1、监测常见药物与关键点一、治疗药物监测（TDM）的质量控制体系建立1.1 TDM 所需仪器TDx 全自动血药浓度分析仪（美国雅培公司） ；AxSYM 全自动免疫分析仪（美国雅培公司） ；ARCHITECT i1000 全自动化学发光免疫分析仪（美国雅培公司） 。1.2 TDM 所需试剂环孢素试剂盒及质控品；他克莫司试剂盒及质控品；地高辛试剂盒及质控品；万古霉素试剂盒及质控品；茶碱试剂盒及质控品；甲氨蝶呤试剂盒及质控品。除环孢素、他克莫司质控品为美国 BIO-RAD 公司生产外，其他试剂均为美国雅培制药有限公司生产。2 方法2.1 样品前处理根据试剂和仪器说明书分别制订环孢素血药浓度监测的标准操作
2、规程（SOP） 、 地高辛血药浓度监测的 SOP 、 万古霉素血药浓度监测的 SOP 、 茶碱血药浓度监测的 SOP 、 甲氨蝶呤血药浓度监测的 SOP 、 他克莫司血药浓度监测的 SOP共 6 种，并制订漩涡振荡器 SOP 、 自动取液器 SOP 、 离心机 SOP ，要求操作人员严格按照 SOP 进行样品前处理。如含环孢素的血样处理，先将血样试管（定标液、质控品）反复颠倒 510 次以上，使血液充分混匀，按序号在每个离心管中加入混匀的血液 200 l，再加入环孢素增溶剂 100 l 和全血沉淀剂 400 l。上述离心管盖好管盖，置漩涡振荡器上振荡 510 s，肉眼观察，必须使血样充分混匀。
3、将离心管置于离心机中配平，13 000 r/min 离心 4 min。离心完毕后，将上清液倒入预处理管中，置漩涡振荡器上振荡 510 s。2.2 上机监测根据仪器说明书制订TDx 的 SOP 、 AxSYM 的 SOP 、 ARCHITECT i1000 的SOP ，在标本上机监测中，严格按照仪器和试剂的 SOP 操作，严格仪器的日、周、月、季度、年的维护和保养，严格每 24 小时的质控对照，确保监测结果的准确性。2.3 结果回馈根据实际操作流程，建立并完善人员职责 、 试剂的管理制度 、 仪器管理制度 、 安全管理制度 、 血样的处理和保存 、 血药浓度测定流程 、血药浓度定期工作流程 、
4、血药浓度检验报告出具的规程 、 PowerLIS 系统的 SOP 、 危急值管理流程 ，将监测仪器与临床检验信息系统（LIS）直接联网，结果直接传入 LIS。同时也便于让临床医师在第一时间看到 TDM 结果。如果 TDM 结果为危急值，LIS 会自动报警，促使临床医师尽快处理。2.4 监测记录在建立和不断完善质量控制体系的过程中，很多问题是在回顾或与以前的记录进行比较的过程中发现的。因此，操作记录可提供许多重要信息。完善和新建各项记录表格，包括仪器保养记录表 、 仪器维修记录表 、标本及结果记录表 、 质量控制值记录表 、 危急值记录表 、 废物处理登记本和定标记录表 、 冰箱温度记录表 、
5、质量失控记录表 。2.5 质量控制室内质量控制是实验室质量保证体系中的重要组成部分，其目的是为了保证每位患者样本测定结果的稳定性。为此建立了室内质控失控处理程序 、室间质控和定标记录表 ，定时进行回顾性分析。将每次的质控值及时导入质控图。质控图以结果为纵坐标，测定次数为横坐标，纵坐标居中的直线为靶值线。靶值线平行的纵坐标+2、2 对应偏差 10为上、下警戒线，+3、3 对应偏差 15为上、下失控线，并呈正态分布；质控值超过3 为失控，报告不能发，应尽快查找原因并改正。3 结果3.1 建立和不断完善 SOP一套完整的制度和 SOP 的建立是非常重要的。因此，不断完善各种制度和仪器的 SOP 共计
