1、微波辅佐提取-高效液相色谱法测定果蔬中的含量应用化学 09952095 陈智毅 张天祥 潘大卫 廖年华 杨樱芝 黄秋香 黄嘉欢 潘潞怡 黎淑貞 谢宇虹摘要 Vc在体内参与多种反应，如氧化还原过程，在生物氧化和还原作用以及细胞呼吸中起重要作用。本实验通过测定果蔬中的 Vc含量，掌握高效液相色谱法原理及应用，熟悉一般样品前处理方法，掌握校准曲线定量法。本实验采用 Phenomenex 18柱 (250 mm4.6 mm, I.D.5 m)；：3%的乙腈-0.05 mol/L KH2PO4水溶液（v/v）作为流动相，流速 1 mL/min的 HPLC操作条件；使用微波辅助提取技术提取水果中的 Vc，
2、采用紫外检测器，在 265nm波长下测定 Vc的吸光值。并与标准系列比较，以保留时间定性，以峰面积定量。Vc 浓度在 5100mg/L范围内与色谱峰面积呈良好的线性关系（Y=38395x + 11668, R 2=0.999） 。关键词 微波辅佐提取 高效液相色谱法 Vc 紫外检测器1. 引言维生素（Vitamin ，V）又叫L-抗坏血酸（Asorbi Aid），是一种水溶性维生素。研究发现，维生素C 在人体内作为辅酶的成分调节机体代谢，减弱毛细血管脆性，增加机体抵抗力；维生素C的协同作用可以提高人体对铁的吸收率，促进外伤愈合。由于Vc 是一种水溶性的强有力抗氧化剂并参与胶原蛋白的合成，它同时
3、还具有防癌、预防动脉硬化、治疗贫血、抗氧化和提高人体免疫力等功效Vc 的缺乏可导致多种疾病，其含量高低常作为某些疾病诊断及营养分析的重要指标，因此Vc 的定量分析在食品、医药等领域相当重要 【1】 。下图是 Vc的结构式：图1.维生素c分子结构式Vc在蔬果中普遍存在，尤其是柑桔类水果中含量较高。樱桃、番石榴、辣椒、猕猴桃等水果中Vc含量在50-300 mg/100 g。 微波辅助萃取具有快速高效、操作简便、节省溶剂等优点，在天然产物、环境、食品等领域中得到广泛应用。目前测定Vc的方法很多，包括药典中的标准方法碘量法、紫外分光光度法、荧光分光光度法、近红外分光光度法、伏安法等 【2】 。各种方法
4、均有自己的独特之处，有些方法要求的实验条件和操作技术较高，而有些方法步骤烦琐，不利于快速分析。微波辅助萃取具有快速高效、操作简便、节省溶剂等优点，在天然产物、环境、食品等领域中得到广泛应用。本实验采用微波辅助萃取法快速萃取蔬果中的Vc，采用高效液相色谱进行分析，以Vc标准系列溶液的色谱峰面积对其浓度做校准曲线，根据样品中Vc的峰面积，由校准曲线计算其浓度。2. 实验部分1. 仪器试剂仪器：高效液相色谱仪：L-2010（岛津香港有限公司）；微波萃取仪（上海新仪微波化学科技有限公司）；色谱柱：依利特或Phenomenex 18柱 (250 mm4.6 mm, I.D.5 m)。试剂：乙腈（色谱纯）
5、，冰乙酸，维生素C，磷酸二氢钾等均为分析纯；西红柿、橘子、小西红柿为果蔬样品。实验用水为超纯水。 Vc标准溶液：快速准确称取0.025 g ，用1 mol/L乙酸溶液溶解，定量转移至250 mL容量瓶中，用1 mol/L乙酸溶液定容，得到100 mg/L标准溶液备用，现用现配。色谱条件：流动相：3%的乙腈-0.05 mol/L KH2PO4水溶液（ v/v） ；流速1 mL/min ；紫外检测波长265 nm；进样量10 L。2. 实验步骤（1） 按操作说明开启液相色谱仪，设定方法参数。 （2）样品准备：准确称取切碎的蔬果样品小西红柿5.0006g，西红柿5.0220g，橘子5.0024g，以
6、1 mol/L 乙酸50 mL为萃取溶剂，微波功率设为600 W ，萃取时间为10 min ，萃取温度设定为恒温50。萃取液过滤后用1 mol/L乙酸溶液定容至100 mL ，制成供试品溶液。 （3）定性分析：分别取 10 L 50 mg/L的Vc标准溶液和供试品溶液，进HPLC分析。根据保留时间定性分析蔬果中的 Vc。 （4）校准曲线绘制：分别配制5，20，50，80，100 mg/L 的Vc样品溶液，待液相色谱稳定后进样分析。以Vc 色谱峰面积对浓度作图，绘制校准曲线。 （5） 定量分析：供试品溶液经0.45 m微孔滤膜过滤后进行HPLC分析。记录其Vc的色谱峰面积，根据校准曲线计算蔬果样
