1、透明质酸的分离纯化摘要：1934 年美国哥伦比亚大学眼科教授 Meyer 等首先从牛眼玻璃体中分离出该物质。透明质酸以其独特的分子结构和理化性质在机体内显示出多种重要的生理功能，如润滑关节，调节血管壁的通透性，调节蛋白质，水电解质扩散及运转，促进创伤愈合等。尤为重要的是，透明质酸具有特殊的保水作用，是目前发现的自然界中保湿性最好的物质，被称为理想的天然保湿因子，对于其的利用越来越多，为此通过改善其提取纯化方法成为众多微生物科学家研究的课题方向。关键字：透明质酸，分离提取，纯化1透明质酸介绍透明质酸是一种酸性粘多糖，是一种高分子的聚合物。白色絮状或无定形固体，无臭无味，具有吸湿性。溶于水不溶于有
2、机溶剂。是由单位 D-葡萄糖醛酸及 N-乙酰葡糖胺组成的高级多糖。D-葡萄糖醛酸及 N-乙酰葡糖胺之间由 -1,3-配糖键相连，双糖单位之间由 -1,4-配糖键相连。分子量具有不均一性，一般平均为 5002000kD，结构式为广泛存在于人或动物的各种组织中，已从结缔组织、脐带、皮肤动脉等材料中分离得到，在哺乳动物体内，以玻璃体、脐带和关节滑液含量最高。透明质酸是一种多功能基质，透明质酸 HA 广泛分布于人体各部位。其中皮肤也含有大量的透明质酸。人类皮肤成熟和老化过程也随着透明质酸的含量和新陈代谢而变化，它可以改善皮肤营养代谢，使皮肤柔嫩、光滑、去皱、增加弹性、防止衰老，在保湿的同时又是良好的透
3、皮吸收促进剂。与其他营养成分配合使用，可以起到促进营养吸收的更理想效果。具有特殊生理功能和作用，如润滑作用、保水作用等，临床上作为黏弹剂用作眼科手术辅助剂，作为润滑剂用于治疗关节病，还用于促进创伤愈合,用作化妆品中的保湿剂等。2.透明质酸种类透明质酸的生产过程和技术决定了质量优劣的差异,所以在使用上一定要是正确来源生产的产品才能有治疗的功效.一般而言,提炼的方法有三种:1、动物组织:主要原料是鸡冠和牛眼玻璃体等.用丙酮或乙醇将原料脱脂、脱水,用蒸馏水浸泡、过滤,然后以氯化钠水溶液和氯仿溶液处理,之后加入胰蛋白酶保温后得到混合液,最后用离子交换剂进行处理、纯化得到精制的透明质酸.这种方法提取率极
4、低,仅 1%左右,分离过程复杂,致使透明质酸价格昂贵,达 5000美元/公斤,限制了在化妆品中大的量使用.2、微生物发酵:以葡萄糖作为碳源发酵液.在培养基中发酵 48 小时,发酵结束后,过滤除去菌丝体和杂质,然后用醇沉淀法等简单操作即得到高纯度的产物.采用发酵法制造的透明质酸,优点是能按商品设计来设定分子量大小.发酵法的关键在于菌种的选择,多选用链球菌、乳酸球菌类等.3、化学合成:采用天然酶聚合反应;首先使用多糖类聚合物合成“透明质酸氧氮杂环戊烯衍生物”,然后添加水分解酶,制造出衍生物和酶的复合体,最后在90 度摄氏反应液中清除其中的酶,就合成了透明质酸.采用人工合成法可大大降低透明质酸的制造
5、成本,但结构较不精纯.同样是透明质酸的产品,因为原料来源及制成技术的差别,对效果有明显的影响.产品的浓度不能作为选择产品的参考,纯度、分子量、3D 立体结构才会直接影响透明质酸的吸水效果.通常分子量愈大、网状结构愈完整,有最好的吸水效果.坊间保养品、化妆品盛行,但许多业者自制的透明质酸,便宜,可是不一定有效果.甚至有人推行的口服的透明质酸,经过肠胃吸收之后会分解成醣类及氨基酸的小单位分子,还是必须透过自体合成等复霒步骤才能生成在皮肤、结镳组织中,其效果也必须要打折扣.3.透明质酸功能透明质酸的主要功能有如下三点：1、改善关节功能2、天然的保湿润滑剂3、防止动脉硬化、脉搏紊乱和脑萎缩等病症的发生
6、。透明质酸本身带有负电荷，在动物体存在于大部分的软结缔组织。它的水溶液为粘弹性流体，填充在细胞与胶原纤维空间之中且覆盖在某些表皮组织上。在动物体，其主要功能乃保护及润滑细胞，调节细胞在此粘弹性基质上的移动，稳定胶原网状结构及保护它免于受到机械性的破坏。因为透明质酸为天然性润滑以及吸震高分子，在肌腱、肌腱鞘及粘滑膜表面作为润滑剂。 透明质酸 HA广泛分布于人体的结缔组织中，在牛眼玻璃体、关节腔中几乎以纯态形式存在。存在于皮肤中的透明质酸 HA，对人体表皮的新陈代谢起到重要的作用。人体中透明质酸）HA 的破坏或失调，均可造成疾病。皮肤中透明质酸 HA 含量的减少及破坏，可造成皮肤失水中，起皱而失去