6、 34 个，建立各种仪器的保养、维修记录表格 7 个。按科室要求每年初对 TDM 制度和 SOP 进行重新修订完善。根据工作需要随时增加新的SOP。3.2 落实制度及 SOP有了完善的制度和 SOP，还必须严格抓好落实，才能确保 TDM 测定值的最大准确率。加强人员培训，按照实验室人员培训考核制度 ，使上岗药师具备扎实的基础知识，熟练掌握每个 SOP，遇到问题能够查找原因，独立解决。根据药剂科质量与安全管理制度 ，每周有组内质控检查，每月有组间质控检查，药剂科质控组不定期有考核；每年定时参加卫生部的室间质量评价；新方法和新技术出现时进行不定期的院内或院外培训；每次考核、检查、培训等记录和成绩存
7、档，与绩效挂钩。3.3 质量控制的持续改进质量控制是一个持续改进的过程。我们定期加强人员培训，严格按照 SOP操作。如果质控值失控，就按照 SOP 积极查找原因。如 2011 年监测环孢素的过程中发现连续有 3 次质控值失控。第 1 次质控值失控时，查找人员操作的原因，重做质控，仍失控，排除了人员操作的原因。鉴于 3 次质控失控均为同一批号试剂盒，于是考虑不排除是试剂盒的质量原因。通过与雅培工程师沟通和查找记录，发现仪器的日、周、月、季保养都很及时，但年度大保养未做过，于是工程师及时进行了仪器设备的全面保养和管道冲洗，然后重新定标，使得质控值合格。最后得出了结论：仪器可能由于部分管道长时间未清
8、洁，导致定标曲线不稳定，所以造成质控值失控。由此提示我们，仪器的各个保养都不可或缺，并因此完善了仪器的维修和保养记录。TDM 监测结果会直接影响到个体化给药方案的制订，而偏差过大的结果会误导临床制订不合理的给药方案，甚至造成不良后果。全程化的 TDM 质量控制体系不仅需要监测人员认真负责，其他岗位人员也必须严格遵守制度和 SOP。4.1 患者方面针对大多数患者 TDM 知识的欠缺，加大 TDM 的宣传力度，编辑了血药浓度监测宣传册 、 血药浓度监测中需注意的问题 ，并发放到患者手中。4.2 医师和护师护师抽取血样的部位、时间及保存方式都会直接影响到检测结果的正确率。通过临床调查发现，大部分医师
9、和护师不知道正确的抽血时间。根据调查结果和存在的问题，我们设计了血药浓度药师提示卡片：地高辛、茶碱、万古霉素、甲氨蝶呤 4 种单药的药师提示卡片，用简洁的语言概括了该药 TDM 需注意的事项，分发到全院的医师和护师办公室。此外，借助医院局域网和药学服务报定时刊登 TDM 方面的知识和季度分析报告，不定期到临床科室讲课，了解医师和护师在 TDM 方面的需求，普及相关知识。4.3 药师药师应严格按照各种 SOP 操作及报告发放制度，高度重视医师和患者的意见与建议。专门联合移植科召开“血药浓度影响因素及相关病例讨论会” 。按照质量与安全管理制度 ，每周五将本周的工作情况上报给科主任，每月定时召开 1
10、 次组内质量分析会，确保 TDM 值的正确率。综上所述，TDM 的全程化质量控制必须通过不同岗位的责任者来完成，任何岗位的责任者对 TDM 的质量都有直接或间接的影响。二、处方自动筛选系统（）结合利用血药浓度监测设备处方自动筛选系统 （ ，）嵌入医院信息系统 （），可对住院医嘱实时监控。该软件是一种根据临床合理用药基本特点和要求开发的计算机数据库，可实现医嘱审查和药物信息查询，它可及时监测每条用药医嘱可能存在的不合理用药问题，帮助医生、药师等临床专业人员在用药过程中及时、有效地掌握、利用医药知识，从而达到合理用药的目的。研究对象临床药师利用工作站查找出的 年 月住院医嘱中使用地高辛、氨茶碱、万
