1、干旱胁迫对小麦幼苗生理生化指标的影响孙晶（11 应用生物教育 B 班，学号：114120294） 摘要：本文以实验室提供的小麦种子作为材料， 在实验室种植， 评估小麦种子发芽率， 并利用 PEG 模拟小麦干旱胁迫， 通过紫外分光光度计法测定小麦幼苗各生理生化指标综合评价干旱胁迫对小麦生理生化的影响， 实验发现， 干旱胁迫下， 小麦幼苗抗氧化酶系统、 脯氨酸、 谷胱甘肽、 抗坏血酸、 过氧化氢、 可溶性糖和丙二醛含量均明显增加， 表现出有效的抗旱效应， 说明在干旱胁迫下， 植物能够通过合成自身所需的以上物质来达到抗旱的作用， 而且这些物质可以作为植物抗旱指标来对植株进行抗旱性评价。 关键词： 小
2、麦、 干旱胁迫、 发芽率、生理生化指标Abstract: By the wheat seeds provided the laboratory， assessment of wheat cultivation in laboratory， count the germination rate of the seeds， and the use of PEG simulation of wheat drought stress， by ultraviolet spectrophotometry method for the determination of the physiological a
3、nd biochemical indexes of the wheat seedlings so that comprehensive evaluation drought stress on Wheat Physiological and biochemical effects. Experiments show that， under drought stress， the antioxidant enzyme system， proline， glutathione， ascorbic acid， hydrogen peroxide， soluble sugar and the cont
4、ent of MDA of the wheat were increased significantly， showing effective drought resistance effect， described in drought stress， plant can produce their own desired more material to achieve the role of drought resisting， and these substances can be used as plant drought resistance index of plants dro
5、ught resistance evaluation.Key words: wheat、 drought stress、germination rate、 physiological and biochemical index引言小麦是全球总产量排名第二的粮食、经济作物,主要播种面积分布于气候干旱与半干旱地。所以,小麦的抗旱性研究对缓解全球粮食生产问题具有重要意义。干旱、盐碱和低温是强烈限制作物产量的三大非生物因素, 其中干旱造成的损失最大, 其损失超过其他逆境造成损失的总和。 【1】 干旱是我国农业可持续发展面临的主要问题之一, 干旱胁迫对植物的影响是一个复杂的生理生化过程, 涉及到许多生物
6、大分子和小分子。 【2】 研究表明，游离的脯氨酸在植物细胞抵抗非生物胁迫过程中扮演着越来越重要的角色，许多新的生理功能也逐渐被发现，近几年来有关脯氨酸的研究倍受科学工作者的关注【9-13】 。干旱是一种最常见的胁迫，遇此逆境作物除进行气孔调节外，渗透调节也不夹为一种有效方法。原理是通过加强合成代谢，增加细胞内渗透物质浓度，降低渗透势，维持膨压和细胞正常生理功 能。脯氨酸作为水溶性最大的氮基酸(1623g (100g)。H 2O，25 oC)具有较强水合能力，是理想的渗透介质。作物遇旱时它的大量积累有助于细胞或组织持水，防止脱水，故可视为作物对干早环境的一种保护性适应。已经证明了在逆境条件下脯氨