7、弹性，使人表皮衰老，因而，透明质酸 HA 又被称为抗衰老因子。透明质酸 HA 是人皮肤表皮及真皮的主要基质成分之一，其生理功能是能使水分进入细胞间隙，并与蛋白质结合而形成蛋白凝胶，将细胞粘在一起，发挥正常的细胞代谢作用，起到保持细胞水分，保护细胞不受病原菌的侵害，加快恢复皮肤组织，提高创口愈合再生能力，减少疤痕，增强免疫力等作用。同时，透明质酸是增殖细胞和迁移细胞胞外基质的主要成分，尤其在胚胎组织中是如此。因为透明质酸的自身的特性，能使细胞保持彼此分离，使细胞易于运动迁移和增殖并阻止细胞分化。在发育过程中，透明质酸的作用似乎是防止细胞在增殖够数或迁移到位之前过早进行分化。 在医药方面，透明质酸
8、 HA 用于非甾体消炎药，关节炎治疗，眼科，心外科手术的辅助药品，在治疗烫伤、烧伤、冻伤、人造皮肤等方面，有着独到的作用。4.透明质酸制备流程：从不同原料制备透明质酸，其分离纯化方法不同，本例发酵法制备透明质酸发酵液 预处理 分离 纯化 干燥 纯品 4.1 摇瓶种子液的培养取斜面菌种（HF-1191 链球菌） ，接种于装有灭菌培养液 400ml 的 1L 锥形瓶中，37培养 1216h，光镜观察菌体生长良好，无杂菌污染，即可接种于种子罐中。4.2 种子罐种子液的培养按摇瓶种子液的配方配制培养液 100L，加入种子罐中，通蒸汽加热，115灭菌 30min。冷却至 37，用火焰接种法，将摇瓶种子液
9、接种于种子罐中，通气量 50L/min，搅拌转速 120r/min，37培养 1216h。光镜观察具体生长良好，无杂菌污染，即可待接种于发酵罐中。4.3 发酵按摇瓶种子液配方，将葡萄糖含量提高到 5%，配制发酵培养液 1000L加入发酵罐中，通入蒸汽加热，115灭菌 30min。冷却至 37后，将种子罐中的种子液通过移种管道移至发酵罐中，维持通气量 500600L/min，搅拌转速 120r/min，37发酵 4046h。在发酵过程中，发酵液的 pH 不断下降，加 5mol/L 氢氧化钠溶液（浸取），调 pH6.57.0。发酵后期，葡萄糖浓度下降至 0.5 以下，pH 下降很慢或不再下降时，即
10、为发酵终点。4.4 预处理预处理是在分离纯化前对发酵液进行灭酶、灭菌、除菌的工艺。对于一些非透明质酸缺陷型菌株发酵所得的发酵液，通过预处理可以杀灭透明质酸酶，减少 HA 分子量的降低。史鹏等（14）采用两种预处理方式为发酵液在70 度下保温 1 小时，静置 5h；酸处理方式为发酵液用三氯乙酸调 pH 至4.5，1h 后回调至 6.0，静置 5h，两种预处理方式的蛋白去除率、HA 得率很接近，但酸处理的分子量降低率要低于热处理，表明酸处理能更有效的抑制透明质酸酶的活性。4.5 分离板框过滤除菌体，滤液用稀氢氧化钠调 pH6.06.5，加三倍体积 95%乙醇，沉淀出透明质酸。4.6 纯化4.6.1
11、 形成 HA 复合物沉淀沉淀用与发酵液等体积的 0.1mol/L 氯化钠水溶液溶解，在搅拌下，加入过量的 1%氯化十六烷基吡啶水溶液与滤液中的透明质酸发生结合沉淀，形成 HA-CPB 沉淀，4.6.2 解离静置使沉淀下沉，虹吸出母液，加入 0.1mol/L 氯化钠液洗涤沉淀两次。沉淀置于发酵液等体积的 0.4mol/L 氯化钠液中搅拌解离过夜，4.6.3 吸附解离后的溶液经冷冻抽虑除去绝大部分 CPB 后，加入处理好的漂白土吸附，以脱去溶液颜色及除去残留的蛋白核酸、CPB 等杂质4.6.4 沉淀经上述处理后的清夜用氢氧化钠调 pH 至一定值，加三倍体积 95%乙醇沉淀，立即产生大量絮状沉淀。沉
12、淀基本完全后，用盐酸调到中性，再静置一段时间，待上液清后，虹吸出上液，收集沉淀。4.7 干燥沉淀用乙醇和丙酮脱水，真空干燥器干燥，得纯透明质酸。5.存在的问题从发酵液中分离纯化的 HA 往往是由多种分离纯化方法联合完成的，单一分离纯化方法并不能达到很高的纯化程度，并且每种分离纯化方法也都存在一定的局限性。利用氯仿除菌的方法，菌体沉淀中夹带较多的 HA。HA 回收率低，并且氯仿具有毒性。酶解纯化法有利于提高 HA 纯度，但同时也将新的蛋白质引入。因此，只有根据制备目标选择适宜的分离纯化方法，并对工艺过程进行优化，才能获得高纯度、分子量的 HA。参考文献1.史鹏，蔡海波，杨利，等发酵液预处理方法对
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