11、古霉素的患者。研究方法监测工具选用。临床药师利用该系统的筛选功 能 以“用药医嘱”分 别 为“地 高 辛、氨 茶碱、万古霉素” ， “入院日期”以每为一时间段，如“至” ，查找用药医嘱中使用地高辛、氨茶碱、万古霉素的患者。评估方法采取利用工作站筛选和临床药师评估相结合的研究方法。具体实施步骤为，首先由临床药师通过工作站中“监控功能”对患者用药医嘱进行逐一分析，记录标记为存在“药物相互作用” 、 “药物剂量”黑色、红色警告的病例。然后，通过“患者基本信息栏”对年龄、疾病状态进行逐一调阅，记录特殊人群，如老年人、儿童、孕妇、甲状腺功能异常、心脏疾病、肝脏疾病、肾脏疾病患者。最后由临床药师对患者情况
12、进行综合评估，对万古霉素使用疗程次、地高辛服用疗程、氨茶碱使用疗程的患者以及判断为存在有临床意义的“药物相互作用” 、 “药物剂量不足或偏高” 、“特殊病理生理”的患者列为“需行血药浓度监测”的对象，进行临床干预。干预方法采取临床药师到临床与医生面对面交流和发送“血药浓度监测提醒单”的方式，对医生医疗行为进行干预。包括两个方面，一是测定血药浓度，二是解释、利用血药浓度监测结果。若临床药师只提供测定结果，而不协助医生利用结果调整治疗方案，不仅无法保证药物疗效，工作也将很难深入开展。研究表明，临床药师开展工作可通过两个方面介入临床：一是发挥专业特长，开展基本的干预工作，从监测药物正确的取样时间、药
13、代动力学参数、测定结果准确性、运用药代动力学知识预测患者血药浓度等方面向临床医生提供帮助；二是关注医生在患者治疗过程中可能遗漏或忽视的信息，通过全面了解患者的病理生理状态、临床检验结果、查找医嘱中可能发生药物相互作用的因素，向医生提出有理有据的用药建议。临床药师应发挥自身优势，利用好身边的“工具” 。利用血药浓度监测设备、软件、用药助手软件等药学知识，从而为临床提供帮助。研究提示，临床药师不能单纯依靠工作的筛选、监控功能筛选患者，还需要结合临床进行综合判断，向临床医生提出血药浓度建议。建议的提出必须结合临床实际情况详细说明建议行血药浓度监测的理由、合理的用药建议，才能有效地增加医生的依从性，为
14、协同医生合理用药提供有力保证。三、癫痫常用药物监测丙戊酸钠( sodium valproate, VPA)、苯妥英钠(diphenylhydantoin,DPH)、卡马西平(carbamazepine, CBZ)均为临床常用的抗癫痫药物,这些药物药动学过程存在明显的个体差异,治疗窗窄、服药周期长,临床常通过测定其血药浓度对给药剂量进行调整,以避免盲目给药。1 资料和方法1.1 病例资料 为门诊或住院患者,患癫痫需长期服药者。1.2 血药浓度监测方法 VPA、DPH 均采用荧光偏振免疫法(flurosence polarization immunoassay, FPIA), CBZ 采用高效液相
15、色谱法(HPLC)。1.3 仪器和试药 TDX 仪、VPA 试剂盒、DPH 试剂盒均为美国 Abbott 公司生产。岛津高效液相色谱仪,色谱柱为 VP-ODS(150 mm4. 6 mm, 5Lm),流动相为甲醇-水(60：40),流速 1. 0 ml.min-1,检测波长 254 nm,用阿普唑仑作内标。1.4 血样采集 3 种药物取样标本均为血清,测定点为血药浓度达稳态后(连续给药一周以上),下一次给药前采血测定谷浓度。1.5 有效血药浓度范围VPA 为 50100 mg.L-1, DPH 为 1020 mg.L-1,CBZ 为 412 mg.L-1。VPA 临床常用的血药浓度治疗范围为
