1、实验一、 蛋白质的表达、分离、纯化和鉴定 第一部分 蛋白质的表达、分离、纯化1、目的要求（1）了解克隆基因表达的方法和意义。（2）了解重组蛋白亲和层析分离纯化的方法。2、实验原理克隆基因在细胞中表达对理论研究和实验应用都具有重要的意义。通过表达能探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理，同时克隆基因表达出所编码的蛋白质可供作结构与功能的研究。大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统，其表达外源基因产物的水平远高于其它基因表达系统，表达的目的蛋白量甚至能超过细菌总蛋白量的 80%。本实验中，携带有目标蛋白基因的质粒在大肠杆菌 BL21 中，在 37，IPTG（异丙基-D-硫代半乳糖苷）诱导下，
2、超量表达携带有 6 个连续组氨酸残基的重组氯霉素酰基转移酶蛋白，该蛋白可用一种通过共价偶连的次氨基三乙酸（NTA）使镍离子（ Ni2+）固相化的层析介质加以提纯，实为金属熬合亲和层析（MCAC）。蛋白质的纯化程度可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。3、试剂和器材一、试剂1 LB 液体培养基：Trytone 10g, yeast extract 5g, NaCl 10g, 用蒸馏水配至 1000mL.2 氨苄青霉素：100mg/mL3 上样缓冲液：100 mM NaH2PO4, 10 mMTris, 8M Urea, 10 mM2-ME, pH8.04 Washing Buffer：100 mM
3、NaH 2PO4, 10 mM Tris, 8 M Urea, pH6.35 Elution Buffer:100 mM NaH2PO4, 10 mMTris, 8M Urea, 500 mM Imidazole, pH8.06 IPTG二、器材摇床，离心机，层析柱（110 cm）4、操作方法一、氯霉素酰基转移酶重组蛋白的诱导1. 接种含有重组氯霉素酰基转移酶蛋白的大肠杆菌 BL21 菌株于 5mL LB 液体培养基中（含 100ug/mL 氨苄青霉素），37震荡培养过夜。2. 转接 1mL 过夜培养物于 100mL（含 100ug/mL 氨苄青霉素）LB 液体培养基中，37震荡培养至 OD6
4、00 = 0.6 - 0.8。取 10ul 样品用于 SDS-PAGE 分析。3. 加入 IPTG 至终浓度 0.5 mmol/l, 37继续培养 1-3h.4. 12，000rpm 离心 10 min, 弃上清，菌体沉淀保存于-20或-70冰箱中。二、氯霉素酰基转移酶重组蛋白的分离，纯化1. NTA 层析柱的准备：在层析柱中加入 1mL NTA 介质，并分别用 8mL 去离子水，8mL 上样缓冲液洗涤。2. 重组蛋白的变性裂解：在冰浴中冻融菌体沉淀，加入 5mL 上样缓冲液, 用吸管抽吸重悬，超声波破裂菌体，用振荡器等轻柔的混匀样品 60min, 4 12000rpm 离心 30 min,
5、将上清吸至一个干净的容器中，并弃沉淀。取 10ul 上清样品用于 SDS-PAGE 分析。3. 上清样品以 10-15mL/h 流速上 Ni2+-NTA 柱，收集流出液，取 10ul 样品用于 SDS-PAGE 分析。4. 洗脱杂蛋白：用 Washing Buffer 以 10-15mL/h 流速洗柱，直至 OD280 = 0.01.分步收集洗脱液，约 3-4h,取 10ul 洗脱开始时的样品用于 SDS-PAGE 分析。5. 洗脱目标蛋白：用 Elution Buffer 洗柱，收集每 1 mL 级分，分别取 10ul 样品用于SDS-PAGE 分析。第二部分 蛋白质的鉴定1、目的要求（1）
6、了解 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳实验原理。（2）掌握凝胶电泳实验操作规程。2、实验原理电泳可用于分离复杂的蛋白质混合物，研究蛋白质的亚基组成等。在聚丙烯酰胺凝胶电泳中，凝胶的孔径，蛋白质的电荷，大小，性质等因素共同决定了蛋白质的电泳迁移率。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。但如果加入某种试剂使电荷因素消除，则电泳迁移率就取决于分子的大小，就可以用电泳技术测定蛋白质的分子量。十二烷基硫酸钠（SDS）就具有这种作用。在蛋白质溶液中加入足够量 SDS 和巯基乙醇，SDS 可使蛋白质分子中的二硫键还原，蛋白质SDS 复合物带上相同密度的负电荷，并可
