1、分子能级与荧光,2. 荧光（Fluorescence)：当处于基态的分子吸收光能后进入激发态，并且立即返回基态并以光的形式释放能量，这种光称为荧光。,4. 激发(Excitation, Ex)和发射(Emission, Em)光谱（Spectra):,1. 能级（ Energy Level）：原子的可能状态是不连续的，因此各状态对应能量也是不连续的。包含电子能级、振动能级和转动。,3. 磷光（Phosphorescence）:分子从激发三线态返回基态以光的形式释放能量。,CFP,Ex. 440nm,Ex. 470nm,Em. 470nm,YFP,Em. 535nm,荧光共振能量转移(FRET)
2、现象,3. FRET现象的特征: 选择性激发供体,却能检测到受体发射的荧光,FRET 原理(Principle),FRET的条件,发生FRET需要三个条件：,1、供体分子的发射光谱和受体分子的吸收光谱必须有显著的重迭，一般大于 30；,2、供体分子和受体分子间的距离必须在 1 10 nm 之间. D和A间的FRET 效率：,3、供体分子的发射态偶极矩与受体分子的吸收态偶极矩、以及它们的向量必须满足一定的条件,R0: E=50%时供体和受体分子间的距离.对于特定的供体受体对是常数;,R: 供体和受体分子间的距离.,E: FRET效率. 对于R特别灵敏.,举例:假设 R0=5nm, 1） R=10
3、nm, E=1.5%,2） R=5nm, E=50%,3） R=6nm, E=25%,1)蛋白分子的共定位; 2)蛋白分子聚合体; 3)转录机制; 4)转换途径; 5)分子运动; 6)蛋白折叠等生物学问题.,FRET的应用,通过 FRET 技术可以获得有关两个蛋白分子之间相互作用的空间信息。常用于解决如下问题:,FRET技术应用一:检测两个发光分子间的重合与共定位,荧光标记 利用FRET技术检测不发光分子间相互作用的策略,FRET技术应用二: 检测分子间的相互作用,FRET技术应用三: 检测分子的折叠与构象变化,FRET技术应用举例：细胞内钙离子浓度的实时测量,Miyawaki A, et a
4、l., Nature 1997, 388:882-887,(b),BFP-GFP BFP-YFP CFP-YFP CFP-dsRED GFP-dsRED,在FRET实验中经常使用的 供体-受体荧光分子对,2. 绿色荧光蛋白类(Green Fluorescent Proteins, GFPs),1.染料类(Dye),FITC-Rhodamine Alexa488-Cy3 Cy3-Cy5,参考阅读文献,Jonathan D. Violin,et al., A genetically encoded fluorescent reporter reveals oscillatory phosphory
5、lation by protein kinase C. J Cell Biology, 2003,161:899909 Elizabeth A J et l., FRET Imaging. Nature Biotechnology, 2003,21:13887-1395 Rajesh B S. Fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy imaging of live cell protein localizations. J Cell Biology, 2003, 160: 629633 Jin Zhang, et al.
6、,. Genetically encoded reporters of protein kinase A activity reveal impact of substrate tethering. PNAS ,2001, 98: 1499715002 Michael G. Erickson, et al., DsRed as a Potential FRET Partner with CFP and GFP. Biophysical Journal , 2003,85:599611Alexander Sorkin, et al., Interaction of EGF receptor and Grb2 in living cells visualized by fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy. Current Biology 2000, 10:13951398,思 考 题,2.你认为FRET技术特别适合什么领域?举例说明。,1. 为什么FRET效率对供体受体分子间的空间距离非常灵敏?,3. A和B分子都不能发射荧光,要求采用FRET技术检测二者之间的相互作用特征,请问应该如何处理?,论文题目： 供体受体对之间R0定量分析与计算,