16、50100 mg.L-1,国外有学者提倡为40100 mg.L-1,另有报道大约有 10%的显效血药浓度低于 50mg.L-1,因此应用 VPA应从小剂量开始,以最小有效剂量控制癫痫发作。CBZ 为一种药酶诱导剂,能诱导肝脏的 CYP3A4 酶,增加其他药物的代谢,也能产生自身诱导加快其自身代谢,如与 DPH、苯巴比妥、VPA 等药物合用时,能加速后者代谢,使其血药浓度下降。文献报道, DPH 在监测的抗癫痫药物中,达有效浓度范围比例均是最低的。另外,DPH 在肝脏的代谢存在饱和现象,当达饱和后,即使增加很小剂量的本品,也会造成血药浓度不成比例地升高,而出现毒性反应.总之,抗癫痫药物的联合应用
17、,易引起血药浓度和临床疗效的变化,并增加肝损害的危险性。因此,该类药物的应用原则应以单一用药为主,尽量避免不必要的联合用药,或选择代谢途径不一致,相互作用较小的药物联用,同时必须加强血药浓度监测,及时调整剂量。抗癫痫治疗理想的目标是以单个抗癫痫药物的最低有效剂量完全控制发作而无任何副作用。四、HPLC 法测定常见血药浓度1、卡马西平HPLC 法7测定患者血清中 CBZ 浓度,以 Hypersil C18(200mm4.6mm, 10m)作为色谱柱,甲醇-水(45：55)为流动相,流速 0.9ml/min-1,柱 30,检测波长 254nm,取患儿血清 0.1mL 加 3mL 乙醚萃取 3 次水
18、浴挥干复溶进样,直接用外标标准曲线法,计算血药浓度,最低检测限为 1 mg.L-1。该方法快捷准确,操作简单,无需加内标,完全满足临床监测需要。2、苯巴比妥采用 HPLC 法12测定患者血清中 PB 浓度,色谱条件为: Hypersil C18(200mm4.6mm, 10m)色谱柱,以甲醇-磷酸盐缓冲液(35：65)为流动相,流速 0. 8mL/min-1,柱温 30,检测波长 254 nm,取患儿血清 0. 1mL 加 3mL 乙醚萃取两次水浴挥干复溶进样,直接用外标标准曲线法计算血药浓度,最低检测限为 2mg.L-1。该方法是参考药典13中苯巴比妥片含量测定方法的改进,由于 PB 存在特
19、殊的化学互变异构现象,介质 PH 值可能影响吸收度,为保持流动相体系的酸碱稳定性,故采用缓冲液来代替纯水相。该方法快捷,稳定,操作简便,经多年验证适合临床监测需要。3、丙戊酸由于 VPA 本身不具备紫外吸收特性,必须先进行衍生化反应引入吸收基团后才能使用 HPLC 测定含量。陈艳等17取患儿血清用硫酸酸化,加正戊烷提取,A-溴苯乙酮和三乙胺衍生化反应,然后用 HPLC 法进样测定。4、奥卡西平奥卡西平(oxcarbazepine)是近几年在国内上市销售的新型抗癫痫药物,由于其不良反应少、自身诱导及对肝药酶诱导作用小等优点19目前在儿科临床上广泛使用。由于奥卡西平在体内很快代谢为有活性的 10-
20、羟基卡马西平(10-hydroxycarbazepine,MHD)20,因此临床对奥卡西平药动学和药效学的研究,通常是测定患者血清中 MHD 的浓度。MHD 血药浓度的测定方法多采用 HPLC 法。王刚等24以甲醇-水(50B50)为流动相,A-溴苯乙酮为内标,患者血清用乙酸乙酯萃取,富集浓缩后进样测定 MHD; 本院采用 HPLC 法26测定患儿 MHD 血药浓度,用 C18(200 mm4. 6 mm, 10m)色谱柱,以甲醇-水(40：60)为流动相,流速 0. 8mL/min-1,柱温 30,检测波长 230 nm,取患者血清 0.1mL 加 3mL 乙醚萃取三次水浴挥干复溶进样,直接
