1、授课教师 常祖明 学生人数 55 课 题 PCR 产物的琼脂糖凝胶电泳检测 授课类型 新授课 授课方法 讲授、演示 教学用具 多媒体、实验室设备 教学目的 通过本实验掌握琼脂糖凝胶电泳的原理，学会琼脂糖凝胶电泳的操作技术 教学重点 琼脂糖凝胶的制备及点样操作 教学难点 理解琼脂糖凝胶电泳的原理 教学过程 一、实验目的1.掌握琼脂糖凝胶电泳的原理2.学会琼脂糖凝胶的制作和进行电泳的方法二、实验原理1.DNA 琼脂糖凝胶电泳的原理琼脂糖是一种线性多糖聚合物，天然聚合长链状分子，在沸水中溶解，45开始形成多孔性刚性滤孔，凝胶孔径的大小取决于琼脂糖的浓度，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。DNA
2、分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。（1）电荷效应DNA 分子在 PH 值高于其等电点的溶液中带负电荷，在电泳时向阳极移动。【等电点】在某一 pH 的溶液中，DNA 分子解离成阳离子和阴离子的趋势及程度相等，所带净电荷为零，呈电中性，此时溶液的 pH 称为该 DNA 分子的等电点，用 pI 表示。当 DNA 溶液 pH pI，- 当 DNA 溶液 pH pI，+当 DNA 溶液 pH=pI。溶解度最小。（2）分子筛效益在一定的电场强度下，DNA 分子的迁移速度主要取决于分子筛效益，即 DNA 分子本身的大小和构象（共价闭环 DNA线状 DNA开环 DNA） ，而且其迁移速度与其相对
3、分子质量的对数值成反比，所以不同相对分子质量的 DNA 分子可以在琼脂糖凝胶电泳中分离。2.溴化乙锭对 DNA 分子进行染色的原理观察琼脂糖凝胶中 DNA 最常用的方法是利用荧光染料溴化乙锭进行染色。溴化乙锭是一种高度灵敏的荧光染色剂，用于观察琼脂糖凝胶中的 DNA 分子。溴化乙锭在紫外光照射下能发射荧光，当 DNA 样品在琼脂糖凝胶中从负极向正极泳动时，溴化乙锭从正极向负极移动，这样溴化乙锭分子就会嵌入到 DNA 分子中的碱基对之间形成络合物，这种络合物在紫外光下发射的荧光要比单纯的 DNA 分子要强的多，便于 DNA 的检测。三、实验器材1.电泳仪北京市六一仪器厂，DYCZ-24DN 型2
4、.移液枪：5l3.微波炉4.锥形瓶：250ml5.线手套6.容量瓶：1000ml7.紫外分析仪四、实验材料与药品实验材料：实验五中鸡血 DNA PCR 产物1.DNA Marker 作用：主要用途就是 DNA 分子凝胶电泳时，加样用做对比来检测琼脂糖凝胶是否有问题。通过其大小可以粗略估算样品 DNA 分子量的大小。商品信息：2000bp，50 次，紫色液体理化性质：DNA Marker 是分子量不同的 DNA 片段，主要成分 Tris-HCl、EDTA 、甘油、溴酚蓝储存：短期 4保存，长期-20保存。危害：避免与皮肤眼睛接触。2. GoldView 核酸染色剂作用：一种可代替溴化乙锭（EB）
5、的新型核酸染料，其灵敏度与 EB 相当，使用方法与之完全相同，在 100ml 琼脂糖胶溶液中加入 5l GoldView即可。在紫外透射光下双链 DNA 呈现绿色荧光，也可用于染 RNA。 商品信息：1ml/瓶理化性质：储存：室温保存 2 年。危害：虽然未发现 GoldView 有致癌作用，但对皮肤、眼睛会有一定的刺激，操作时应戴上手套。【使用方法】1. 将 100ml 琼脂糖凝胶溶液（浓度一般为 0.8%2%）在微波炉中融化。2. 加入 5l GoldView，轻轻摇匀，避免产生气泡。3. 冷却至不烫手时倒胶，待琼脂糖凝胶完全凝固后上样电泳。4. 电泳完毕在紫外灯下观察。【注意事项】1. 胶
6、厚度不宜超过 0.5cm，胶太厚会影响检测的灵敏度。2. 加入 GoldView 的琼脂糖凝胶反复融化可能会对核酸检测的灵敏度产生一定影响，但不明显。3.琼脂糖作用：制备琼脂糖凝胶原料，分离和鉴定核酸。商品信息：100g/瓶理化性质：琼脂糖在水中一般加热到 90以上溶解，温度下降到 35-40时形成良好的半固体状的凝胶，这是它具有多种用途的主要特征和基础。储存：阴凉干燥处密闭储存。危害：无4.三羟甲基氨基甲烷（Tris）作用：生物缓冲剂，用于凝胶电泳配置缓冲液。商品信息：500g/瓶理化性质：是一种白色结晶或粉末。溶于乙醇和水，微溶于乙酸乙酯、苯，不溶于乙醚、四氯化碳，对铜、铝有腐蚀作用，有刺
