前体，其区别在于其3端的序列。 型分子有CCA三联体在其3端。 型分子原没有CCA序列。当其他碱基被一个一个从前体分子上除去后，另由称为tRN
12、A核苷酸转移酶的将CCA加到3端上去。 目前认为，真核生物中可能所有的tRNA前体都属于型，在成熟时都需要通过酶的作用，在其3端加上CCA序列。,三、rRNA的转录后加工rRNA基因（ rDNA）为丰富基因族，即染色体一些相似或完全一样的纵列串联基因单位重复，又称高度重复序列DNA，还包括：5S rRNA基因、组蛋白基因和免疫球蛋白基因等。rRNA的转录后加工主要包括： 甲基化 先于切割拼接，主要位置在核糖-2-OH 上，约占2%左右。拼接,rRNA转录后加工 拼接,真核生物rRNA前体的加工,大肠杆菌rRNA前体的加工细菌的rRNAs通过切割其共同前体形成的。 E.coli的七个编码rRNA
13、的操纵子称为rrnA-G.它们在染色体上并不相连锁.每个操纵子均转录为一个RNA前体，然后被切割为成熟的rRNA分子。 rrn操纵子的组成基本相同，均含有顺序为16S-23S-5S的三个rRNA分子。两个主要的rRNA(16S和23S)之外，还有一个5SRNA存在于同一转录本中。,1、原核生物16S rRNA 30S rRNA初级转录产物 23S rRNA5S rRNA2、真核生物18S rRNA 45S rRNA初级转录产物 5.8S rRNA28S rRNA 5S rRNA,大亚基 rRNA,小亚基 rRNA,大亚基 rRNA,小亚基 rRNA,rRNA 加工及其产物,四、核酶（riboz
14、yme） 具有催化功能的RNA核酶（Ribozyme）是80年代初期， 在研究四膜虫 rRNA 剪接中发现的具 有催化功能的RNA分子。它具有高度 专一内切核酸酶的活性。经过科学家 十多年的研究，核酶已被发展成为一 项新型技术并广泛应用动植物抗病， 人类疾病防治等领域的研究，显示出 了广阔的应用前景。,切赫（T. R. Cech）1988年与altman同 时获得诺贝尔化学奖,（一）核酶特性核酶作用的基础 锤头状结构（也可发夹状或斧头状）锤头状核酶结构特点：长度一般为 60 个核苷酸分子包含催化部分和底物部分，并组成锤头结构碱基至少有13个是一致性序列,（二）意义用人工合成的小片段RNA，配合
15、在欲破坏其结构的 RNA或 DNA 分子上，使成为锤头结构，这就是人工设计的核酶。应用于破坏病原体、基因修复、基因调控和基因治疗等,x,x,x,x,x,x,x,x,x,x,x,x,x,x,x,x,x,x,x,x,x,x,x,x,x,人工设计的核酶,注：粗、细线代表天然和人工合成的分子，x 表示一致性序列,x,3 5,5 3,3 5,5 3,五RNA的剪接机制,1 酶母tRNA的剪接酵母细胞核中400个tRNA基因中约有40个是断裂基因。这些基因均只有一个内含子，位于与反密码子的3侧相隔一个核苷酸之处，长度为14至46bp。 不同氨基酸的tRNA基因中的内含子不相同，因此，剪接酶类看来并不能识别
16、任何共同顺序。,剪切过程可分为两个阶段。 第一步是磷酸二酯键的断裂，这不需要ATP。这一步由一种内切核酸酶所催化。 第二步是连接反应，需要ATP的存在，由RNA连接酶所催化。在无ATP时，产生的两个tRNA半分子不能连接起来。这两个半分子具有独特的末端:其5端有OH基，而3有一个2，3-环磷酸基。当加入ATP时，即发生第二步反应:两个tRNA半分子先发生碱基配对，形成成熟tRNA分子的构象，然后由RNA连接酶形成磷酸二酯键而将两个半分子共价连接起来。,2 自身剪接反应近期发现RNA也可有酶活性。这种有酶活性的RNA有人称之为ribozyme。 T.Cech和S.Altman各自独立地发现RNA
