1、第十九章,生化和微生物药物分离技术,下游加工过程概论,一、下游加工过程在生物技术中的地位,下游加工过程是生物工程的一个组成部分。 生物化工产品系通过微生物发酵过程、酶反应过程或动植物细胞大量培养获得，从上述发酵液、反应液中分离、精制有关产品的过程称为下游加工过程。,生物工程的最新进展大多集中在基因工程方面，在生物反应器和发酵技术方面也有不少进展，而对下游加工过程，则没有给予应有的重视。 下游加工过程的落后会阻碍生物技术的发展，特别是有其他生产方法与其相竞争时。 在发酵产品的生产中，分离和精制过程占成本的很大部分。例如：传统发酵，分离和精制占整个投资费用的60，而对重DNA发酵、精制蛋白质的费用
2、可占整个生产费用的8090。而且还有继续加剧的趋向。,三、生物技术下游加工过程的特点,培养液是复杂的多相系统，含有细胞、代谢产物和末用完的培养基等。分散在其中的固体和胶状物质，具可压缩性，其密度又和液体相近，加上粘度很大，属非牛顿性液体，使从培养液中分离固体很困难。,1、发酵液成分复杂,2、培养液产物浓度低，但杂质含量却很高。特别是利用基因工程方法产生的蛋白质常常伴有大量性质相近的杂质。,3、从低浓度混合物中分离纯组分，需较大的能量。,由于起始浓度低，杂质多，成品要求纯度高，因此常需多步操作。目前，基因工程产品收率达到3040就已是较好。减少提取步骤是相当重要的。,一些产物遇热、极端PH、有机
3、溶剂会引起失活或分解，特别是蛋白质的生物活性与一些辅因子、金属离子的存在和分子的空间构型有关。,3、欲提取的生物物质通常很不稳定。,4、弹性要求大,发酵或培养都是分批操作、生物变异性大，各批发酵液不尽相同，这就要求下游加工有一定的弹性，特别是对染菌的批号，也要能处理。,下游加工程应遵循得四条原则：,（1）、时间短 （2）、温度低 （3）、PH适中 （4）、勤清洗消毒,四、生物技术下游加工过程的一般流程和单元操作,下游加工过程可分为4个阶段：1)、发酵液的预处理和固液分离2)、初步纯化(提取)3)、高度纯化(精制)4)、成品加工。,（一）一般工艺流程,（一）、发酵液的预处理和固液分离,预处理目的
4、：改变发酵液的性质，以利于固液分离。常用方法：1、在活性物质稳定性的范围内，通过酸化、加热、以降低发酵液的粘度。2、加入絮凝剂，使细胞或溶解的大分子聚结成较大的颗粒。,固液分离：过滤分离、离心分离,（二）、初步纯化(提取),目的：主要是浓缩，也有一些纯化作用。 方法：吸附法、离子交换法、 沉淀法溶剂萃取法、两水相萃取法、超临界流体萃取、逆胶束萃取、超过滤,A、 吸附法,应用范围：主要用于抗生素等小分子物质。原理：利用吸附剂与抗生素之间的分子引力而将抗生素吸附在吸附剂上。吸附剂种类：活性炭、白土、氧化铝、各种离子交换树脂。活性炭应用最广。活性炭的缺点：吸附性能不稳定，选择性不高，可逆性差，不能连
5、续操作，劳动强度大，影响环境卫生。,B 、 离子交换法,主要用于小分子的提取，系利用离子交换树脂和生物物质之间的化学亲和力，有选择性地将生物物质吸上去，然后以较少量的洗脱剂将它洗下来。生物物质必须是极性化合物，即能形成离子。吸附和洗脱具有选择作用，能达到浓缩和精制的目的。一般的离子交换树脂的骨架具有憎水性，与蛋白质的憎水部份有吸附作用，而使蛋白质变性失活。以天然糖类为骨架的离子交换剂，由于其骨架具有亲水性，可用求提取蛋白质，例如以纤维素为骨架的离子交换剂。,C 、 沉淀法,盐析： 最常用的盐类是硫酸铵。 加入有机溶剂： 调pH至等电点： 此法沉淀能力不强，常同时加入有机溶剂，使沉淀完全。 加入