21、用外标标准曲线法计算血药浓度,最低检测限为0. 5mg.L-1。该方法无需加入内标,简单快捷,完全满足临床监测需要。5 万古霉素万古霉素(vancomycin)是 20 世纪 50 年代从链霉菌中分离得到的糖肽类抗生素,由于万古霉素存在着严重的浓度依赖性耳、肾毒性,因此卫生部 5 抗菌药物临床应用指导原则 6 将其明确列为需要进行血药浓度监测的抗菌药物之一。目前,国内外关于万古霉素血药浓度监测技术的报道主要包括 FPIA,HPLC 和 LC-MS 法。FPIA 由于受制于国外进口试剂盒,价格昂贵,同时需要集齐多个样本成批次测定,对于少量样本的测定不如 HPLC 法灵活适用。张虹等29以乙腈-0
22、.05 mol.L-1磷酸二氢钾缓冲液(10:90, pH=2.8)为流动相,去甲万古霉素为内标,血清加 10%硫酸锌沉淀蛋白后进样测定。本院建立了固相萃取高效液相色谱法测定患儿万古霉素血药浓度,以乙腈-磷酸二氢钾缓冲液(9：91)为流动相,检测波长 236nm,血清样本上 SPE 柱吸附,用 10%乙酸甲醇液洗脱后氮气吹干后复溶测定。该方法简便适用,内源性杂质干扰少,最低检测浓度可以达 1 mg.L-1,特别适合万古霉素血清谷浓度的测定。6 甲氨蝶呤大剂量甲氨蝶呤(methotrexate, MTX)结合亚叶酸钙解救的方案是目前预防儿童急性淋巴细胞白血病(ALL)髓外白血病和全身巩固治疗的有
23、效措施31。由于 MTX 存在严重的浓度依赖型不良反应,因此其化疗需要在血药浓度监测下实施。国内外测定 MTX 血药浓度的方法主要分为 FPIA,HPLC 和毛细管电泳法。张善堂等33采用蛋白沉淀 HPLC 法测定 ALL 患儿血清中 MTX 浓度,磷酸盐缓冲液(pH=6.8)-甲醇(78:22)为流动相,血清经高氯酸沉淀蛋白高速离心后进样测定; 本院在全国首创 SPE-HPLC 法37测定患儿血清及脑脊液中 MTX 浓度,以甲醇-乙腈-磷酸盐缓冲液(2：7：91)为流动相,检测波长 313 nm,标本经 SPE 柱吸附,甲醇洗脱,氮气吹干复溶后进样测定。该方法可以同时测定生物样本中MTX 及
24、其主要代谢产物 7-OHMTX 的浓度,通过主峰与代谢峰面积的比值可以提前24 h 预测毒副反应的发生38。经过近 10 年的使用该方法稳定性良好,完全满足临床监测需要。7 环孢素 A环孢素 A(cyclosporineA, CsA)是 1970 年从多孢木霉菌和柱孢霉菌的代谢物中提取得到, 1978 年开始用于临床的免疫抑制剂 1。CsA 需要在血药浓度监测下给药。刘晓等39采用 HPLC 法 Kroma-silC8 色谱柱(150 mm4.6 mm, 5m),水-乙腈(25:75)为流动相,柱温 75e,检测波长 210 nm,以环孢素 D 为内标,全血用甲基叔丁基醚和正己烷依次提取进样;
25、黄成琼等40采用 EMIT 法和 HPLC 法测定CsA 浓度,HPLC 条件为:以水-甲醇-乙腈(20:20;60)为流动相,柱温 60e,环孢素D 为内标,全血用乙醚和正己烷反复提取进样测定;目前 HPLC 法测定 CsA 的技术瓶颈是普遍要求柱温较高,达 60e 左右,对色谱柱的损耗很大;另外将 CsA 从血液中提取出来的过程比较繁琐,步骤过多,容易造成操作误差和回收率的损耗,这些问题还有待于进一步研究。目前 TDM 大多采用 FPIA 法和 HPLC 法,少数采用 LC-MS 法。FPIA 法依赖进口试剂盒,价格昂贵,且一个试剂盒只能测定一种药物,方法灵活性不够,而一台高效液相色谱仪理