7、酸的积累来抵抗植物对非生物胁迫的伤害，植物体内的抗氧化酶系统也能将伤害细胞的活性氧控制在可忍耐水平内，通过各种过氧化酶的协同作用，可以把细胞内产生的具有很强氧化活性的活性氧如O2-、H2O2 、OH-等直接或间接地清除，防止了活性氧放大级联作用，保证了细胞内生命活动的正常进行。丙二醛（MDA）是由于植物官衰老或在逆境条件下受伤害，其组织或器官膜脂质发生过氧化反应而产生的，对干旱也具有抵抗作用。GSH 作为生物体内主要的还原态硫之一，在生物体抵抗各种胁迫(冷害、干旱、重金属、真菌等) 的过程中起着重要的作用，其含量水平的高低与植物对各种环境胁迫的忍耐程度密切相关。近些年来，它在高等植物代谢过程中
8、的生理作用，尤其是在植物抵御活性氧伤害过程中的作用及其与植物抗逆性关系的研究进展很快。前人研究进展植物在正常生长情况下, 活性氧的产生和清除处于动态平衡状态。当植物在逆境条件下( 如干旱胁迫) 生长时, 这种平衡被打破, 体内负责清除活性氧的抗氧化系统能力下降, 从而造成活性氧的大量积累, 并引发或加剧膜脂过氧化作用, 导致生物膜系统受损。过氧化物酶( POD) 、多酚氧化酶（PPO） 、过氧化物 GSH(谷胱甘肽)等能够有效地清除这些自由基 , 是酶促防御系统的重要组成成分。人们根据这一理论对干旱胁迫下的许多作物如小麦【3-4】 、大豆【5】 、辣椒【6】 、胡杨【7】等逆境生理过程进行了研
9、究。本实验切入点与其它作物相比, 小麦在干旱胁迫下具有独特的生存策略, 是一种公认抗逆性较强的作物, 利用干旱胁迫处理小麦幼苗 , 测定其丙二醛( MDA) 含量、GSH 含量、脯氨酸含量、H2O2 含量及 PPO、 POD 活性变化, 探讨干旱胁迫对小麦幼苗膜脂过氧化及酶保护系统的影响, 为进一步明确大麦抗旱的生理机理提供一定理论依据。干旱胁迫下，小麦的产量与品质将严重下降，所以小麦抗旱性的研究得到了高度重视。各方面的研究都取得了很大进展，本文将根据有关研究与文献资料, 从生理生化方面对小麦抗旱性研究作一简述。1.材料与方法1.1 实验材料的选取各取 50 粒吸胀的玉米种子和小麦种子， 沿胚
10、的中心线切成两半（严格区分两个半粒） ， 进行下列实验：其中 50 个半粒进行 TTC 染色（30水浴 20 min）另 50 个半粒进行曙红染色（室温染色 10 min）根据两种方法的染色情况， 分别计算发芽率。选取多粒同品系且饱满的小麦种子（购于西山种子公司） ， 先用 0.1% HgCl2 消毒 10 min 后， 用蒸馏水漂洗干净， 再用蒸馏水于 26下吸涨 12 h，播种在两个垫有 6 层湿润滤纸的带盖白磁盘（24cm16cm）中 ，于 26下暗萌发 60h， 计算发芽率（注意与前面结果比较） ； 挑选出长势一致的小麦苗做干旱 5 天处理（去除较矮小或较高的小麦苗） 。 1.2 实验
11、材料的处理（干旱胁迫处理）. 把上述小麦幼苗分成实验组和对照组， 将实验组用 PEG 溶液浇灌处理； 对照组小麦苗仍然用蒸馏水浇灌继续培养。 处理结束后， 把小麦幼苗转移到26下恢复培养 7 天， 每天光照 12h， 观察对比实验组和对照组小麦苗生长差异变化情况。1.3 测定抗逆指标及方法1.3.1 测定抗逆指标脯氨酸（Pro）的含量运用紫外分光光度法测定。 提取： 分别取 0.1 g 实验组和对照组的小麦胚芽鞘， 加入 3 mL 3%磺基水杨酸（SSA）和少许石英砂， 充分研磨后用 2 mL 3% SSA 冲洗研钵， 用离心机 5000 rpm 离心 10 min ， 取其上清液定容至 5
12、mL。 测定： 取上清液各 2 mL， 分别加入 2 mL 冰乙酸和 2 mL 茚三酮试剂， 水浴煮沸 15 min， 冷却后再 5000 rpm 离心 10 min（若没沉淀可略此步骤， 分别测定 A520。 用总显 VWLA520Pro content = (mol.g-1FW)1.3.2 测定抗逆指标可溶性糖和丙二醛（MDA）的含量运用紫外分光光度法测定。 提取： 分别取 0.1 g 实验组和对照组小麦苗， 加入 3 mL 10%TCA 和少许石英砂， 充分研磨后用 2 mL 10%TCA 洗研钵， 5000 rpm 离心 10 min， 取其上清液定容至 5 mL。 测定： 分别取上清