7、引起蛋白质构象改变，使蛋白质在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质原的电荷和形状的影响，而取决于分子量的大小，因此聚丙烯酰胺凝胶电泳可以用于测定蛋白质的分子量。SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳大多在不连续系统中进行，其电泳漕缓冲液的 pH 值与离子强度不同于配胶缓冲液。该凝胶包括积层胶和分离胶两部分。当两电极间接通电流后，凝胶中形成移动界面，并带动加入凝胶的样品中的 SDS 多肽复合物向前推进。样品通过高度多孔性的积层胶后，复合物在分离胶表面聚集成一条很薄的区带（或称积层）。由于不连续缓冲系统具有把样品中的复合物全部浓缩于极小体积的能力，从而大大提高了 SDS 聚丙烯酰胺凝胶的分辨率，使蛋白依各自的大小得到
8、分离。3、试剂和器材一、试剂1 30AcrBis 贮存液：30g Acr,0.8g Bis, 用无离子水溶解后定容至 100mL,不溶物过滤去除后置棕色瓶贮于冰箱。2 1.5mol/L Tris(pH8.8)3 10% (w/v) SDS4 10% 过硫酸铵： 4保存。5 TEMED6 3SDS 凝胶加样缓冲液：50mmol/L Tris-HCl(pH6.8), 300mmol/L DTT, 6% SDS, 0.6%溴酚蓝，30% 甘油7 5Tris-甘氨酸电泳缓冲液：15.1g Tris 碱，94g 甘氨酸（电泳级），50mL 10% SDS, 配至 1000mL.8 考马斯亮蓝染液：0.2
9、5g 考马斯亮蓝 R250 溶于 90mL 甲醇：水（1：1）和 10mL冰乙酸的混合液中。9 脱色液：水：乙酸：乙醇 = 6.7：0.8：2.5二、器材DYCZ-24D 型垂直板电泳槽, 移液管（1，5，10mL），烧杯（ 25，50，100mL），细长头的吸管，微量注射器（10L 或者 50L）。4、操作方法一、SDS 聚丙烯酰胺凝胶的配置：1. 安装玻璃板，检查漏液情况。2. 制备分离胶：按表 1 分离胶所示，依次在试管中混合各成分，一旦加入 TEMED 后，凝胶马上开始聚合，故应立即快速悬动混合物，迅速在两玻板的间隙中灌注丙烯酰胺溶液，注意流出积层胶所需空间。并在其上覆盖一层水或异丁醇
10、溶液。将凝胶垂直放置于室温下。分离胶聚合后（约 30min），倒出覆盖层液体，用枪将残留液体吸净。 制备浓缩胶：按表 1 积层胶所示，依次在试管中混合各成分，一旦加入 TEMED 后， 应立即快速悬动混合物，迅速在分离胶上灌注浓缩胶溶液，并立即在浓缩胶溶液中插入干净的电泳梳，小心避免混入气泡。将凝胶垂直放置于室温下。分离胶（5mL）水 30%丙烯酰胺 1.5M Tris（PH8.8） 10%SDS 10%过硫酸铵 TEMED1.1mL 2.5mL 1.3mL 50l 50l 2l浓缩胶（4mL）水 30%丙烯酰胺 1M Tris（PH8.8） 10%SDS 10%过硫酸铵 TEMED2.7mL
11、 0.67mL 0.5mL 40l 40l 4l二、上样样品的处理：将样品置于 1SDS 凝胶加样缓冲液中，在 100加热 5min 使蛋白质变性。加热后3000rpm 离心 1min.三、 电泳：1. 浓缩胶聚合完全后（约 30min），将凝胶固定于电泳装置上，并加入 Tris-甘氨酸电泳缓冲液，然后小心移出电泳梳。2. 按预定顺序加样，小心缓慢加入样品，每样品加 12ul。3. 将电泳与电源相接，凝胶上所加电压为 8V/cm,当染料前沿进入分离胶后，把电压提高到 15V/cm，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部（约 4h），然后关闭电源。4. 将玻璃板从电泳装置上卸下，并将凝胶取出，在第一点样孔侧的凝胶上切去一角以标注凝胶的方位。四、 考马斯亮蓝染色1. 用染液浸泡凝胶，用保鲜膜封好，略微加热，放在水平摇床上染色 15min, 重复加热染色 1 次。2. 移出并回收染液，将凝胶浸泡于脱色液中，用保鲜膜封好，略微加热，放在水平摇床上脱色 30min,更换脱色液，直至检出蛋白质条带。3. 拍照并分析蛋白质的诱导，表达，分离纯化情况。
