1、 甲醛降解论文：甲醛降解菌筛选、关键酶基因克隆表达和固定化细胞降解特性的研究【中文摘要】甲醛作为一种原生毒素,对生物体有很强的毒害作用,是室内空气污染的主要污染物之一。如何有效的控制空气中的甲醛污染,已引起人们的高度关注。通过生物法降解甲醛将成为去除甲醛的有利手段。本文旨在筛选甲醛降解菌,对甲醛代谢的关键酶进行克隆分析,并对固定化细胞的降解条件进行研究,为构建高耐受高效率降解甲醛的工程菌和生物法去除室内甲醛污染的应用奠定基础。利用以甲醛为唯一碳源的基本培养基,分离得到了一株甲醛降解新菌株,经形态学观察、生理生化特性鉴定及 16S rDNA 的同源性分析,初步鉴定该菌株属于甲基杆菌属(Methy
2、lobacterium),命名为Methylobacterium sp. XJLW。该菌株在初始驯化阶段,甲醛耐受浓度为 0.1g/L,且在液体培养基中生长缓慢。实验室已经分离得到的一株甲醛降解菌株 Pseudomonas putida xyz-zjut,该菌株的甲醛最高耐受浓度为 6g/L,降解效率高达 0.114g/Lh。经比较,选取实验室已经分离的高活性高耐受甲醛菌株 Pseudomonas putida xyz-zjut 作为甲醛关键酶基因的研究对象。根据 NCBI 中公布的Pseudomonas putida 基因序列,设计了两对特异性引物,克隆了甲醛同化作用关键酶丝氨酸羟甲基酶(S
3、HMT)和甲醛异化作用关键酶甲醛脱氢酶(FDH)的基因。丝氨酸羟甲基酶基因大小为 1254 bp,能编码 417 个氨基酸,甲醛脱氢酶基因全长 1206 bp,编码 401 个氨基酸,与已报道的 Pseudomonas putida F1 及 Pseudomonas putida KT2440 具有较高的同源性。将甲醛脱氢酶基因连接至原核表达质粒pET-28b 中,通过 PCR,酶切鉴定及 SDS-PAGE 表明 fdh 基因成功克隆至载体 pET-28b 上,构建好的 pET-28b-fdh 在宿主 E. coli BL21(DE3)成功获得了表达, SDS-PAGE 中的目标蛋白质大小为
4、43 kDa,与预期一致。但在检测工程菌降解甲醛的情况时发现甲醛降解效率没有明显的提高,推测原因可能是甲醛脱氢酶虽然表达了,但是大部分蛋白在宿主中是以包涵体形式存在,使得蛋白不具有甲醛脱氢酶活性。以海藻酸钙为包埋载体固定 Pseudomonas putida xyz-zjut 降解甲醛取得较好的效果。固定化细胞降解甲醛的海藻酸钙颗粒中的最适细胞密度为 1.0108 cells/mL,在温度 30,培养基为MgSO47H2O 0.2 g/L,(NH4)2SO4 2.4 g/L,微量元素母液 0.1 mL,pH 值 9 的条件下,甲醛的降解效率高达 0.107 g/Lh,高于国内外同类研究水平。该
5、固定化细胞颗粒可应用于降解甲醛的反应器中,为生物法降解甲醛奠定基础。【英文摘要】As a native toxin, formaldehyde has strong toxic effect on the organism and is one of the main pollutants of indoor air pollution. How to control formaldehyde pollution in the air has caused great concern, and degradation of formaldehyde by microorganism will
6、be an effective way for the removal of formaldehyde.The aim of the research was to isolate a strain which can metabolize formaldehyde, then investigate the key enzymes in degradation of formaldehyde and the characteristics of immobilized cells by gel beads. The research provided a basic study for co
7、nstructing a high tolerance and efficient engineering bacteria for formaldehyde degradation and the application for biological treatment technology about the indoor formaldehyde pollution.One bacterial strain which was capable to use formaldehyde as a sole carbon source was isolated from soil. Based
8、 on morphological, physiological, biochemical properties and 16S rDNA homology analysis, the strain was characterized as Methylobacterium and named as Methylobacterium sp. XJLW. The concentration of formaldehyde-tolerant by the strain was 0.1g/L in the initial acclimation period, and the strain grow
9、n slowly in liquid medium. The concentration of formaldehyde-tolerant of Pseudomonas putida xyz-zjut which was as isolated by our laboratory up to 6 g/L, and the degradation rate of formaldehyde was up to 0.114 g/Lh.This article has selected Pseudomonas putida xyz-zjut as the strain to study the key
