1、276 中国神经免疫学和神经病学杂志201i年7月第18卷第4期Chin J Neuroimmunol&Neurol 2011，Vo118，No4 人AChRFc融合蛋白真核表达载体的构建和表达 常婷 林宏 刘煜 李柱一 摘要：目的 构建含人AChRal亚单位胞外段(Hal一210)一IgG1Fc融合基因的真核表达载体，表达人 AChRFc融合蛋白。方法 扩增Hal-210基因，插入含有CMV启动子、小鼠Kappa链先导序列以及人IgG1从 铰链区到CH3基因片段的真核表达载体pAN1782中，构建重组表达载体pANHal一210，并经酶切、测序鉴定； 采用脂质体法将重组载体转染CHO-K1细
2、胞，经G418加压筛选、ELlSA检测，挑选高表达融合蛋白的阳性转化 子扩大培养；表达的AChRFc融合蛋白经Protein A亲和层析柱纯化，SDS-PAGE、Western blot鉴定。结果 酶切及测序结果证实Hal一210基因序列正确，真核表达载体pANHal一210构建成功；ELISA检测证实 ChR Fc融合蛋白在细胞培养上清中呈分泌表达；SDS-PAGE结果显示该融合蛋白的相对分子质量约为5【000； Western blot结果显示该融合蛋白能被特异性单克隆抗体mAb198所识别。结论成功构建pANHal一21O真 核表达载体，并获得具有生物活性的AChRFc融合蛋白，为进一步
3、开展融合蛋白靶向B细胞治疗重症肌：J己力的 研究奠定了基础。 关键词：重症肌无力；融合蛋白；真核表达；CHOK1细胞 中图分类号：R7461 文献标识码：A 文章编号：10062963(2011)04027604 Construction and expression of a fusion protein containing extracellular domain of human AChRal and Fc fragment of human IgG1 CHANG Ting，LIN Hong，LJU Y ，L Zhuyi Department of Neurology，Tangdu H
4、ospital， g Fourth Military Medical University，Xian Shaanxi 710038，China Corresponding author：LI Zhuyi，Email：lizhuyifmmueducn ABSTRACT： Objective To construct eukaryotic expression vector containing the extracellular domain of the human AChRMsubunit(Hal一210)and Fc fragment of human IgG1，and to expres
5、s human AChRFc fusion proteinMethods The extracellular domain of Hal一210 was amplified and inserted into pAN1782 eukaryotic expression vector with a cytomegalovirus promoter，a murine immunoglobulin i-chain leader sequence and the human genomic IgG 71 constant region from the hinge to the end of CH3R
6、ecombinant expression vector pAN Hal一210 was constructed and evaluated by restriction enzyme analysis and sequencingThe right pANHal一210 plasmid was transfected into CHOK1 cells with lipofectin reagent and selected by G418The positive clone with high expressing fusion protein were selected through E
7、LISA detection and culturedAfter purified by protein A affinity column chromatography，the AChRFc fusion protein was identified by SDS_PAGE and Western blot assayResults Restriction enzyme and sequencing indicated Hal一210 gene sequence was correct and pANHal一 210 had been constructed successfullyAChR
