1、降胆固醇乳酸菌的筛选、鉴定及降解机制的研究浙江工商大学 汪晓辉一、降胆固醇培养基的制备根据 Razin 等 48提供的方法制备胆固醇胶束，作为高胆固醇培养液中的胆固醇源。准确称取 220 mg 卵磷脂和 100 mg 胆固醇于具塞试管，加入三氯甲烷溶剂 5 mL，超声波振荡溶解。氮气流吹干溶剂，加入 10 mL 无菌水。试管放入冰浴，通氮气条件下超声波(130 w, 20 kHz) 处理 15 min，停止 5 min 保持温度平衡，循环三次；所得的溶液于 4，10000 r/min 离心 20 min，所得的上清液即为卵磷脂-胆固醇胶束溶液。4保存，当天使用，作为胆固醇源添加于 MRS 培养
2、基中，用于以下的实验。二、邻苯二甲醛法测定胆固醇含量49取 1 mL 样品，加入 3 mL 95%乙醇和 2 mL 50% (w/v)氢氧化钾，旋涡振荡。于 60下恒温水浴 10 min 冷却后加入 5 mL 正己烷。旋涡振荡萃取 1-2 min, 加入 2 mL 蒸馏水，振荡均匀，静置分层，取 2 mL 上层正己烷，60水浴氮气吹干，加入 4 mL 0.5 mg/mL( w/v )邻苯二甲醛溶液( 用冰醋酸定容)和 2 mL 浓硫酸，显色反应 20 min，于 553 nm 处测定吸光度值。三、胆固醇标准曲线的测定准确称取 0.1 g 胆固醇粉末，正己烷定容 1 mg/mL 的溶液。然后分别
3、取0.02, 0.04, 0.06, 0.08, 0.1, 0.12, 0.14 mL 到比色管中，60水浴氮气吹干后，加入 4 mL 0.5 mg/mL 邻苯二甲醛溶液和 2 mL 浓硫酸，显色反应 20 min，在 553 nm 处测定吸光度值，以胆固醇含量为横轴，吸光度值为纵轴作标准曲线。四、降胆固醇乳酸菌的体外筛选将乳酸菌接种于 MRS 液体培养基，37静置培养 I2 h 转接 3 次活化后，按 2% ( v/v)接种量接种于 5 mL 降胆固醇筛选培养基中，摇匀后立即取样 1 mL, 4000 r/min 离心 5 min，取上清液用邻苯二甲醛比色法测定胆固醇含量。接种后的发酵液 3
4、7静置培养 48 h 后用同样方法测定上清中胆固醇含量，做多组平行求平均值。胆固醇的降解率： V=（B-A）/B100%式中:A 为各实验菌株发酵后的培养液 553 nm 处的吸光度值。B 为空白对照 553 nm 处的吸光度值。降胆固醇益生菌的研究黑龙江大学 徐晶雪一、胆固醇标准曲线的制作精确称取的胆固醇 100 mg，溶于无水乙醇中，并定容至 100 mL，再精确移取此胆固醇溶液 10 mL，加入无水乙醇定容至 100 mL，即为胆固醇标准液，吸取胆固醇标准液 0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，10，1.2，1.4，1.6，1.8 mL，于试管中。在各管中加入无水乙醇使总体积达 2
5、mL，再沿管壁缓慢加入 2 mL 硫酸铁铵显色剂，加完以后再充分振摇混匀，促进呈色。将各试管室温放置 30 min后于分光光度计 560 nm 波长读取各管吸光度值(A)，并绘制标准曲线。二、供试菌液的制备(1)供试菌液的活化培养将斜面保存的菌株接种至 MRS 液体培养基中， 30恒温培养 16-18 h，取菌悬液 1mL 转接至装有 50 mL MRS 液体培养基的 250 mL 三角瓶中 30静置培养 16-18 h。 (2)菌悬液的制备将菌液 4000 r/min 离心 15 min 用已灭菌的生理盐水洗涤菌体沉淀三遍并悬浮于等体积的无菌生理盐水中。三、MRS-CHOL(高胆固醇 MRS
6、 培养基)的制备精确称取胆固醇 0.5 g，用少量无水乙醇溶解并定容至 50 mL，终浓度 10.0 mg/mL，用孔径为 0.45 m的微孔滤膜过滤除菌后，按照 1%的量加入到已灭菌的 MRS 液体培养基中，使 MRS 液体培养基中胆固醇终浓度为 0.1 mg/mL。四、菌株体外降胆固醇能力的测定将菌株菌悬液分别以 1%和 5%的接种量接种于 MRS-CHOL 培养基中，37恒温培养（低速振荡培养 60-80 r/min）48 h 和 72 h 后分别测各菌株胆固醇降解能力。菌株胆固醇降解能力的测定：取菌株液体培养物以及未接菌的 MRS-CHOL培养基，摇匀后吸取 0.2 mL 于装有 4.8 mL 无水乙醇的离心管中，混匀；室温放置 10 min； 4000 r/min 离心 5 min；取上清液 2 mL 于试管中，缓缓加入 2 mL 硫酸铁铵工作液，立即摇匀，空白样为 2 mL 无水乙醇加入 2 mL 硫酸铁铵工作液，室温放置 30 min 于 560 nm 下测各个样品的吸收值，并计算胆固醇的降解率。胆固醇降解率=(胆固醇总量- 上清中胆固醇的量)/胆固醇总量