17、具有催化作用。从而改变了生物催化剂的传统概念。为此他们共同获得了1989年Nobel化学奖。,1978年Altman从纯化的RNA酶P中分离出一种多肽和一种RNA(M1RNA)。最初的实验结果表明，蛋白质和M1RNA单独都没有酶活性，但二者混合在一起又可恢复活性。其它生物材料的实验结果表明M1RNA是RNA酶P活性所必须的。 1983年Altman证明，在较高浓度的Mg2+存在下，单独的M1RNA就可以催化tRNA前体的成熟，而单独的蛋白质则没有这种能力。这样，RNA即可看作是个酶。 事实上，M1RNA的酶活性并不比RNA酶P的粗制品的活性低。原来认为蛋白质赋予酶的活性，RNA只起某种辅助作用
18、(例如帮助蛋白质与其底物结合)，但现在发现这两种功能已经倒转。 Cech给具有催化活性的RNA定名为ribozyme。,很长时间以来，人们就试图自己设计和生产酶分子，但因蛋白质分子结构上的复杂性，迄今为止，尚无成功的例子。 近年来随着ribozyme的发现，人工酶(新概念下的酶，它的构件分子是核苷酸)的设计又产生了新的希望。 澳大利亚的科学家就设计了九个ribozyme分子，它们都具备内切酶的活性，且切割位点有高度特异性。同时，ribozyme的活性随pH、温度、及阳离子浓度的变化而变化，显示出典型的酶特性。 由于ribozyme的作用位点高度特异，故可以用来切割特定的基因转录产物(RNA)。
19、 有人将这种切割作用叫做抗基因活性。因为切割的结果破坏了RNA，也就是抑制了基因的表达。 这种特性为我们进行基因和病毒的治疗提供了一个可行的途径。,某些线粒体中的内含子也是自身剪接的内含子。 一些常见的真菌，如粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)，酒酵母(Saccharomycescerevisiae)等的线粒体内含子都能进行自身剪接，像四膜虫中进行的磷酸酯转移反应一样 。,四膜虫rRNA前体的自我剪接,3 能够编码蛋白质的内含子某些真菌线粒体中的内含子有很不寻常的结构，这些内含子有编码顺序，这些顺序的翻译对于该顺序所在的内含子的剪接是必须的。 编码细胞色素b的box基因在仅剪去内含
20、子1时，会产生RNA成熟酶的mRNA。当内含子2亦被剪去时，才是细胞色素b的编码顺序的开端。 线粒体中的box基因是编码细胞色素b(cytb)的。box基因中的外显子1有417bp，编码cytb的N端139个密码子。内含子1有765bp，不编码。外显子2非常短，仅有5个密码子。其后是一个很长的内含子2。内含子2的特点是其开头840bp是一个开放读框(ORF)，有280个密码子，其最后一个密码子为终止密码子。当将内含子1剪去后，翻译即从外显子1起始，通读过外显子2而进入内含子2的ORF，产生一个有423个氨基酸残基的蛋白质(其中144个是cytb的N端氨基酸，279个则由内含子2编码，称为RNA
21、成熟酶(maturase)。 RNA成熟酶是特异地用来剪去内含子2的。 这个酶促反应便成为一个非常敏感的负反馈径路。去除内含子2后，外显子1和2即与外显子3相连接，因而破坏了编码成熟酶的顺序。,4 剪接连接点剪接连接点(splicing junctions)是指在切断和重接位点处的两旁的顺序。 在内含子左侧的连接点称为供体(donor)，在内含子右侧的称为受体(acceptor)。在细胞核的结构基因(即编码多肽的基因)中的所有内含子在外显子-内含子连接处均有GTAG的共同顺序。较详细的共同顺序如下，供体位点受体位点：外显子.AGGTAAGT.内含子.Py10CAG.外显子箭头表示切断的键。这些