6、非离子型聚合物： 如PEG，机理和有机溶剂相似。 加入聚电解质： 如聚丙烯酸，机理和盐析作用相似。,广泛用于蛋白质提取。主要起浓缩作用。,通常是加入一些无机、有机离子或分子，能和生物物质形成不溶解的盐或复合物，而沉淀在适宜的条件下，又很易分解。例如：四环类抗生素在碱性下能和钙、镁、钡等重金属离子或溴化十五烷吡啶形成沉淀，发酵单位越高，沉淀法越有利，因残留在溶液中的浓度是一定的，故发酵单位越高、收率就越高。,沉淀法也用于小分子物质的提取中，但具有不同的机理。,D、溶剂萃取法,应用范围：一般用于抗生素等小分子生物物质的提取。 基本原理： 抗生素以不同的化学状态(游离态或成盐)存在时，在水及与水不互
7、溶的溶剂中有不同的溶解度。当进行转移时，杂质不能或较少地随着转移，因而能达到浓缩和提纯的目的。有时，一次转移并不能将杂质充分除去，可采用二次萃取。 举例：青霉素在酸性下成游离酸状态，在醋酸丁酯中溶解度大，能从水转移到醋酸丁酯中：在中性下，成盐状态，在水中溶解度大，能从醋酸丁酯转移到水中。,溶剂萃取法常遇到困难是分配系数较低，一种解决的方法是利用反应萃取法，即利用一种溶剂(通常是有机磷化合物或脂肪胺)，能按一定化学计量关系与生物物质形成特异性的溶剂化健或离子对复合物。,E 两水相萃取法,适用范围：仅适用于蛋白质的提取，小分子物质不适用。基本原理：由于聚合物分子的不相容性，两种聚合物的水溶液（含盐
8、或不合盐)可以分成两相，蛋白质分子可在两相间进行分配。举例：聚乙二醇PEG与葡聚糖的水溶液。一种聚合物（如PEG）和一种盐（如磷酸盐）也能形成两相。影响分配系数的因素：聚合物的种类和浓度、聚合物的分子量，离子的种类，离子强度，PH和温度等，而且这些因素相互有影响。,F 超临界流体萃取,临界点：一般物质，在常压下平衡时，汽液两相的物理性质（如粘度、密度等）相差很显著。在较高压力下，这种差别逐渐缩小，当达到其一温度与压力时，两相差别消失，合并成一相，这时称为临界点，其温度和压力分别称为临界温度和临界压力。 超临界流体：当温度和压力略超过或靠近临界点时，其性质介于液体和气体之间，称为超临界流体。,超
9、临界流体萃取原理：超临界流体的密度和液体相近，粘度和气体接近，溶质在其中的扩散速度可为液体的100倍，这是超临界流体的萃取能力和速度，优于一般溶剂的原因。而且流体的密度越大，萃取能力也越大，变化温度和压力可改变萃取能力，使对某物质具有选择性。二氧化碳：常用作为萃取剂，因其临界压力较低，（31.1C，7.3 Mpa）操作安全，无毒，适用于非极性物质，对极性物质萃取能力差，但可加入极性的辅助溶剂（夹带剂entrainer)来补救。本法还具有节约能量等优点，已开始应用在食品工业和生物工程中。已用于咖啡脱咖啡因，啤酒花脱气味等。,原理：超滤法是利用一定截断分子量的超滤膜进行溶质的分离或浓缩。小于截断值
