1、【摘要】 目的：探讨心肌注射骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells ，M SCs ）联合应用纤维蛋白封闭剂（FibrinSealant，FS ） ，对细胞滞留量的影响。方法：（ 1 ）提取、分离、培养、扩增小型猪骨髓 M SCs 备用；（2 ） 小型猪随机分为 2 组，成功建立急性心肌梗塞模型，然后分为单纯 M SCs 移植组和 M SCs 联合纤维蛋白封闭剂移植组，对比移植 6 周后细胞的滞留量及新生血管的密度，超声学评价心脏功能。结果：6 周后 M SCs +FS 组荧光标记的 M SCs 数量、新生血管密度均较 M SCs 组显著增多（ P 0101 ） ，M S
2、Cs +FS 组左室短轴缩短率（FS %） 、心肌射血分数（ EF %）较 M SCs 组显著提高（P 0105 ， 0101 ） 。结论：经心外膜心肌注射 M SCs 联合纤维蛋白封闭剂较单纯心肌注射 M SCs 能够明显提高移植细胞的滞留存活数量，增加新生血管密度，改善心肌收缩功能。 【关键词】 心肌梗塞；干细胞移植；心室功能Experimental studies of intramyocardial injecting bone marrow mesenchymal stem cells combined with fibrin sealant in cells transplanta
3、tionZ H A O Jian ， W A N G Ying ， W A N G Guang2li，C H E Hui，K O N G Xiang2rong ，LIU Xiao2chengChinese Journal of Cardiovascular Rehabilitation M edicine ，2007 ，16 （4 ）：321Abstract：Objective ：To investigate the effects ofintramyocardialinjecting bone marrow mesenchy mal stem cells com2 bined with fi
4、brin sealant in cells transplantation .M ethods ：（1 ）Prepared for isolation ，purification ，culture ，expan2 sion of bone marrow M SCs1 （2 ）Mini2swine were randomly assigned to establish models of acute myocardialinfarction and then were performed by the subsequent procedure ：intramyocardial M SCs inj
5、ection alone（Group M SCs ）and in2 tramyocardial M SCs injection com bined with FS （Group M SCs +FS ）.Six weeks postoperatively ，quantitative analysis of fluorescent2labeled cells was performed by Image Pro Plus 415 software .Likewisely ，neovascularization by histo2 chemically staining was analyzed a
6、s well.Cardiac function was assessed by echocardiorgaphy .Results ：Six weeks postoperatively ，both the retention nu m ber of positively labeled cells and new vessels density in Group M SCs +FS showed significant increase com pared with those in Group M SCs （P 0101 ）.M yocardial function of EF % and