8、Fc fusion protein could be detected by ELISA assay in the C HO-K1 culture supernatantThere was only one special band at the position of relative molecular mass 51 000 by SDS- PAGE assayand it was equivalent to expected valueWestern blot analysis also showed that fusion protein could react to mAb198C
9、onclusions We successfully constructed eukaryotic expression vector pANHa卜210 and obtained AChRFc fusion protein with biological activitythus lay a foundation for further works on the treatment of myasthenia gravis(MG)by targeting B cells Key words：myasthenia gravis；fusion protein；eukaryotic express
10、ion；CH()_K1 cells 重症肌无力(myasthenia gravis，MG)是典型 的由自身抗体介导、T细胞参与、补体依赖的自身 免疫性疾病。乙酰胆碱受体(AChR)抗体(ACh doi：i03969jissn10062963201104015 基金项目：国家自然科学基金面上资助项目(30870841) 作者单位：710038第四军医大学唐都医院神经内科 通讯作者：李柱一，Email：lizhuyifmmueducn RAb)是MG发病的重要效应分子，如果能从源头 上清除分泌AChRAb的B细胞，将会有效控制病 情。但目前尚无特异性清除AChR反应性B细胞 的手段。“克隆选择学说
11、”认为一种B细胞表达和 分泌一种抗体，B细胞所分泌抗体的特异性和该B 细胞表面表达的B细胞抗原受体(BCR)的特异性 一致 。基于此理论，设计可以被某种BCR所识 中国神经免疫学和神经病学杂志2011年7月第18卷第4期Chin J Neuroimmunol&Neurol 2011，Vo118，No4 别的分子并耦联另一功能分子如毒素、促凋亡分 子、抑制性配体等，则可能实现对该B细胞的特异 性识别和杀伤。该研究将人AChR al亚单位胞外 段(Hal一210)插入含有人IgGIFc基因的真核表达 载体pAN1782中，构建重组表达载体pANHal一 210，将其转染CHO-K1细胞进行稳定表达
12、，获得 具有生物活性的AChRFc融合蛋白，为进一步开 展AchRFc融合蛋白靶向B细胞治疗MG的研 究奠定了基础。 1材料和方法 11材料 111载体和细胞：pAN1782真核表达载体由祝 道成教授惠赠，大小为6215 bp，该载体含有CMV 启动子、小鼠Kappa链先导序列以及人IgG1从铰 链区到CH3的基因片段，可引导外源蛋白分泌性 表达3。此外，该基因含有筛选标记基因neo，可 进行G418筛选。中国仓鼠卵巢细胞株cHOK1 由第四军医大学细胞生物学教研室惠赠。 112抗体和试剂盒：抗人AChRal亚单位单克 隆抗体(mAb198)购自Santa Cruz公司，HRP一兔 抗大鼠Ig
13、G购自武汉博士德公司，抗人AChRal 亚单位胞外段单克隆抗体(mAb35)由作者单位科 室刘睿博士用商品化mAb35单抗细胞株提纯制 备，HRP-山羊抗人IgGFc由祝道成教授惠赠，质 粒小量快速提取试剂盒购自Omega公司，Lipo feetamine丁M2000为Invitrogen公司产品，胶回收 试剂盒购自中国安徽优晶公司，蛋白A亲和层析 柱购自美国Pierce公司。 12方法 121 pANHal一210真核表达载体构建及鉴定： 根据Hal一210的结构基因，设计引物如下 上游引 物为 5 一GGTCGACGGTGGAGGCGGTTCAG GCGGAGGTGGCTCTGGCGGTG