13、液各 2 mL， 加入 0.6%TBA（用 10%TCA 配制） 2 mL， 水浴煮沸 12 min， 冷却后用离心机 5000 rpm 离心 5 min （视沉淀有无） ， 分别测定 OD450 和 OD532。 OD450=C185.4OD532=C1 7.4+15500 C2求解方程得： C1/(mmol/L)=11.71OD450C2/(umol/L)=6.45OD532 - 0.56OD450公式中 C1 为可溶性糖的浓度； C2 为 MDA 浓度。 1.3.3 测定抗逆指标 H2O2 的含量运用紫外分光光度法测定。 提取： 分别取 0.1 g 实验组和对照组， 加入 3 mL 50
14、 mM PBS (pH=6.8， 内含1mM HA)和少许石英砂， 充分研磨后用 2 mL PBS 洗研钵， 用离心机5000 rpm 离心 10 mi， 取其上清液定容至 5 mL。 测定： 分别取上清液各 3 mL， 加入 0.1%Ti(SO4)2 用 20%(v/v) H2SO4 配制 1 mL， 摇匀， 用离心机 5000 rpm 离心 10 min ， 测定 OD410。 用总显 VWLA410H2O2 content = (mol.g-1FW)1.3.4 测定抗逆指标抗氧化酶(POD) 的含量运用紫外分光光度法测定。 提取： 分别取对照组和实验组小麦苗 0.1 g 作为实验材料，加
15、入少许石英砂和3 ml 提取液（ 50mmol/L PBS, pH6.0,内含 0.mmol/ LEDTA, 1%PVP） ， 充分研磨后完全转入离心管中， 再用 2 ml 提取液洗研钵， 5000 rpm 离心 10 min ， 取上清液定容至 5 ml ， 用于测定 POD 和 PPO 酶活性。 POD 测定： 取 POD 反应混合液（10 mmol/L 愈创木酚， 5 mmol/L H2O2,用PBS 溶解） 2.95 ml， 加入酶液 50 ml（空白调零用 PBS 取代） ， 立即记时，摇匀， 读出反应 2 min 时的 A470。 PPO 测定： 取 PPO 反应混合液（ 20 m
16、mol/L 邻苯二酚， 用 PBS 溶解）2.9 ml， 加入酶液 0.1 ml（空白调零用 PBS 取代） ， 立即记时， 摇匀， 读出反应 2 min 时的 A410。 以每分钟 A 值变化 0.01 所需要的酶液的量为一个活力单位（ U） ， 则： 用总显 VtWA470POD activities = (mol.g-1FWmin-1)用总VtWA01.40PPO activities = (U.g-1FW)1.3.5 测定抗逆指标 GSH 的含量运用紫外分光光度法测定。 提取： 分别取 0.1 g 实验组和对照组的胚芽鞘， 加入 3 mL 5%三氯乙酸（TCA）和少许石英砂， 充分研磨
17、后用 2 mL 5% TCA 洗研钵， 5000 rpm 离心 10 min ， 上清液定容至 5 mL。 测定： 上清液各 1 mL (空白用 5%三氯乙酸代替) ， 分别加入 2 mL0.1M PBS (pH=7.7) 、 0.5 mL 4 mM DTNB， 然后于 25 下 5 min， 测定 A412。用总显 VWLA12GSH content = (mol.g-1FW)1.3.6 测定抗逆指标 ASA 的含量运用紫外分光光度法测定。 提取： 分别取 0.1 g 实验组和对照组的胚芽鞘， 加入 3 mL 5%三氯乙酸（TCA）和少许石英砂， 充分研磨， 用 2 mL 5% TCA 洗研