10、 enzymes in degradation of formaldehyde, which was isolated by our laboratory and also proved to effectively degrade formaldehyde. Two pairs of specific primers was designed to amplify serine hydroxymethyltransferase （SHMT） and formaldehyde dehydrogenase （FDH） genes from Pseudomonas putida xyz-zjut,
11、 according to the genome of the strain from GenBank. The result showed serine hydroxymethyltransferase gene obtained from Pseudomonas putida xyz-zjut was 1254 bp in size and encoded 417 amino acids, and formaldehyde dehydrogenase gene was 1206 bp in size and encoded 401 amino acds. The DNA fragments
12、 had high homology with the key enzyme genes form Pseudomonas putida F1 and Pseudomonas putida KT2440. The engineering strain E. coli BL21（DE3）with recombinant vector pET-28b-fdh was obtained by introducing formaldehyde dehydrogenase gene into the expression vector pET-28b. The results from PCR, res
13、triction enzyme digestion and SDS-PAGE analysis revealed that the recombinant expression vector pET-28b-fdh had been constructed and expressed in the host of E. coli BL21（DE3） successfully. Unfortunately, the efficiency of formaldehyde degradation of engineering strain was improved insignificantly.
14、It was speculated that the target protein present in the inclusion body in the host, and does not have the activity of formaldehyde dehydrogenase.Using alginate as immobilized supporter, the immobilized cells of Pseudomonas putida xyz-zjut could degrade formaldehyde effectively. The optimum conditio
15、ns that the immobilized cells metabolize formaldehyde was: 1.0 108 cells/mL, MgSO47H2O 0.2 g/L,（NH4）2SO4 2.4g/L,trace elements 0.1 mL/L, temperature 30, adjust pH to 9. Under these conditions, the effect of formaldehyde degradation was 0.107 g/Lh. The immobilized cells could applied to degradation o
16、f formaldehyde in bioreactor, and lay a foundation for the further research of application of biological formaldehyde degradation.【关键词】甲醛降解 甲醛脱氢酶 丝氨酸羟甲基转移酶 固定化细胞 Methylobacterium sp. XJLW Pseudomonas putida xyz-zjut【备注】索购全文在线加好友 ：1.3.9.9.3.8848 同时提供论文写作一对一指导和论文发表委托服务【英文关键词】formaldehyde degradation f
17、ormaldehyde dehydrogenase serine hydroxymethyltransferase immobilized cells Methylobacterium sp. XJLW Pseudomonas putida xyz-zjut【目录】甲醛降解菌筛选、关键酶基因克隆表达和固定化细胞降解特性的研究 摘要 3-5 ABSTRACT 5-7 第一章 文献综述 12-29 1.1 室内甲醛污染的来源 12-14 1.2 甲醛的污染治理方法 14-17 1.2.1通风换气式法 14 1.2.2 控制温湿度法 14 1.2.3 物理吸附法 14-15 1.2.4 化学法 15
18、-16 1.2.4.1 化学反应法 15 1.2.4.2 臭氧氧化法 15 1.2.4.3 空气负离子技术 15-16 1.2.4.4 光催化法 16 1.2.4.5 常温催化氧化法 16 1.2.5 生物法 16-17 1.2.5.1 植物吸收法 16-17 1.2.5.2 微生物降解法 17 1.3 甲醛在微生物中的代谢途径 17-22 1.3.1 甲醛代谢的同化途径 18-20 1.3.1.1 丝氨酸循环 18-19 1.3.1.2 核酮糖单磷酸途径（RuMP）途径 19-20 1.3.2 甲醛代谢的异化途径 20-22 1.3.2.1 谷胱甘肽（GSH）依赖型异化途径 20-21 1.