7、激性的化学物质。储存：有吸湿性，在阴凉干燥处密闭储存。危害：对眼睛、皮肤、呼吸道有刺激作用。5.硼酸作用：TBE 缓冲液成分之一。商品信息：分析纯，500g/瓶理化性质：为白色粉末状结晶或三斜轴面鳞片状光泽结晶，有滑腻手感，无臭味。溶于水、酒精、甘油、醚类及香精油中，水溶液呈弱酸性。储存：阴凉干燥处密闭储存。危害：有刺激性。6.乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na）作用：螯合 Mg2+或 Mn2+离子,抑制脱氧核糖核酸酶（DNase）活性，活性依赖于钙离子，并能被镁离子或二价锰离子激活。商品信息：瓶/250g。理化性质：无味无臭或微咸的白色或乳白色结晶或颗粒状粉末。溶于水，不溶于乙醇、乙醚，其水
8、溶液 pH 值约为 5.3。可由 EDTA 与氢氧化钠和碳酸钙作用制得。储存：于阴凉、通风的库房。远离火种、热源。应与氧化剂分开存放，切忌混储。配备相应品种和数量的消防器材。储区应备有合适的材料收容泄漏物。危害：对粘膜和上呼吸道有刺激作用。对眼睛、皮肤有刺激作用。本品可燃，具刺激性。7. 6DNA LodingBuffer作用：第一，里边的指示剂溴酚蓝和二甲苯氰 FF 起到指示的作用，显示电泳的进程，以便我们适时终止电泳；第二，里边的成分甘油可以加大样品密度，使样品密度大于 TBE，从而沉降到点样孔中，防止样品飘出点样孔。商品信息：5ml/瓶。含溴酚兰、二甲苯青和甘油等，按 5ul 样品加 1
9、ul Buffer，混匀直接上样。理化性质：储存：2-8两年。危害：有刺激性。五、实验试剂1. 0.5TBE（PH8.0）缓冲液【5TBE 缓冲液（PH8.0） 】母液Tris 108g + 硼酸 27.5g + 0.5M EDTA 20ml 定容到 1000ml 高压灭菌 4保存临用时用水稀释 10 倍 0.5TBE 缓冲液（PH8.0）【0.5M EDTA（PH8.0）溶液】水 800ml + EDTA-2Na 186.1g 剧烈搅拌 用 NaOH 调 pH 值至 8.0（约需 20g NaOH 颗粒） 定容至 1L 分装后高压灭菌备用。注意：EDTA-2Na 在 PH 值接近 8.0 时
10、才能完全溶解。2.1.0%琼脂糖溶液琼脂糖 0.5g + 0.5TBE 缓冲液 50ml 放入锥形瓶中混匀 微波炉中加热溶解 六、实验步骤（一）1%琼脂糖凝胶的制备1.选择合适的凝胶托盘放置于制胶器的合适区域。2.称取 1g 琼脂糖置于 250ml 锥形瓶中，加入 100ml 0.5TBE 缓冲液。3.将锥形瓶放入微波炉中加热使琼脂糖充分溶解。4.将 5l GoldView 核酸染色剂加入其中，摇晃充分混匀。5.待胶冷却至 60 度左右，将融化的琼脂糖小心的倒入制胶器中，速度要快，再把梳子（试样格）插入凝胶托盘两边槽内。6.让胶自然冷却至完全凝固（约需 20-30 分钟） 。小心的将梳子拔出（
11、注意先拔一侧） ，将胶连同凝胶托盘放入电泳仪中，加入 0.5TBE 缓冲液，使缓冲液没过凝胶 1-2mm（注意加样孔靠近负极一端） 。如样品孔内有气泡，应除去。（二）加样1.将适量的 DNA Marker 用移液枪加入凝胶的第一个孔中。2.在 PCR 产物中加入 6DNA LodingBuffer（每 5ul 产物加入 1ul），混匀后，用移液枪加入到样品孔内，每孔加 2ul。3.盖好上盖，连接电泳仪电源与电泳仪之间的电泳导线，注意不要接错正负极。4.调好电压，打开电源开始电泳，根据指示剂迁移的位置，判断是否中止电泳。切断电源后，再取出凝胶。（三）凝胶紫外观察：凝胶取出于紫外监测仪或凝胶成像系统中观察，照相，保存，记录结果。七、注意事项1.琼脂糖融化时，档位不宜太高。2.制胶和加样过程中要防治气泡的产生。3.必须戴手套操作，严格注意防护。4.加样时，Tip 头不宜插入样品孔太深，也不要穿破胶孔壁，否则样品渗漏或 DNA 带型不整齐。5.电源接通时，应核实凝胶的方向是否正确。6.电泳仪有电压显示，并不一定标志电泳槽已接通，应观察电极气泡出现情况。负极的气泡比正极多一倍，表示电泳已开始。将两者混匀后加入点样孔，注意枪头尽量往下，同时防止气泡产生。八、思考题影响 DNA 迁移速率的因素有哪些？