18、钵， 用离心机 5000 rpm 离心 10 min， 取其上清液定容至 5 mL。 测定： 上清液各 0.8 mL (空白用 5% TCA 代替) ， 分别加入 0.8 mL 0.15 M NaH2PO4 (pH=7.4) 和蒸馏水， 混合均匀， 分别加入 0.8 mL 5% TCA、 44%磷酸和 4%联吡啶， 摇匀， 再加入 3%FeCl3 0.8 mL， 于 37 下 15 min ， 测定 A525。 用总显 VWLA52ASA content = (mol.g-1FW)2.结果与分析2.1 计算实验材料玉米种子的发芽率随机抽取的 50 粒玉米种子中， TTC 染色：有生命活力的有
19、43 粒； 曙红染色： 有生命活力的有 50 粒； 表一 曙红染色、 TTC 法测定玉米种子发芽率*发芽率 （%） 玉米 曙红染色 100% TTC 染色 86% 注： *占计数种子的百分比。 2.2.计算实验组和对照组小麦中指标含量记录实验数据并计算各指标含量： 计算含量时， 各指标单位不统一。 测定的 POD 活性单位： mol.g-1FWmin-1；PPO 活性单位： U.g-1FW； Pro 含量单位：mol.g -1FW； GSH 含量单位：mol.g-1FW； ASA 含量单位： mol.g-1FW； H2O2 含量单位： mol.g-1FW； 可溶性糖含量单位： mmol/L;
20、丙二醛含量单位： umol/L。实验小麦指标含量 指标 对照组 实验组 对照组含量 实验组含量 POD 活性 (A470) 1.055 1.664 65.94 104PPO 活性(A410) 0.243 0.894 303.75 1117.5Pro（A520） 0.108 2.534 16.2 380.1GSH（A412） 0.271 0.304 54.2 60.8ASA（A525） 0.128 0.149 38.4 44.7 H2O2（OD410） 0.510 1.645 26.78 86.36可溶性糖（OD450） 0.111 0.357 0.48 7.39丙二醛（MDA）* 0.097
21、0.180 0.18 2.25 *注： 表中可溶性糖和丙二醛（MDA）OD 值同时测得， 0.111 和 0.357 为OD450 值， 0.097 和 0.180 为 OD532 值， 供计算丙二醛含量时使用。 (所有含量计算结果保留两位小数点）2.3 干旱胁迫对小麦幼苗 Pro 含量变化的影响在本实验中， 经PEG处理的小麦幼苗脯氨酸含量为380.1mol/gFW ， 而对照组小麦幼苗脯氨酸含量则只有16.2mol/gFW； 实验组含量约为对照组幼苗脯氨酸含量的24倍， 说明在抵抗干旱胁迫过程中， Pro具有十分重要的影响作用。Pro（A520） 0.108 2.534 16.2 380.
22、1图一. Pro含量比较050100150200250300350400A520 Pro含 量对 照 组实 验 组2.4 干旱胁迫对小麦幼苗可溶性糖、 MDA 含量变化的影响干旱胁迫下可溶性糖和MDA 含量显著增加。 在本实验中， 干旱处理的小麦幼苗可溶性糖含量约为对照组的15倍； 干旱处理的小麦幼苗MDA 含量约为对照组的12倍， 可溶性糖和MDA二者在小麦植物抗旱过程中均起重要作用。可溶性糖（OD450） 0.111 0.357 0.48 7.39丙二醛（MDA）* 0.097 0.180 0.18 2.25 图二. 可溶性糖、 MDA 含量比较012345678可 溶 性 糖 含 量 M
23、DA含 量对 照 组实 验 组2.5 干旱胁迫对小麦幼 H2O2 含量变化的影响在本实验中， 从小麦幼苗体内提取得到的 H2O2 含量较低， 对照组含量为 26.78umol/gFW,实验组含量为 86.36umol/gFW， 实验组约为对照组的 3 倍， 说明在抵抗干旱胁迫过程中， H2O2 起到一定程度的抗旱作用。H2O2（OD410） 0.510 1.645 26.78 86.36图三. H2O2 含量比较0102030405060708090OD410 H2O2含 量对 照 组实 验 组2.6 干旱胁迫对小麦幼苗抗氧化系统变化的影响将实验组和对照组POD和PPO 活性指标含量做统计分析
