发酵工艺实验讲义.doc

1、发酵工艺实验讲义邓 静 游见明四川理工学院生物工程系二 00 五年九月试验一 酒精发酵一、实验目的酒精发酵是典型的糖的无氧酵解途径。通过实验让学生理解糖的无氧酵解途径并了解厌氧发酵的工艺过程，同时掌握测定发酵醪液酒精含量的方法。二、实验原理在无氧的培养条件下，酵母菌利用糖发酵为酒精和二氧化碳的作用即 为酒精发酵，反 应式为：C6H12O6 2C2H5OH 2CO2通过对发酵醪液酒精含量的测定，可以判断酒精 发酵的进 程。三、实验材料及仪器1.10 升机械搅拌发酵罐；2.酒精蒸馏装置；3.酒精表 012%；4.甘薯粉；5.活性干酵母；6.BF-7658 淀粉 酶；7.糖化酶。四、实验过程1. 糖

2、液制备淀粉液化：以 135 的加水比，用 7080的温水调粉浆 1000 毫升，立即加入 BF-7658淀粉酶（4000u）2.5% ，于 电炉上加热至 9093保温 510 分钟，继续加热煮沸 1 小时，加 热时需补充水分。淀粉糖化：将煮沸的醪液冷却至 6062，加入糖化 酶（50000u）0.3%糖化 30 分钟，糖化完毕入发酵罐灭菌备用。2.酒精发酵活性干酵母活化：按糖液量 0.5%称取活性干酵母，用 140 的 2%蔗糖溶液，3840保温活化 30 分钟。接种发酵：将活化好的酵母接入到发酵罐中， 3538培养发酵 6872 小时。酒精含量测定：观察并记录酒精发酵工艺过程。 发酵醪温度每

3、小 时测 1 次， 2 小时记录 1 次；发酵醪液酒精含量每间隔 12 小时测定 1 次并记录。附酒精含量测定方法。附：酒精度的测定一 原理试样以蒸馏法除去不挥发物质，用比重瓶或酒精 计测定蒸 馏液之比重。根据蒸 馏液的比重查比重酒精度对照表或直接从酒精计读数求得酒精含量（%，v/v 或%，w/w）。二 仪器蒸馏仪器 蒸馏烧瓶容积，500ml。冷凝器，套管 长度不短于 400mm;内管直径 9 mm.比重瓶 主体容积 25ml;温度计分度值为 0.2 摄氏度。恒温水浴 准确度 0.1 摄氏度。三 操作酒精体积百分浓度（%，v/v， ）的测定方法取一清洁的 100ml 容量瓶，用被测试样荡洗 2

4、_3 次。然后注满至近刻度，将容量瓶置于20水浴中 2030min，用 20试样补足至刻度。将 试样移入 500ml 蒸馏瓶，用 50ml 冷水分3 次冲洗容量瓶，洗液一并移入蒸馏烧瓶。将 烧瓶接入蒸馏 装置。用装试样的原容量瓶作为接受器进行蒸馏。为防止酒精 挥发，在气温 较高时蒸馏，应将容量瓶浸入冰水浴中，并使 应接管出口伸入容量瓶的球部。当蒸馏液体积达到容量的 9598%时停止蒸馏。用少许水洗涤应接管的头端，洗液并入容量瓶。塞好容量瓶，摇匀。如在刻度以上瓶颈沾有液滴，小心用少许水洗下。置容量瓶于 20水浴中 30min，并用清洁的毛细滴管或洗瓶加同样温度的水至刻度，再次摇匀。用比重瓶测定蒸

5、馏液 20的比重。由附录查得试样以体积百分比表示得酒精含量。当对分析结果仅要求达到一位小数得准确度的时候，可将蒸馏液用酒精计直接测定。酒精重量百分浓度得测定方法称取 100.00g 试样于 500ml 蒸馏瓶中，加入 50ml 水，按操作 进行蒸馏。蒸 馏液用一已称重的 100ml 容量瓶作为接受器，瓶内预先加入 5ml 水，并将冷凝器 应接管出口插入水中。当蒸馏液达到 96ml 左右 时停止蒸馏，用清洁得毛细滴管或洗瓶加水至蒸馏重量为100.0g，摇匀。用比重瓶测定蒸馏液的比重。由表查试样以重量百分数表示的酒精含量。四 说明蒸馏过程中乙醇蒸汽的逃逸，会 严重影响测定结果的准确性。因此蒸馏前必