7、FS % in Group M SCs +FS markedly im proved co m pared with that in Group M SCs （ P 0105 ， 0101 ）.Conclusion ：In2 tramyocardialinjecting bone marrow M CSs co m bined with fibrin sealant can increase the retention oftransplanted cells ，pro mote neovascularization formation and enhance myocardial systo
8、lic function .Authors address ：Department of Cardiovascular Surgery ，T E D A International Cardiovascular H ospital，C A M S and P U M C ，Tianjin ，300457 ，ChinaKey words ：M yocardialinfarction ；Transplantation ，stem cell；Ventricular function20 世纪 80 年代兴起的搭桥、冠脉介入术挽救了大量冠心病患者的生命，然而 10 年生存期后，桥血管或者血管内支架再狭
9、窄的问题又困扰着人们。上述患者的 12 %1 由于冠脉血管弥漫性病变或缺乏桥血管而单纯借助 C A B G 和 PCI 方式已难以达到完全血运重建。当前，作为 C A B G 术中辅助治疗方式骨髓间充质干细胞心肌点状注射疗法，正尝试从细胞水平重建侧支微循环，改善血流灌注。本研究探讨心肌注射骨髓间充质干细胞（M SCs ） ，联合应用纤维蛋白封闭剂（ FS ）对细胞滞留量的影响。1 资料与方法1.1 骨髓 M SCs 的分离、培养、扩增及标记中国实验用小型猪（购自北京琉璃科兴实验动物养殖中心） ，雌雄不拘，体重 15 ， 18kg 。无菌条件下 18 号骨髓穿刺针接 20 ml 注射器，内含肝素
10、 6 000 U 。于髂后上棘多点抽取骨髓液共约 25 ml，以等体积生理盐水稀释，Percoll（ 11073gcm 3 ）密度梯度离心法分离单个核细胞。1 500 rmin 离心 20 min ，取白膜层细胞，以生理盐水洗涤，1 200 rmin 离心 10 min 。随后以 210 105 个cm 2 密度接种于培养瓶中。在 5 %C O 2 、37 饱和湿度的孵箱内培养。培养液的成分为：40 % M C D B 201 培养基、50 % D M E M F12 、2 %胎牛血清、100 Uml 的青霉素和链霉素。第 3 d 去除悬浮细胞，而贴壁细胞继续培养至 10 d 左右，每 3 d
11、 换一次液。当细胞融合至约 80 %时，用 0125 %的胰蛋白酶消化 1 3 传代。细胞染料 C M -DiI 购于美国 Sig ma 公司。用二甲基亚砜溶解 DiI 结晶颗粒，配成 1 m m olL DiI 的溶液，密闭避光保存于-20 。每毫升细胞悬液加 2l DiI 溶液，轻柔混匀，置于 37 恒温箱中孵育 5min ，然后立即于 4 环境中静置 15 min ， 进行标记。将标记好的细胞悬液以 1000 rmin 离心 10 min ，37 预温的 PBS 溶液洗涤 3 次，1 ml 生理盐水重悬标记细胞，移植备用。台盼蓝染色评价细胞活力。1.2 动物模型及操作10 只中国实验用小
12、型猪（ 同上） ， 雌雄不拘，体重 25 ， 35kg 。根据心外膜是否加用纤维蛋白封闭剂（广州倍秀生物技术有限公司）将其随机均分为：单纯 M SCs 心肌注射组（M SCs 组） 和 M SCs 心肌注射联合 FS 组（M SCs +FS 组） 。具体实验操作如下：小型猪肌肉注射氯胺酮（10 m gkg ） 、咪唑安定 （012 m gkg ）诱导麻醉， 术中 1 ， 2 %异氟醚吸入、氯胺酮（20gmin kg ） 静点维持麻醉。气管插管，呼吸机吸入氧流量 1Lmin 。胸骨正中切口，明确冠脉前降支走行，于其中、远端 13 交界处阻断，反复缺血预适应 3 次后彻底结扎。配备 27Gauge
13、 针头的注射器，抽取总量为 2 107 的细胞悬液 1 ml，于结扎血管支配部位心肌垂直进针 4 ， 5 m m ， 回抽无血后注射，分10 点注射。M SCs 组细胞悬液注射完毕后常规关胸，M SCs +FS 组每点注射完拔针后，助手即刻将纤维蛋白胶滴于心外膜针口，余处理无差别，术后均肌注青霉素 320 万 U ，2 次d ，3 d 。1.3 心功能的超声学评价图像采集应用 Philips Sonos 7500 超声心动图仪，S3 探头频率为 1.6 ， 312 M Hz ，同步记录心电图。分别于心尖两腔、四腔、左心室长短轴切面采集资料存盘。脱机测量左室终末舒张期内径（L V E Dd ）