26、论上可以测定大多数药物的血浓度,试剂价廉易得,因此在性价比方面 HPLC 更占优势。但是由于 HPLC 法对操作人员的专业性和技术性要求较高,且耗时较长,目前在国内 TDM 领域的使用率不高。血液中药物的提取方法主要分为液-液萃取法、蛋白沉淀法和固相萃取法对于脂溶性药物一般采取液-液萃取法提取,萃取液多选用易挥干的乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷和乙醚等有机溶剂,其中乙醚因低毒,不易乳化等优点使用较多。对于水溶性大分子药物的测定国内学者一般采用蛋白沉淀法。但是经过实验研究,我们发现蛋白沉淀法存在一些弊端:一是沉淀蛋白不彻底,标本注入高效液相色谱仪后容易堵塞通路;二是沉淀后的蛋白质对目标药物的吸附性使得
27、回收率普遍不高;三是进样后内源性杂质干扰很大,对于低浓度药物的测定灵敏度不够高;四是沉淀剂如为高氯酸等强酸性物质会对待测物质造成破坏。而固相萃取法无论对脂溶性还是水溶性药物都有广泛的应用和独特的优越性,其分离纯化能力强,内源性杂质去除较彻底等优点,值得引起我们更多的关注。另外,从文献报道我们可以看出,国内血药浓度监测几乎都是提取测定血浆或血清中药物的总浓度,包括游离型药物和蛋白结合型药物之和。体内真正决定药效的是血液中游离型药物浓度的大小。因此,如何将游离型药物分离提取测定值得我们深入研究。TDM的定量计算方法目前国内很多单位采用内标法,但在仪器精密度和重现性高度发展的今天,只要做到规范操作,
28、注意做好质控实验,外标标准曲线法同样能满足临床检测的需要,且较内标法更简便适用。24 王刚,邓玉,刘彬.高效液相色谱法同时测定拉莫三嗪和单羟基卡马西平血药浓度J.中国新药与临床杂志, 2009, 28(10): 757-760.五、治疗药物监测与制定个体化用药方案如果患者在服药期间，使用安全范围较小、个体间存在很大差异的药物，例如：甲氨喋呤、丙戊酸钠和氨茶碱、卡马西平以及地高辛等，这时患者就会被临床药师作为目标患者，对其临床状况进行密切的观察。临床药师会建议医师，进行血药浓度监测，并依据患者的临床表现和药动学原理对血药浓度的结果进行解释。之后，就会与医师一起制定具体的给药方案，对患者进行全面的
29、治疗。例如；氨甲蝶呤（MTX）早期主要用于治疗白血病、绒毛膜上皮癌、肺癌、乳腺癌及恶性淋巴瘤。常规剂量使用时，由于存在耐药性问题，其疗效受到一定限制。近三十年来 , 临床上为了提高疗效，用比常规剂量大几十倍甚至几百倍的 MTX 配合甲酰四氢叶酸钙（CF）解救，简称 HD-MTX-CFR。骨肉瘤患者在使用 HD-MTX-CFR 方案时，就要对患者 0h、24h、48h、72h 血药浓度进行监测，及时了解患者的代谢及解毒情况，调整解毒剂 CF 的用量及给药间隔，避免解毒过量或解毒不足。使患者得到最好的疗效，最小的副作用。随着分子生物学的发展，目前已建立了很多快速且相对费用较低的基因检测方法。而人类的很多基因型和临床表型的关系目前已研究得比较清楚了，因此可以将药物遗传学与个体化用药结合起来。开展对编码药物代谢酶基因多态性进行监测的工作7。例如：对于广泛影响抗肿瘤药物代谢的药物代谢酶（如细胞色素 P450CYP1A2、CYP2C8，双氢嘧啶脱氢酶，硫嘌吟甲基转移酶，亚甲基四氢叶酸还原酶，尿苷二磷酸 - 葡萄糖醛酸转移酶，谷胱甘肽 -S- 转移酶，N- 乙酰化转移酶等）进行基因多态性监测，可以 最大限度地预测抗肿瘤药物对个体差异较大病人的临床疗效及不良反应发生的可能性，从而根据个人遗传背景制定个体用药方案。