6、须仔细检查仪器各连接处是否严密。若蒸 馏中出现漏气，必 须重新测定。蒸馏时，应先小火加热，待溶液沸腾后再慢慢用大火焰。对于易产生泡沫的酒样加少量消泡剂。但是加过消泡剂的试样 蒸馏残液，不能用来作浸出物的测定。葡萄酒和啤酒试样的挥发酸过高时，会使 测定结果引入较 大误差。 应根据总酸测定结果，用 氢氧化钠准确液中和后，再 进行蒸馏。 对于有高含量二氧实验二 毛霉的分离和豆腐乳的制备1 目的 1.1 学习毛霉的分离和纯化方法。 1.2 掌握豆腐乳发酵的工艺过程。 1.3 观察豆腐乳发酵过程中的变化。 2 原理 豆腐乳是我国独特的传统发酵食品，是用豆腐 发酵制成。民间老法生产豆腐乳均为自然发酵，现代

7、酿造厂多采用蛋白酶 活性高的鲁氏毛霉或根霉发 酵。豆腐坯上接种毛霉，经过培养繁殖，分泌蛋白酶、淀粉酶、谷氨酰胺酶等复杂酶系，在长时间后发酵中与淹坯调料中的酶系、酵母、细菌等协同作用，使腐乳坯蛋白质缓慢水解，生成多种氨基酸，加之由微生物代谢产生的各种有机酸，与醇类作用生成 酯，形成 细腻、鲜香等豆腐乳特色。 3 材料 3.1 菌种 毛霉斜面菌种。 3.2 培养基（料） 马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA），无.菌水、豆腐坯、红曲米、面曲、甜酒酿、白酒、黄酒、食盐 3.3 仪器和器具 培养皿、500mL 三角瓶、接种 针、小笼格、 喷枪、小刀、带盖广口玻瓶、显微镜、恒温培养箱。 4 流程 4.1 毛霉

8、的分离 配制培养基毛霉分离观察菌落显微镜检。 4.2 豆腐乳的制备 悬液制备接种孢子培养与晾花装瓶与压坯装坛发酵感官鉴定 5 方法 5.1 毛霉的分离 5.1.1 配制培养基 马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）。经配制、 灭菌后倒平板备用。 5.1.2 毛霉的分离 从长满毛霉菌丝的豆腐坯上取小块于 5mL 无菌水中，振摇，制成 孢子悬液，用接种环取该孢子悬液在 PDA 平板表面作划线分离，于 20培养 1 2d，以 获取单菌落。 5.1.3 初步鉴定 5.1.3.1 菌落观察 呈白色棉絮状，菌丝发达。 5.1.3.2 显微镜检 于载玻片上加 1 滴石碳酸液，用解剖 针从菌落边缘挑取少量菌 丝于载

9、玻片上， 轻轻将菌丝体分开，加盖玻片，于显微镜下观察孢子囊、梗的着生情况。若无假根和匍匐菌丝、或菌丝不发达，孢囊梗直接由菌丝长出，单生或分枝，则可初步确定为毛霉。 5.2 豆腐乳的制备 5.2.1 悬液制备 5.2.1.1 毛霉菌种的扩繁 将毛霉菌种接入斜面培养基，于 25培养 2d；将斜面菌种 转接到种子培养基中，于同 样温度下培养至菌丝和孢子生长旺盛， 备用。 52.1.2 孢子悬液制备 于上述三角瓶中加入无菌水 200mL，用玻璃棒 搅碎菌丝，用无菌双层纱布过滤，滤渣倒还三角瓶，再加 200mL 无菌水洗涤 1 次，合并 滤于第一次滤液中，装入喷枪贮液瓶中供接种使用。5.2.2 接种孢子

10、 用刀将豆腐坯划成 4.1cm4.1cm1.6cm 的块，将 笼格经蒸汽消毒、冷却，用孢子悬液喷洒笼格内壁，然后把划块的豆腐坯均一 竖放在笼格内， 块与块之 间间隔 2cm。再用 喷枪向豆腐块上喷洒孢子悬液，使每块豆腐周身沾上 孢子悬液。 5.2.3 培养与晾花 将放有接种豆腐坯的笼格放入培养箱中，于 20左右下培养，培养 20h 后，每隔 6h 上下层调换一次，以更换新鲜空气，并观察毛霉生长情况。4448h 后，菌丝顶端已长出孢子囊，腐乳坯上毛霉呈棉花絮状，菌丝 下垂，白色菌 丝已包围住豆腐坯，此时将笼格取出，使热量和水分散失，坯迅速冷却，其目的是增加酶的作用，并使霉味散发，此操作在工艺上称