24、， 结果如下。 从图一、 二可以看出， 经过干旱处理的小麦幼苗， 在抗胁迫中表现出抗氧化酶POD活性、 PPO活性保持较高的水平， 而未经干旱处理的对照组小麦幼苗中抗氧化酶活性和抗氧化剂水平则明显较低。 POD 活性 (A470) 1.055 1.664 65.94 104PPO 活性(A410) 0.243 0.894 303.75 1117.5图四. POD 活性和 PPO 活性比较020040060080010001200A470 POD活 性 A410 PPO活 性对 照 组实 验 组2.7 干旱胁迫对小麦幼苗 GSH 变化的影响从图四对比结果可以看出， 在本实验中， 干旱胁迫处理的小
25、麦幼苗GSH含量约为对照组的4倍， 差异明显。 是植物中普遍存在的硫醇， 在还原硫的贮存和运输、 蛋白质和核酸合成方面均有重要作用， 且在植物抗逆性方面的作用尤为重要， 其主要功能是清除植物体内的活性氧， 因此说明在干旱条件下， 植物体因为抗旱而进行的各种生理活动使得细胞内活性氧含量增加。GSH（A412） 0.271 0.304 54.2 60.8图五. GSH 含量比较010203040506070A412 GSH含 量对 照 组实 验 组2.8 干旱胁迫对小麦幼苗 ASA 含量变化的影响ASA 作为自由基消除剂， 可以作为初级抗氧化物直接清除单线态氧、 超氧化物和羟自由基， 可以提高植株
26、的抗逆性。 经过实验发现， PEG干旱模拟处理的小麦幼苗ASA含量相对于未处理的小麦幼苗较高（图五） ， 对于植物抗旱有一定协助作用。ASA（A525） 0.128 0.149 38.4 44.7 图六. ASA 含量比较051015202530354045A525 ASA含 量对 照 组实 验 组3.讨论与结论本实验选用小麦种子作为实验材料， 测定其抗旱指标并对其抗旱性评估， 所有抗旱指标均采用紫外分光光度计测定其在细胞内的含量； 为避免生物钟 5对各测定指标含量的干扰， 实验选择在相同时间段（上午10:30左右）对各指标进行测定。 实验结果表明， 聚乙二醇模拟干旱对小麦幼苗抗氧化酶系统、
27、脯氨酸、 谷胱甘肽、 ASA、 过氧化氢、 可溶性糖和丙二醛含量均明显增加，表现出不同程度的抗旱效应。 小麦抗旱能力的高低是多种因素共同作用下的综合反应， 其中， 干旱胁迫下小麦的生理生化特性差异被认为是小麦抗旱性差异的内在原因。 抗氧化系统是保护植物细胞免受自由基伤害的防线 6,POD、 PPO是植物体中非常重要的末端氧化酶， POD可以清除植物体内多余H2O2， PPO可以把酚类物质转变为醌； 在植物活体组织中， 酚类化合物几乎全部以糖苷和酯类形式存在， 糖苷和水解酶共同存在于同一细胞的不同细胞器中， 二者难以接触， 但当它们与糖结合形成糖苷后， 就不再具有生物活性或生物活性显著降低。 在
28、植物活体组织中的酚类化合物处在氧化还原平衡状态， 这种平衡是在其体内酶系统的催化下维持的。 此外， ASA可以在一定程度上减缓干旱对作物造成的不利影响 7， 以POD为代表的抗氧化酶系统和以ASA为代表的抗氧化剂组成的抗氧化系统对植物体内活性氧（ROS）水平起着精密的调控作用， 从而将活性氧控制在细胞可忍耐的水平 8。 因此， 它们在植物抗逆性中起着非常重要的作用， 是植物抗逆性的重要生理指标。 脯氨酸是一种有机渗透调节物质， 在干旱胁迫下植物体内会迅速积累脯氨酸 910。 脯氨酸含量的增高能够降低叶片细胞的渗透势， 防止细胞脱水； 脯氨酸具有很高的水溶性， 可以保护细胞膜系统 11， 因此脯
29、氨酸积累的多少常作为植物抗逆性筛选的指标,它与植物的抗旱性有密切关系。 本实验表明， 干旱胁迫诱导植株体内渗透调节发生变化， 脯氨酸是改善作物渗透调节能力的重要代谢产物之一。 是植物中普遍存在的硫醇， 在还原硫的贮存和运输、 蛋白质和核酸合成方面均有重要作用， 且在植物抗逆性方面的作用尤为重要， 其主要功能是清除植物体内的活性氧 1213。 实验结果表明， 干旱胁迫条件下， 小麦幼苗GSH含量增加， 促进植株抵抗干旱。 前人利用不同浓度的外源H202处小麦实验结果表明， 外源H202理导致小麦中脯氨酸质量分数增加， 即便是较低浓度的H202胁迫下也能诱导小麦脯氨酸的积累， 从而缓解活性氧胁迫对
