1、本文由探生科技技术人员提供，如果您想了解更多关于抗体的信息，可以访问 Fantibody 全球抗体搜索引擎，您身边的抗体专家查找相关资料,希望对您有帮助！1凋亡相关基因Bax 在不同细胞中表达产物差异检测1 实验目的1.1 通过测定凋亡相关基因Bax 在不同细胞中表达产物差异检测，研究缺糖对细胞增殖抑制作用的机制（引起细胞凋亡或坏死） 。1.2 掌握免疫组织化学法的原理。2 实验原理2.1 免疫细胞化学和亲和组织化学免疫细胞化学（免疫组化）将抗原、抗体间的免疫反应引入细胞标本，并通过对其所带有的特殊标记物的显示，从而对细胞内某抗原或抗体作定性、定位以及定量检测。 亲和组织化学则将一些具有双价或
2、多价结合力的物质(生物素) ，应用于免疫组化，使得抗原抗体的亲和力比免疫组化高出 100 万倍。其更具高灵敏性和高特异性。2.2 凋亡相关基因BaxBax 是 Bcl-2 家族成员。凋亡信号能激活 Bax，使 Bax 蛋白从胞浆移位到线粒体膜上。随后其蛋白构象发生改变（寡聚化） ，使线粒体膜通透性增加，释放 Cytc，引起细胞凋亡。3.3 Bax 表达产物差异检测本次实验以 Bax 构象蛋白为抗原，用小鼠特异性抗体（一抗）与其结合，再用生物素标记的羊抗小鼠抗体（二抗）与前者结合，形成了生物素复合物。此复合物与 SABC 作用，使得检测物被放大，最后在显色剂 DAB 的作用下，Bax 构象蛋白显
3、色（褐色） 。3 实验材料仪器：移液枪、枪头、滴管、显微镜。材料：培养细胞。试剂：甲醇、PBS、封闭液、一抗、二抗、SABC、DAB、0.3H2O2-PBS。4 实验步骤培养细胞（96 孔板，每组 3 正常、3 损伤、3 损伤恢复） PBS 洗，5min X 3 次 (轻轻地洗涤) 甲醇固定 10min PBS 洗，5min X 3 次 加入封闭液（1:10） 25l，37，30min 加一抗（1:300）25l ，37，1h PBS 洗，5min X 3 次 加二抗 25l，37 ，1h PBS 洗， 5min X 3 次 加 0.3 H2O2-PBS，37，30min PBS洗，5min
4、X 3 次 SABC 工作液 20-30l，37，1h PBS 洗，5min X 3 次 DAB 显色，本文由探生科技技术人员提供，如果您想了解更多关于抗体的信息，可以访问 Fantibody 全球抗体搜索引擎，您身边的抗体专家查找相关资料,希望对您有帮助！2观察结果。5 实验结果正常组的细胞形态饱满，胞质透明，基本不着色，核形态规则，为圆形或椭圆形。损伤组中，部分细胞呈现典型凋亡细胞形态，细胞变圆、皱缩，胞质深染，核质比例增大；其余细胞胞质着色较正常组深。损伤恢复组中，少部分细胞呈现典型凋亡细胞形态，细胞变圆、皱缩，胞质深染，核质比例增大；其余细胞胞质着色较正常组深。免疫组化显示，Bax 构
5、象蛋白在正常组细胞中几乎没有表达，而在损伤组和损伤恢复组中均有表达，其中损伤恢复组的 Bax 构象蛋白表达量高于损伤组（图 1） 。图 1 免疫细胞化学法检测 Bax 蛋白的表达A：正常组的 CHL 细胞；B ：损伤组的 CHL 细胞； C：损伤恢复组的 CHL 细胞6 讨论6.1 Bax 可以被凋亡信号激活，从胞浆移位到线粒体膜上，随后其蛋白构象发生改变（寡聚化） ，使线粒体膜通透性增加，释放 Cytc，引起细胞凋亡。Bax 促进凋亡的机理主要是：线粒体渗透性转换、氧化磷酸化和 ATP 的合成功能被破坏；细胞氧化还原作用改变；线粒体中的凋亡相关 Apaf-1 释放出来，与细胞色素 c 相互作