11、为晾花。 5.2.4 装瓶与压坯 将冷至 20以下的坯 块上互相依连的菌丝分开，用手指 轻轻 在每块表面揩涂一遍，使豆腐坯上形成一层皮衣，装入玻璃瓶内，边揩涂边沿瓶壁呈同心圆方式一层一层向内侧放，摆满一层稍用手压平，撒一层食盐，每 100 块豆腐坯用盐约 400g，使平均含盐量约为 16%，如此一层层铺满瓶。下层食盐用量少，向上食盐逐层增多，腌制中盐分渗入毛坯，水分析出，为使上下层含盐均匀，腌坯 34d 时 需加盐水淹没坯面，称之 为压 坯。腌坯周期冬季 13d，夏季 8d。 5.2.5 装坛发酵 5.2.5.1 红方 按每 100 块坯用红曲米 32g、面曲 28g、甜酒 酿 1kg 的比例

12、配制染坯 红曲卤和装瓶红曲卤。先用 200g 甜酒酿浸泡红米和面曲 2d，研磨 细，再加 200g 甜酒 酿调匀即为染坯红曲卤。将腌坯沥干，待坯块稍有收缩后，放在染坯红曲卤内，六面染红，装入经预先消毒的玻瓶中。再将剩余的红曲卤用剩余的 600g 甜酒酿兑稀，灌入瓶内，淹没腐乳，并加适量面盐和 50 度白酒，加盖密封，在常温下贮藏 6 个月成熟。 5.2.5.2 白方 将腌坯沥干，待坯块稍有收缩 后，将按甜酒 酿 0.5kg、黄酒 1kg、白酒 0.75kg、盐 0.25kg 的配方配制的汤料注入瓶中，淹没腐乳，加盖密封，在常温下贮藏 24 个月成熟。 5.2.6 质量鉴定 将成熟的腐乳开瓶，进

13、行感官 质量鉴定、 评价。 6 结果 从腐乳的表面及断面色泽、组织 形态（块形、 质地）、滋味及气味、有无杂质等方面综合评价腐乳质量。 实验三 甜酒酿的制作1 目的 1.1 通过甜酒酿的制作了解酿酒的基本原理。 1.2 掌握甜酒酿的制作技术。 2 原理 以糯米（或大米）经甜酒药发酵制成的甜酒酿，是我国的传统发酵食品。我国 酿酒工业中的小曲酒和黄酒生产中的淋饭酒在某种程度上就是由甜酒酿发展而来的。 甜酒酿是将糯米经过蒸煮糊化，利用酒 药中的根霉和米曲霉等微生物将原料中糊化后的的淀粉糖化，将蛋白质水解成氨基酸，然后酒药中的酵母菌利用糖化 产物生长繁殖，并通过酵解途径将糖转化成酒精，从而 赋予甜酒酿

14、特有的香气、 风 味和丰富的营养。随着发酵时间延长，甜酒酿中的糖分逐渐转 化成酒精，因而糖度下降，酒度提高，故适时结束发酵是保持甜酒酿口味的关键。 3 材料 3.1 材料 糯米、酒药 3.2 仪器和器具 手提高压灭菌锅，不锈钢丝 碗， 滤布，烧杯，不锈钢锅。 4 流程 5 方法 5.1 洗米蒸饭 将糯米淘洗干净，用水浸泡 4h, 捞起放于置有滤布的钢丝 碗中，于高 压锅内蒸熟（约0.1Mpa, 9min），使饭“熟而不糊” 。 5.2 淋水降温 用清洁冷水淋洗蒸熟的糯米饭，使其降温至 35左右，同时使饭粒松散。 5.3 落缸搭窝 将酒药均匀拌入饭内，并在洗干 净的烧杯内洒少许酒药 ，然后将 饭

15、松散放入烧杯内，搭成凹形圆窝，面上洒少许酒药粉。盖上培养皿盖。 5.4 保温发酵 于 30进行 发酵，待发酵 2 天后，当 窝内甜液达饭堆 2/3 高度时，进行搅拌，再发酵 1 天左右即可。 6 结果 6.1 发酵期间每天观察、记录发 酵现象。 6.2 对产品进行感官评定，写出品 尝体会。 实验四 细菌生长曲线的测定1 目的 1.1 了解细菌生长曲线特点及测定原理 1.2 学习用比浊法测定细菌的生长曲线 2 原理 将少量细菌接种到一定体积的、适合的新 鲜培养基中，在适宜的条件下进行培养，定时测定培养液中的菌量，以菌量的对数作纵坐标，生 长时间作横坐 标，绘制的曲线叫生长曲线。它反映了单细胞微生