14、GCGGATCG GGCTCCGAACATGAGACCCGT-3 ，含有Sal I 酶切位点(划线部分)及15个氨基酸(Gly Ser)。的 linker序歹 。下游引物为5，_GGCGGCCGCTCA CAGGCGCTGCATGACGAAGTGGTAGGT一3 。 含有Not工酶切位点(划线部分)及终止密码子。 以质粒人AChRal亚基全长序列为模板，PCR扩 增目的片段Hal一210。反应体系为：95预变性5 min、98。C变性10 S、68复性10 S、72延伸30 S、 循环35次，最后72延伸7 min，完成后4保 存。反应结束后取5 L进行1 (质量浓度)的琼 脂糖凝胶电泳分析。
15、胶回收目的片段，将回收的 PCR产物和载体pAN1782同时用Sal工Not工 双酶切，再次胶回收，然后将目的片段和载体以 6：1的比例用T4连接酶16过夜连接。连接产 物转化感受态DH5a，氨苄西林LB平板筛选阳性 克隆。以碱裂解法提取质粒，用Sal工Not工双酶 切，酶切产物经1 (质量浓度)琼脂糖凝胶电泳分 离，紫外灯下观察结果，同时将剩余的菌液送北京 奥科生物公司进行序列分析。 122脂质体介导重组载体转染CHOK1细胞 及筛选：CHOK1细胞常规培养于含10 96(体积分 数)胎牛血清(fetal calf serum，FCS)的DMEM F12混合培养基中；以Lipofectami
16、neTM 2000为介 质，按照说明书的步骤，将重组载体pANHal一210 及空载体pAN1782转染CHOK1细胞，转染24 h 后施加筛选压力，改用含G418(800gmL)的选 择培养基进行培养。加压筛选14 d后，待对照组 细胞全部死亡，将转染细胞进行单克隆化，扩大培 养，建立稳定表达AChRFc融合蛋白的细胞株。 123 夹心ELISA检测培养上清中AChRFc融 合蛋白的表达：用mAb35包被96孔酶标板，4过 夜；次日用3 (体积分数)牛血清白蛋白(BSA) 37封闭2 h后，将单克隆化后的细胞培养上清以 不同稀释比例加于反应孑L中，37孵育1 h，二抗 为HRP标记抗人IgG
17、Fc，TMB为显色底物，孵育 结束后用2 molL硫酸终止反应；立即在ELISA 读数仪上读数判定结果，波长设定在450 nm。 124 AChRFc融合蛋白的亲和纯化：大量培养 高表达融合蛋白的CHOK1细胞株，收集无血清 培养上清12 L，经045 m滤膜除掉细胞碎屑 及杂质，滤液以1 mLmin的流速通过Protein A 吸附柱，然后用10倍体积的结合缓冲液TBS (pH74)清洗吸附柱，加5倍体积的洗脱缓冲溶液 (pH27)，以1 mLmin的速度洗脱，每1 mL的洗 脱液中立即加入100 L TrisHCL中和至pH72 左右，过滤除菌，一20保存。 125 AChRFc融合蛋白的
18、表达及纯度测定：将 纯化后的蛋白进行SDSPAGE分离，先后配制 12 (质量浓度)的分离胶和5 (质量浓度)的浓 缩胶，取蛋白样品2O L煮沸5 min后上样，先恒 压6O V，30 min后将电压升至100 V电泳至溴酚 蓝到达分离胶底部，结束电泳，以考马斯亮蓝G250 染色，鉴定纯化后AChRFc融合蛋白的表达及纯 度。SDS-PAGE后，利用BioRad公司的电转移系 中国神经免疫学和神经病学杂志2011年7月第18卷第4期Chin J NeuroimmunolNeurol 2011，Vo118，No4 统用湿转法将蛋白转移至PVDF膜上，以mAb198 为一抗(1：1000稀释)，H
19、RP一兔抗大鼠IgG(1： 5000稀释)为二抗，进行Western blot分析。 13统计学处理采用SPSS130统计软件进行 分析，数据以均数标准差表示，两组问均数比较 采用StudentS t检验。以P005为差异有统计 学意义。 2 结果 21 Hal-210目的基因的克隆以及重组载体的构 建 以质粒AChRa1亚单位全长为模板进行 PCR得到697 bp的AChRal亚单位胞外段(Hal一 210)基因(图1)；将扩增的目的片段连接至真核表 达载体pAN1782中，用Sal INot I双酶切鉴定， 表明重组表达载体pANHal一210构建成功(图 2)，测序结果证实Hal一210
20、成功插入pAN1782载 体中，且与人类基因库中核酸序列完全一致，并未 出现点突变或框移。 697 2000 i000 750 500 250 1O0 1：PCR产物；M：DL2000 marker 图1 Hal一210基因的PCR扩增结果 2000 1000 750 500 250 100 M：DL2000 marker；1：pANHal一2lOSal I+Not I；2 pANHal一210 图2重组载体的酶切鉴定 22细胞的转染与表达筛选 用pANHal一21O 转染CHOK1细胞后，于培养上清中检测到融合 蛋白的表达；而空载体pAN1782转染上清中为阴 性(图3)；经稳定筛选，最后得