19、3.2.2 叶酸-依赖型异化途径 21-22 1.3.2.3 甲醛环化氧化途径 22 1.4 国内外研究现状 22-23 1.5 本文研究的意义及内容 23-24 参考文献 24-29 第二章 甲醛降解新菌株的分离纯化及鉴定 29-44 2.1 引言 29-30 2.2 材料 30-32 2.2.1 甲醛降解菌样品的采集 30 2.2.2 培养基及试剂 30-31 2.2.2.1 培养基 30-31 2.2.2.2 试剂 31 2.2.3 药品与试剂 31-32 2.2.4 仪器 32 2.3 方法 32-37 2.3.1 分光光度法测定甲醛浓度 32-33 2.3.2 样品甲醛浓度的测定 3
20、3 2.3.3 菌株的筛选及分离纯化 33 2.3.4 菌株的鉴定 33-37 2.3.4.1 革兰氏染色 33-34 2.3.4.2 透射电镜观察 34 2.3.4.3 生理生化特征 34-35 2.3.4.4 分子生物学鉴定 35-37 2.4 结果与分析 37-41 2.4.1 菌株的筛选及分离纯化 37 2.4.2 菌株的鉴定 37-41 2.4.2.1 革兰氏染色 37-38 2.4.2.2 透射电镜观察 38 2.4.2.3 生理生化特征 38-39 2.4.2.4 分子生物学鉴定 39-41 2.5 小结 41 参考文献 41-44 第三章 Pseudomonas putida
21、xyz-zjut 甲醛降解关键酶基因的克隆和表达 44-66 3.1 引言 44-45 3.2 材料 45-48 3.2.1 菌株和质粒 45 3.2.2 主要试剂 45-46 3.2.3 实验仪器 46-47 3.2.4 PCR 引物 47 3.2.5 主要培养基及试剂 47-48 3.3 方法 48-53 3.3.1 菌株 xyz 菌基因组 DNA 的提取 48-49 3.3.2 PCR 扩增丝氨酸羟甲基转移酶（SHMT）和甲醛脱氢酶（FDH）的基因 49 3.3.3 凝胶回收纯化 DNA 49-50 3.3.4 连接反应 50 3.3.5 大肠杆菌感受态细胞的制备 50-51 3.3.6
22、 转化大肠杆菌感受态细胞 51 3.3.7 试剂盒快速小量提取质粒 DNA 51-52 3.3.8 酶切反应 52 3.3.9 蛋白电泳检测重组蛋白的表达 52-53 3.4 结果与分析 53-64 3.4.1 丝氨酸羟甲基转移酶的克隆 53-57 3.4.2 甲醛脱氢酶的克隆与表达 57-64 3.4.2.1 甲醛脱氢酶基因片段的获得 57-62 3.4.2.2 pET28b-fdh 重组质粒的构建 62-63 3.4.2.3 重组蛋白在 E. coli BL21 中的蛋白表达分析 63-64 3.5 小结 64-65 参考文献 65-66 第四章 固定化 Pseudomonas putid
23、a xyz-zjut 降解甲醛的研究 66-79 4.1 引言 66-67 4.2 材料 67-69 4.2.1 实验菌种 67 4.2.2 培养基及试剂 67 4.2.3 药品与试剂 67-68 4.2.4 仪器 68-69 4.3 方法 69-71 4.3.1 样品甲醛浓度的测定 69 4.3.2 菌种的预培养及活化 69 4.3.3 固定化颗粒的制备 69 4.3.4 菌体固定化后的甲醛降解效果 69-70 4.3.5 不同培养基对固定化颗粒降解甲醛的影响 70 4.3.5.1 蛋白胨水培养基与生理盐水对固定化颗粒降解甲醛的效果比较 70 4.3.5.2 无机盐培养基与生理盐水对固定化颗
24、粒降解甲醛的效果比较 70 4.3.6 固定化菌株在不同菌浓下的甲醛降解效果 70-71 4.3.7 固定化菌株在不同温度下的甲醛降解效果 71 4.3.8 固定化菌株在不同 pH 的甲醛降解效果 71 4.4 结果与分析 71-77 4.4.1 菌体固定化后对甲醛的降解效果 71-72 4.4.2 不同培养基对固定化细胞降解甲醛的影响 72-74 4.4.2.1 蛋白胨水培养基与生理盐水对固定化颗粒降解甲醛的效果比较 72-73 4.4.2.2 无机盐培养基与生理盐水对固定化颗粒降解甲醛的效果比较 73-74 4.4.3 固定化菌株在不同菌浓下的甲醛降解效果 74-75 4.4.4 固定化菌株在不同温度下的甲醛降解效果 75-76 4.4.5 固定化菌株在不同 pH 下的甲醛降解效果 76-77 4.5 小结 77 参考文献 77-79 第五章 实验总结与展望 79-81 致谢 81-82 攻读学位期间发表的学术论文和专利目录 82