10、的分子能通过膜，而大于截断值的分子不能通过膜，因而达到分离。应用范围：适用于超滤的物质，分子量在5001000000之间，或分子大小近似地在(1l0 nm)之间。在小分子物质的提取中，超滤主要用于去除大分子杂质。在大分子物质的提取中，超滤主要用于脱盐、浓缩。主要缺点：浓差极化和膜的污染，膜的寿命较短和通量低，很难用于处理量大的工业中。但这些缺点正在克服，有很好的发展前景。,G、 超滤法,（三）、高度纯化(精制),经初步纯化后，体积大大缩小，但纯度提高不多，需要进一步精制。精制的方法很多，初步纯化中的某些操作，如沉淀、超滤等也可应用于精制中。大分子(蛋白质)和小分子物质的精制方法有类似之处，但侧
11、重点有所不同，大分子物质的精制依赖于色层分离，而小分子物质的精制常常利用结晶操作。,色层分离是一种高效的分离技术，过去仅用于实验室中，最近10年来规模逐渐扩大而应用于工业上。原理：操作是在柱中进行，包含两个相固定相和移动相，物质在两相间分配情况不同，在柱中的运动速度也不同而获得分离。,A 色层分离,结晶的先决条件是溶液达到过饱和。方法：加入某些物质，使溶解平衡发生改变，例如调pH；将溶液冷却或将溶剂蒸发：正确控制温度、溶剂的加入量和加料速度可以控制晶体的生长，以有利于结晶的选择性和利用分离。适用范围：主要用于低分子量物质的纯化。举例：例如抗生素。青霉素G系用醋酸丁酯从发酵液中萃取出来，然后加入
12、醋酸钾的酒精溶液以产生沉淀。柠檬酸在工业上用冷却的方法进行结晶。,B 结晶,（六）、成品加工,根据产品应用时的要求，一般经提取和精制后，最后还需要一些加工步骤。例如浓缩、无菌过滤和去热原、干燥、加入稳定刑等。如果最后要求的是结晶性产品，则浓缩、无菌过滤和去热原等步骤系放在结晶之前，但干燥常常是最后一道工序。,A、 浓缩,浓缩可以采用升膜或降膜式的薄膜蒸发(停留时间为l min左右)。对热敏性物质可采用离心薄膜蒸发器(停留时间为1一l0s)，而且可处理粘度较大的物料。最近发展起来的膜技术，也可应用于浓缩，对大分子溶液的浓缩可以用超滤膜，对小分子溶液的浓缩可用反渗透膜。应用膜技术的优点是能耗低，成
13、本较低。,热原：是脂多糖类物质，从细菌的细胞壁产生，注入体内会使体温升高。传统去热原方法：蒸馏或石棉板过滤，但前者只能用于产品能蒸发或冷凝的场合，后者对劳动保护和产品质量都有一定问题。当产品分子量在1000以下，用截断分子量为10000的超滤膜除去热原是很有效的，同时也达到了无菌要求。,B、 无菌过滤和去热原,C、干燥,真空干燥：效率不高，需要时间较长。红外线干燥：虽然装置简单，但温度较高。气流干燥和沸腾干燥：效率较高，但物料所处温度也较高。喷雾干燥：虽然温度也较高，但干燥速度快，干燥时间一般只需几秒钟，在干燥器中停留时间小于1分钟。冷冰干燥：温度低，不会使物料失活，最安全，但处理量小，操作时
14、间较长(一般不会低于8h)，且装置复杂、费用昂贵。,五、生物技术下游加工过程的发展趋向,(1)、基础理论研究研究非理想溶液中溶质与添加物料之间的选择性反应机理以及系统外各物理因子对选择性的影响效应，从而研制高选择性的分离剂，改善对溶质的选择性。,(2)、完善、研究、开发新型和经济高效的下游加工技术、正确对待“新”、“老”分离技术，努力推进多种分离、纯化技术的结合。,要积极推广应用新技术：,1、膜技术的推广使用 2、亲和技术的推广使用 3、优质层析介质的研究,当前下游加工过程发展的一个主要倾向是:,多种分离、纯化技术相结合.也包括新、老技术的相互交叉、渗透与融合形成所谓融合技术(子代技术).,、生物技术下游工程与上游工程相结合。生物工程作为一个整体，上、中、下游要互相配合。上游方面要注意为下游提取方便创造条件。,