21、到1O株高表达融合 蛋白的单克隆细胞，建立稳定表达AChRFc融合 蛋白的细胞株。 1：10 1：2O 1：50 1：100 细胞培养上清液稀释水平 图3 EI ISA法检测AChR Fc融合蛋白的表达 23 AChRFc融合蛋白的纯化、鉴定 挑选1株 生长良好且表达量高的细胞株用无血清培养基进 行大规模培养，收集大量培养上清经蛋白A亲和 层析柱纯化，还原型SDSPAGE检测可见一特异 的相对分子质量约为51 000的蛋白条带(图4)，与 所表达的AChR-Fc融合蛋白预期大小一致。纯化 蛋白经SDSPAGE凝胶薄层扫描显示，纯度大于 9O 。Western blot分析显示，转染细胞培养上清
22、 在相对分子质量为51 000处可见一清晰条带，而 未转染细胞培养上清中检测结果为阴性 图5)。 (Mr) 1 M (Mr) 1：纯化的融合蛋白；M：蛋白Marker 图4 SDPAGE分析AChR Fc融合蛋白的表达 (Mr) 5l 000 1、2分别为转染和未转染pANHal 210的细胞培养上清 图5 AChRFc融合蛋白表达的Western blot分析 * 靛 皿趟如趣 u m2 中国神经免疫学和神经病学杂志2011年7月第18卷第4期Chin J NeuroimmunolNeurol 2011，Vo118，No4 279 3 讨论 MG是典型的由自身抗体介导的器官特异性 自身免疫性
23、疾病。多种细胞和分子均参与了MG 的发病过程，其中AChR反应性B细胞是MG病 理过程中的下游调控分子，其产生的AChRAb可 以通过内摄、降解等一系列机制最终导致功能性 AChR数目的下降，并激活补体直接破坏AChR 以及神经肌肉接头，最终产生肌无力症状。尽管 MG患者抗AchRAb存在异质性，可识别AChR 上的不同表位，但绝大部分限于AChR a亚单位胞 外段4。该研究将Hal一210与人IgG1Fc段在基 因水平上耦联，表达AChRFc融合蛋白，其AChR 特异性结合AChR反应性B细胞，Fc段则发挥多 种效应机制：(1)结合该B细胞表面抑制性受体， 引起BCRFeyR1I B交联，抑
24、制B细胞活化，促进 其凋亡；(2)结合单核一巨噬细胞等效应细胞表面的 Fc受体，介导抗体依赖的细胞毒作用；(3)活化补 体杀伤该B细胞；(4)以二聚体形式表达的融合蛋 白交联B细胞表面的BCR促进B细胞凋亡_5。 该研究将克隆的目的片段Ha1210置于Fc 段的下游序列，在目的片段和Fc段之间用一段15 个氨基酸(Gly Ser)。的Linker序列将二者连接起 来，该序列通常用于单链抗体的表达 。Linker 序列的设计既可以增强两段序列的连接，而且还可 防止连接的过程中两条序列单独表达互补配对形 成二聚体。耦联Fc段的目的不仅在于其可以发挥 其生物学效应，如介导抗体依赖细胞介导的细胞毒 性
25、作用和激活补体产生的细胞毒性作用，而且还可 显著延长蛋白的半衰期。 该研究成功地构建了真核表达载体pAN Hal一210，转染CHOK1细胞进行筛选，建立稳定 表达细胞株；夹心ELISA结果证实该融合蛋白在 细胞培养上清中呈分泌性表达，其两个结构域可分 别结合相应的抗体mAb35和抗人IgGiFc，mAb35 是对AChR空间构象高度依赖的抗体，提示融合 蛋白具有正确的空间构象；SDSPAGE、Western blot检测表明，融合蛋白的相对分子质量同预期的 结果一致，经Ultra Scan薄层扫描显示纯度可达 9O 以上。pANHd1210重组载体的构建及 AChRFc融合蛋白的成功表达为下
26、一步检测融合 蛋白的功能奠定了基础。 参考文献 1Vincent AUnravelling the pathogenesis of myasthenia gravis EJNat Rev Immunol，2002，2(10)：797804 2Hodgkin PD，Heath WR，Baxter AGThe clonal selection theory：50 years since the revolutionJNat Immunol， 2007，8(10)：10191026 3Zhu D，Kepley CI ，Zhang M，et a1A novel human immuno globuli
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