30、植株造成的伤害， 提高小麦对氧化胁迫的适应能力 14本实验并未提供外源H202， 然而模拟干旱条件下的小麦幼苗和正常对照小麦幼苗中H202含量存在明显差异， 所以猜想植物自身通过合成H202来缓解活性氧胁迫， 对提高小麦抗寒性有促进作用。 可溶性糖不仅是植物合成其他有机物的起始物质， 还是植物体内重要的渗透性调节物， 前人通过研究干旱胁迫下植株抗旱指标的变化发现， 随着随着胁迫时间的延长， 植株内可溶性糖含量和MDA含量增加， 表现为极显著正相关 15。 渗透调节是植物适应水分胁迫的主要生理机制， 通过渗透调节可使植物在干旱条件下维持一定的膨压， 从而维持细胞生长， 气孔开放和光合作用等生理过
31、程的进行。 所以在渗透调节过程中， 二者都起到十分重要的作用。 MDA(Malondialdehyde)是细胞膜脂过氧化的最终产物， 是膜系统伤害的最重要的标志之一。 干旱胁迫下， 植株自身MDA的积累与膜透性的增加成极显著正相关， 具有抗旱剂作用 16。 总之， 小麦在干旱条件下， 抗氧化酶系统、 脯氨酸、 谷胱甘肽、 抗坏血酸、 过氧化氢、 可溶性糖和丙二醛含量显著增加， 保护小麦植株组织， 提高小麦抗旱性能。参考文献:【l】陈培元.作物对干旱逆境的反应和适应A 吴向钰，植物生理补充教材 纪念 56 年教学研讨会 40 周年C.中国植物生理学会, 1996,46122。 【2】田士林, 李
32、莉. PEG6000 渗透胁迫对小麦抗旱性的影响 J . 湖北农业科学, 2008, 47( 1) : 19- 21. 【3】吕庆, 郑荣梁. 干旱及活性氧引起小麦膜脂过氧化与脱酯化 J . 中国科学 ( C 辑) , 1996, 26( 1) : 26- 30. 【4】石庆华, 林嘉鹏, 姚正培, 等 NaCl 胁迫对小麦生理生化特征的影响 J 新 疆农业科学, 2010, 47( 7) : 1 479- 1 484【5】王启明, 徐心诚, 马原松, 等. 干旱胁迫下大豆开花期的生理生化变化与抗 旱性的关系 J . 干旱地区农业研究, 2005, 23( 4) : 98- 101. 【6】蔡
33、小东, 郭见林. PEG 模拟干旱胁迫下辣椒相关生理指标的变化 J . 湖南 农业科学, 2008, ( 6) : 49- 50, 58. 【7】袁月, 吕先辉, 徐敏等 。干旱迫胁下不同胸径胡杨生理特色分析 J 新疆 农业科学, 2009, 46(2) : 299- 3058 白志英， 李存东， 刘渊 干旱胁迫下小麦叶片脯氨酸和蛋白质含量变化与染色体的关系 植物遗传资源学 2007， 8（3）： 325-3309 陈亚鹏， 陈亚宁， 李卫红 干旱胁迫下的胡杨脯氨酸累积特点分析 干旱区地理 2003， 26（4）10 李广敏， 关军锋 作物抗旱生理与节水技术研究 北京： 气象出版社， 2001
34、11 戴高兴， 彭克勤， 萧浪涛等 聚乙二醇模拟干旱对耐低钾水稻幼苗丙二醛、 脯氨酸含量和超氧化物歧化酶活性的影响 中国水稻科学 2006， 20（5）： 557-55912 陈雁君， 王艳， 程晓平等 噻虫胺胁迫对小白菜中谷胱甘肽和蛋白质含量的影响 济宁医学院学报2011， 34（6）13 杜琳， 张荃 植物谷胱甘肽与抗氧化胁迫 山东科学， 2008， 21（）： 273214 卢金， 杨颖丽， 贾鹏翔等 外源H202处理对小麦渗透性调节物的影响 兰州大学学报(自然科学版) 2012， 48（1）【l5】刘祖祺, 等. 植物抗性生理学 M. 北京: 中国农业出版社, 1994. 84-195. 【l6】陈少裕. 膜脂过氧化对植物细胞的伤害J. 植物生理学通讯, 1991,27(2): 84-90. 【17】张立军,魏 颖,等. H2O2信号在植物理化胁迫反应中的作用. 辽宁农业科学 2008(2): 3337 【18】孙侨南. 旱胁迫对黄瓜幼苗光合特性及活性氧代谢的影响.2008