7、品中 Vc的含量，结果以mg/100 g表示。 （6）实验结束后，按要求清理好仪器。3.实验结果与讨论1.标准曲线的测绘表 1.标准曲线的浓度和峰面积标准溶液/mgL -1 5 20 50 80 100峰面积 A 193244 758501 1957898 3150757 3788688图 2.标准曲线0 20 40 60 80 100 12005000001000000150000020000002500000300000035000004000000Series 1Linear (Series 1)标 准 曲 线标 准 溶 液/mgL-1峰面积由图可得，所得标准曲线方程为：峰面积 A=38
8、395x + 11668，相关系数 R2=0.999。2.各种样品提取液色谱图的绘制分别以桔子、枣子、柚子、百香果四水果的提取液为样品，色谱条件为：流动相：3%的乙腈-0.05 mol/L KH2PO4 水溶液（v/v） ；流速 1 mL/min；紫外检测波长 265 nm；进样量 10 L，得到色谱数据和色谱图，如下所示：表 2.各样品的数据记录样品 百香果 桔子 柚子 枣子 50mg/l标准溶液样品质量/g 5.1158 5.1419 5.0687 5.1174 -保留时间/min 2.884 2.810 2.821 2.828 2.807峰面积 A 51273 164571 536202
9、 4126632 1957898作不同样品的峰高 Intensity 对时间的曲线，如下图：图 3.百香果柿提取液 HPLC色谱图图 4.桔子提取液 HPLC色谱图图 5.柚子提取液 HPLC色谱图图 6.枣子提取液 HPLC色谱图3. 数据处理根据标准曲线：峰面积 A=38395x + 11668，代入各样品中维生素 C色谱峰的峰面积，求出其浓度；再根据提取液的体积（100mL）和样品质量，求出各种水果中维生素 C的含量如下表所示：样品 百香果 桔子 柚子 枣子样品质量/g 5.1158 5.1419 5.0687 5.1174峰面积 A 51273 164571 536202 412663
10、2提取液 Vc 浓度/mgL-11.031515 3.982367 13.661518 107.174476样品 Vc 含量mg/100g2.006 7.745 26.95 209.44. 讨论（1） 系统误差：从Vc 标准溶液的配制方法来看，虽然使用1mol/L 乙酸配制，但这只能抑制Vc的电离，并不能阻止其被氧化；而且使用的标准溶液并不是现配的，已经放置过夜，这更会使其中Vc被氧化，导致标准溶液实际所含的 Vc量低于标识值。这实质是一种系统误差，会导致实验结果偏高。（2） 本实验选用标准曲线法定量分析，绘出标准曲线后，在相同实验条件下测定不同样品中的含量就很方便，只需与标准曲线对照定量就行
11、了。适用于简单体系和大量样品的分析。但标准曲线法受分析色谱条件的影响很大，容易出现很大的误差，实验时要特别注意色谱条件的控制。常用的定量方法有归一法、标准曲线法、内标法和标准加入法等。水果样品的组成比较复杂，不能保证所有组分全部出峰，不宜使用归一法。虽然内标法的误差较小，但要同时测定4种水果样品中Vc 的含量，每种样品可能都要选择一种内标物，这给实验带来很大不便。（3） 由于微波具有穿透到物质内部的本领，穿透的深度一般是从几毫米到几十厘米的范围，随频率不同而异。所以除了极大的物体外，微波能做到被加热的物体里外同时加热，这就大大缩短了加热时间。微波的这种加热速度快、均匀特点使得使用微波辅助提取技
12、术时，消耗时间比传统方法明显减少了，同时成品消耗、原料、工作量、试剂量等都有显著的减少 【2】 ，故本实验使用微波辅助提取法提取水果样品中的，以提高分析速度和效率。（4）高效液相色谱具有检测灵敏度高、检测速度快、分辨率高、试样用量少等优点，适用于分离低挥发性或非挥发性、热稳定性差的物质。本实验是为了测定水果中Vc的含量，由于Vc的熔点为190192，很难挥发，又在水果中含量比较低，适宜使用液相色谱法分析。气相色谱主要适用于沸点较低、反应活性较差、热稳定性很好的物质，本实验不能选用气相色谱。参考文献：1 王征帆, 杨艳丽. 恒电流库仑分析法在水果Vc含量测定中的应用J. 安徽农业科学, 2008, 36(10) : 39413942.2干建松, 赵玉萍. 微波辅助提取技术(MAE)研究和应用进展J. 现代食品科技: 155158.3 陈六平, 邹世春. 现代化学实验与技术M. 北京: 科学出版社, 2007. 10.