16、物在一定环境条件下于液体培养时所表现出的群体生长规律。依据其生长速率的不同，一般可把生 长曲线分为延缓期、 对数期、稳定期和衰亡期。这四个时期的长短因菌种的遗传性、接种量和培养条件的不同而有所改 变。因此通 过测定微生物的生长曲线，可了解各菌的生长规律，对于科研和生产都具有重要的指 导意义。 测定微生物的数量有多种不同的方法，可根据要求和实验 室条件选用。本 实验采用比浊法测定，由于细菌悬液的浓度与光密度（ OD 值）成正比，因此可利用分光光度计测定菌悬液的光密度来推知菌液的浓度，并将所 测的 OD 值与其对应的培养时间作图，即可绘出该菌在一定条件下的生长曲线，此法快捷、简便。 3 材料 3.

17、1 菌种 大肠杆菌 3.2 培养基 肉膏蛋白胨培养基 3.3 仪器和器具 721 分光光度计，比色杯，恒温摇床，无菌吸管， 试管，三角瓶。 4 流程 种子液标记接种培养测定 5 方法 5.1 种子液制备 取大肠杆菌斜面菌种 1 支，以无菌操作挑取 1 环菌苔，接入肉膏蛋白胨培养液中，静止培养 18h 作种子培养液。 5.2 标记编号 取盛有 50mL 无菌肉膏蛋白胨培养液的 250mL 三角瓶 11 个，分 别编号为 0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16、20h。 5.3 接种培养 用 2mL 无菌吸管分别准确吸取 2mL 种子液加入已编号的 11 个三角瓶中，于 37下振荡培养

18、。然后分别按对应时间将三角瓶取出，立即放冰箱中 贮 存，待培养结束时一同测定 OD值。 5.4 生长量测定 将未接种的肉膏蛋白胨培养基倾倒入比色杯中， 选用 600nm 波长分光光度计上调节零点，作为空白对照，并对不同时间培养液从 0h 起依次进行测 定，对浓度大的菌悬液用未接种的牛肉膏蛋白胨液体培养基适当稀释后测定，使其 OD 值在 0.10.0.65 以内，经稀释后测得的 OD 值要乘以稀释倍数，才是培养液实际的 OD 值。 6 结果 6.1 将测定的 OD 值填入下表： 时 间(h) 对照 0 1.5 3 4 6 8 10 12 14 16 20 光密度值（OD 600）6.2 以上述表

19、格中的时间为横坐标，OD600 值为纵坐标， 绘制大肠杆菌的生长曲线综合型实验举例实验五 米曲霉的固态培养及孢子数和蛋白酶活力的测定1、实验目的：1.1 学习米曲霉固态制曲的方法1.2 掌握孢子测定的方法1.3 掌握蛋白酶测定方法1.4 了解不同条件对米曲霉产孢子数和蛋白酶活力的影响2、实验原理2.1 米曲霉制曲原理米曲霉能产蛋白酶、淀粉酶、脂酶等多种酶，其广泛用于酱油、酱类产品的制作，形成酱油和酱类物质独特的色、香、味、体。将 纯种的米曲霉接种在麸皮培养基上，保持适宜的条件，米曲霉以麸皮培养基中的糖和氨基酸为养分生长繁殖，并分泌各种 酶。2.2 蛋白酶活力测定原理蛋白质或多肽水解后生成的含苯

20、环氨基酸对 275nm 波长紫外光具有最大的吸收值。利用蛋白酶催化酪蛋白的前后在三 氯醋酸可溶物中紫外线光密度的 变化，可测定酶活力的高低。3、实验材料和仪器3.1 材料： 麸皮、面粉、豆 饼 粉；米曲霉菌种；酒精（95）；稀硫酸（1：10）；2酪蛋白；4三氯醋酸；氯化钠等。3.2 仪器：固态培养箱；显微镜；血球计数仪；751 分光光度计。4、工艺流程麸皮等 蒸料 冷却 接种 装箱培养 翻料 孢子数的测定 蛋白酶活力的测定5 操作方法麸皮和面粉等按一定比例加水混匀后，放入高压灭菌锅内在 121蒸煮 30min 后，冷却到 40后，接入米曲霉菌种，在一定温度下培养，观察和记录米曲霉生长的典型现象