22、还是较短的共同顺序，存在于几乎所有的真核生物中。,作为亲核基团向Intron 5的磷酸二酯键发起进攻-1,作为亲核基团向Intron 5的磷酸二酯键发起进攻-1,mRNA拼接反应需要有核内小分子RNA参与,从上述共同顺序可见供体和受体位点之间并无互补现象，所以不可能想像这两个位点会通过碱基配对而结合一起，以便于内含子的切除。 正确的剪接并依赖于天然前体RNA分子的完整性。一个外源基因如果存在于病毒顺序中，仍能很好地被剪接。 另外，前体RNA亦能在不同的组织，或甚至不同物种的细胞中被正确地剪接。这都表示剪接作用是很保守的。 一个真正基因中一个外显子可以和另一个基因的外显子连接起来。例如，将SV4
23、0(猴病毒40)的早期转录单位的第一外显子和小鼠珠蛋白的第三外显子相连，这样形成的杂交内含子仍能正确地被剪接。即SV40的内含子的供体位点(1I)可以剪接到小鼠珠蛋白的内含子的受体位点(r2)上。,套索的产生在第一阶段中，内含子左端(供体位点)处被切断，形成两个分离的RNA分子，即左外显子和右内含子-外显子。左外显子此时为-线性分子，但右内含子-外显子则不然:内含子左端(5端)以5-2键与在内含子右端上游约30碱基处的CTGAC序列(共同序列)中的A相连接，于是形成一个“套索”(lariat) 。,在第二阶段，在受体位点处被切断而将此套索状的内含子剪去;同时分离的右外显子即与左外显子相连接。套
24、索然后被“脱支”(debranch) 而形成一线性内含子。在这种剪接机构中，有三个很短的共同顺序，即供体和受体位点处于一个和套索分支处的一个序列。用酵母做的实验证明:分支处的共同顺序如果发生突变或缺失将使剪接不能进行。这个共同顺序常称为TACTAAC盒。它和左侧的供体位点共同顺序互补，但研究证明两者并不发生碱基配对。在高等真核生物中此分支靶顺序的保守性较小。,6 snRNAs的作用真核细胞有细胞核和细胞浆中都含有许多小RNA，它们约有100到300个碱基。它们是由RNA聚合酶或 III所合成的，其中某些像mRNA一样可被加帽。 在细胞核中的小RNA称为snRNA，而在细胞浆中的称为scRNA。
25、 但在天然状态下它们均与蛋白质相结合，故分别称为snRNP和scRNP。 某些snRNPs和剪接作用有密切关系。有些snRNPs分别和供体及受体剪接位点以及分支顺序相互补。 脊椎动物细胞有6种不同的snRNAs，称为U1、U2、U3、U4、U5和U6。最小的是U6，有约100核苷酸长。最大的是U3，也不过215核苷酸长。它们和蛋白质结合成snRNPs。,snRNAs中最受注意的一个是U1，它普遍存在于哺乳动物、鸟类和昆虫细胞中。人U1snRNP中除RNA外还8个蛋白质分子。 人U1snRNA的可能二级结构如图。其5端的11个核苷酸是单链的，并有一段和内含子左侧的供体序列互补。在供体位点处的互补
26、序列通常为4-6bp。 在体外，完整的U1snRNP粒子能和左侧共同顺序结合，但纯化的U1snRNA却不能。 U1snRNA参与剪接的证据是抗U1snRNP的抗体可以在体外抑制剪接作用;而且如果从系统中将U1snRNP除去，剪接即不能进行。事实上，除去U1sn RNA5端的几个核苷酸即可抑制体外剪接作用。,有可能U5snRNA能识别右侧(受体位点)共同顺序;而U2snRNA，则具有与分支位点互补的顺序。抗U2snRNP的抗体可以和U2snRNA及包括分支位点在内的内含子所形成的复合体发生免疫沉淀。U1和U2可能参与剪接反应的起始阶段，因为U1和U2的灭活将阻止左侧连接点的切断和套索的形成。另外两个snRNAsns(U4和U6)可能亦参与剪接作用，但它们的功能尚不详。,RNA的剪接,mRNA前体拼接机制,卵清蛋白基因转录及加工过程,RNA的加工成熟,