6、用，激活 Caspase 信号转导途径。Bax 构象蛋白含量可以作为评价细胞凋亡的指标。本实验用免疫组化法检测了正常组、损伤组、损伤恢复组的 Bax 构象蛋白表达变化，结果显示，Bax 构象蛋白阳性表达量：损伤组损伤恢复组正常组。由此可知，缺糖对CHL 细胞增殖的抑制作用是通过促进细胞凋亡实现的； 细胞凋亡程度：损伤组损伤恢复组正常组。6.2 本实验中，损伤组细胞的 Bax 构象蛋白表达量高于损伤恢复组，原因可能是损伤时间（5h）不长，线粒体和细胞膜的正常功能未完全丧失，糖的重新加入一方面为细胞提供了能量来源，另一方面可以增强细胞质和线粒体内的应激蛋白（如 grp75）的表达，而A B C本文
7、由探生科技技术人员提供，如果您想了解更多关于抗体的信息，可以访问 Fantibody 全球抗体搜索引擎，您身边的抗体专家查找相关资料,希望对您有帮助！3grp75 的上调表达可以起到保护蛋白质，协助蛋白（特别是线粒体蛋白）转运，提高细胞对应激反应耐受性的作用，从而延缓细胞凋亡。当缺糖时间过长时，由于线粒体和细胞膜的正常功能已基本丧失，糖的重新加入可能不会延缓细胞的凋亡进程，甚至可能通过引起 ROS 的升高，造成缺糖恢复组的凋亡程度高于缺糖组（可以设计实验进行探索） 。6.3 正常组中，细胞密度较高区域的细胞呈现 Bax 构象蛋白高表达，原因可能是接种细胞过多以致部分区域细胞发生凋亡。6.4 几
8、种试剂的作用6.4.1 封闭液可以封闭非特异性位点，从而保证抗原抗体间的特异性结合。6.4.2 0.3 H2O2-PBS（甲醇）可以消除内源性过氧化物酶活性作用，从而消除其对SABC-DAB 显色的影响。6.4.3 SABC 是链酶亲和素生物素过氧化物酶复合，起到信号放大作用。6.5 检测细胞凋亡的其他方法凋亡相关蛋白（Bax, Bcl-2, Caspase-3、8、9 等）表达变化的检测除了用免疫组化法外，还可以用 Western blot 法。除此以外，还可以利用透射电镜、荧光显微镜、DNA ladder、流式细胞仪检测细胞凋亡 。6.6 后续实验设计本实验检测到了 Bax 构象蛋白在损伤
9、组和损伤恢复组细胞中的表达，可以设计后续实验，研究缺糖诱导细胞凋亡的信号通路。核转录因子 B（nuclear factor-B，NF- B）是普遍存在于细胞浆中的一种快反应转录因子，是由 p50 和 p65（Rel-A）两个亚单位构成的异源二聚体，p50 是与 DNA 结合的部分，p65 是与抑制蛋白 IB （Inhibitors of Kappa B）结合的部分。众多研究结果指出，核转录因子 NF-B 在抑制细胞凋亡中起到重要作用。NF-B 有多种功能，其一就是增强Bcl-2 表达和抑制 Bax 表达。 Bax/Bcl-2 比值的升高可以激活 Caspase-3，而 Caspase-3 是细
10、胞凋亡的执行者，它可直接降解胞内的结构蛋白和功能蛋白，引起凋亡。缺糖诱导 CHL 细胞凋亡的机制可能与抑制核转录因子 NF-B 活化，导致 Bax/Bcl-2 比值的上调，继而激活 Caspase-3 有关。故可用 Western blot 法检测凋亡前后 NF-B(p65) 和 Bcl-2、Bax、Caspase-3 的表达变化，从而验证上述假设。本文由探生科技技术人员提供，如果您想了解更多关于抗体的信息，可以访问 Fantibody 全球抗体搜索引擎，您身边的抗体专家查找相关资料,希望对您有帮助！4需要相关抗体试剂的可以访问 Fantibody 全球抗体搜索引擎fantibody 全球抗体搜索引擎是一个供公共检索的抗体数据库，其抗体信息数据来源于全球范围的研究机构与商业公司。该引擎由商品化抗体数据库与抗体应用评价数据库两部分组成，以帮助研究者更高效的寻找并评估该抗体的性能。全球抗体搜索引擎是继基因与蛋白数据库之后更为复杂的应用型检索平台需要相关的实验室仪器设备、生物试剂、医疗器械、制药设备、医药原料、体外诊断试剂及耗材与技术服务信息的，可以访问探生网 biomean 进行咨询，期待您的加入