21、，在培养 48h 后测定其孢子数，在培养 72 小时后测定其蛋白酶活力。5.1 孢子数的测定方法5.1.1 样品稀释 精确称取种曲 1g（称准至 0.002g），倒入盛有玻璃珠的 250ml 三角瓶内，加入 95%酒精 5ml、无菌水 20ml、稀硫酸（1:10）10ml，在旋涡均匀器上充分振摇，使种曲孢子分散，然后用三层纱布过滤，用无菌水反复冲洗，务使滤渣不含孢子，最后稀释至 500ml。 5.1.2 制计数板 取洁净干燥的血球计数板盖上盖玻片，用无菌滴管取孢子稀 释液 1 小滴滴于盖玻片的边缘处（不宜过多），让滴液自行渗入 计数室中，注意不可有气泡产生。若有多余液滴，可用吸水纸吸干，静止

22、5min，待孢子沉降。 5.3 观察计数 5.1.3 观察 用低倍镜头和高倍镜头观察，由于稀 释液中的孢子在血球 计数板上处于不同的空间位置，要在不同的焦距下才能看到，因而计数时必须逐格调动微 调螺旋，才能不使之 遗漏，如孢子位于格的线上，数上线不数下 线，数左 线不数右线。 5.1.4 计数 使用 1625 规格的计数板时，只 计板上四个角上的 4 个中格（即 100 个小格），如果使用2516 规格的计数板时，除计 四个角上的 4 个中格外，还需要计中央一个中格的数目（即 80个小格）。每个样品重复观察计 数不少于 2 次，然后取其平均值。 5.1.5 计算 （1）1625 的计数板 孢子

23、数（个/g）=(N/100) 40010000(V/G)=4104(NV/G)（1） 式中 N100 小格内孢子总 数（个） V孢子稀释液体积（ml） G样品重量（g） （2）2516 的计数板 孢子数（个/g）=(N/80) 40010000(V/G)=5104(NV/G) 式中 N80 小格内孢子总数（个） V孢子稀释液体积（ml） G样品重量（g） 5.2 酶活力的测定方法取试管两只，每只试管加入样 品稀释液 1ml，置于 40 度水浴中预热 2min，再各加入经同样预热的酪蛋白 5ml，精确保温 10min。时间到后，各管立即加入 0.4mol/L 三氯醋酸 5ml，以终止反应。继续水

24、浴中保温 20min，使残余蛋白 质沉淀后离心分离或过滤。取滤液用 751 分光光度计在 275nm 处测定其吸收度。空白实验 2 测定方法同上，唯在加酪蛋白之前先加 0.4mol/L 三氯醋酸 5ml，使 酶失活，在加酪蛋白。计算：在 40 度下每 1min 水解酪蛋白产生 1Ug 酪氨酸，定义为一个蛋白酶活力单位。蛋白酶活力单位A/10 11KN K：常数，吸光度为 1 时蛋白酶活力单位，由酪氨酸 标准曲线得出N:为稀释倍数6、各种因素对制曲的影响（主要是 孢子数和酶活力的影响）6.1 不同培养基配比的对制曲的影响培养基配比（质量百分比） 孢子数（个/g） 蛋白酶活力(U/g)麸皮麸皮 9

25、0面粉 10麸皮 80面粉 20麸皮 70面粉 30麸皮 60面粉 40麸皮 50面粉 506.2 不同水分量对制曲的影响以上面的结果确定培养基配比，考 查不同水分对制曲的影响初始水分（水为混合物料的质量百分数） 孢子数（个/g） 蛋白酶活力(U/g)5560657075806.3 不同接种量对制曲影响以上面确定的水分和培养基，考查不同接种量制曲的影响接种量（孢子毫升数） 孢子数（个/g） 蛋白酶活力(U/g)1015202530356.4 不同 pH 对制曲的影响以上面得到的水分、培养基和接种量考查不同起始 pH 对制曲的影响培养基原始pH孢子数（个/g） 蛋白酶活力(U/g)5.566.577.586.5 不同培养温度对制曲的影响以上面得到的数据考查不同温度对制曲的影响不同培养温度（） 孢子数（个/g） 蛋白酶活力(U/g)25283032356.6 培养时间对制曲的影响在以上优化的条件下，考查不同培养 时间对制曲的影响制曲时间（h） 孢子数（个/g） 蛋白酶活力(U/g)48566064687276806.7 不同氯化钠浓度对蛋白酶活力的影响在上面得到的条件制曲，采用不同浓度的氯化钠浸提蛋白 酶，考 查不同浓度达氯化钠对酶活力的影响氯化钠浓度（） 孢子数（个/g） 蛋白酶活力(U/g)123456小结：根据上面的实验结果对影响米曲霉制曲的主要条件进行分析，得出结论。