14、、左室终末收缩期内径（L V E Ds ） 、左室短轴缩短率（FS %）及以双平面 Sim pson 法计算左室射血分数（EF %） 。为避免猪较厚的皮下脂肪及拱形前突的胸骨的影响，采用开胸状态直接采集各切面图像，心内膜显示清晰；同时为避免声束近场图像的丢失，保持切面的完整性，在超声探头与心外膜间放置无菌水囊。1.4 荧光标记细胞的量化超声学图像采集结束后静脉推注 10 %K Cl，使心脏停搏于舒张期， 心尖部位随机获取组织样本，4 %甲醛固定 24h ， 常规脱水、浸蜡、包埋， 切片 5 m ，在激发光波长553n m 荧光显微镜下（Oly m2pus B X51 ，日本）观察，在放大倍率、
15、曝光时间均相同的条件下，随机采集非重叠视野图像并转化为 Tiff 格式保存，经图像分析软件 Image Pro Plus 415（IPP ， M edia Cybernetics ， M aryland ， 美国） 处理，光密度（O D ）校正后进行量化比较。1.5 免疫组织化学染色和血管计数组织切片常规行 H E 染色；免疫组织化学染色切片以体积分数 3 %的 H 2 O 2 阻断，正常羊血清封闭，加入兔抗人 因子相关抗原多克隆抗体（Dako 公司，丹麦） ，4 过夜，次日加入二抗，D A B 显色，苏木素复染。血管计数方法：每组取 10 个标本，首先在荧光显微镜下证实为细胞移植区后，再连续
16、切片完成上述免疫组化染色步骤；然后每张切片随机采集非重叠视野，每组共采集 50 个视野，IPP 量化分析同上。1.6 统计学方法实验数据以均数标准差（珚 x s）表示，应用 SPSS 1310 统计学软件分析，两组间数据比较采用独立样本 t 检验， P 0105 为差异有显著性。2 结 果2.1 动物存活评价共计 19 只小型猪用于复制急性心肌梗塞模型，术中 3 只发生室颤，直接心表电复律后仍反复发作，未进入实验分组；共 16 只，每组各 8 只完成整个细胞移植操作。2.2 移植操作评价骨髓 M SCs 经 C M -DiI 染色后，荧光显微镜下观察标记效率接近 100 %，台盼蓝染色细胞活力
17、95 %。心肌注射部位呈暗紫色，进针深度控制在 4， 5 m m ， 过深可注入心腔丢失， 每点注射量约 011 ml，过多易导致局部心肌水肿， 增加局部组织 张力，使细胞自心外膜过多渗漏。M SCs 组拔针后可见细胞从心外膜针口处随心肌收缩持续渗出，而 M SCs +FS 组点滴纤维蛋白封闭剂后 4 ， 5 秒即在心外膜凝固成膜，阻抑细胞渗出。操作中偶有室性早搏出现，无严重出血、栓塞事件发生。2.3 超声学评价结扎血管支配部位心肌运动明显减弱，两组移植前各超声学指标无显著差异（P 0105 ） 。移植后 6 周，M SCs +FS 组与 M SCs 组 L V E Dd 、L V E Ds
18、存在显著差别（ P 0101 ） ， 心肌收缩功能指标 FS %、EF %在 M SCs +FS 组较 M SCs 组显著提高，见表 1 。2.4 荧光阳性细胞及新生血管密度量化分析在曝光强度（30 ms ） 、放大倍率（ 40 ） 一致的前提下，各组随机采集图像，经 O D 校正后将荧光阳性区域单色选定， 转化为像素（Pixels ） 表示（图 1 ， 2 ，见封三） 。其中 M SCs +FS 组移植细胞呈片状聚集，光密度（71517 9916 ）像素，M SCs 组细胞散在分布， 走形似针头注射方向， 光密度 （57013 101.6 ）像素，两组间存在显著统计学差异（F =01003
19、，P 0101 ） 。连续切片分析视野内血管密度方法同上（图 3 ， 5 ， 见封三） ，M SCs +FS 组（653218 55217 像素） 较 M SCs 组（578815 54113 像素）显著增加（F =01382 ， P 0101 ） ，并且管腔较大，呈网状交织。3 讨 论目前，骨髓 M SCs 治疗冠心病的临床试验主要通过冠脉介入和心肌注射途径开展。前者创伤小，易接受，但注射后细胞绝大部分滞留于肺、肝、脾等器官，仅少量寄居在心肌间质；而后者虽需开胸操作，创伤大，但随着肋间小切口配合胸腔镜等微创技术的不断完善，将会克服创伤大的弊端，并且，该移植路径具有术野清晰直观，作用部位明确，
20、目的器官滞留率高等优点。但是，心肌作为特殊的泵收缩器官，势必挤压细胞导致其自心外膜口渗漏丢失。Teng 等2 向小型猪心肌壁注射直径 10 m 的荧光微球，量化比较了心脏跳动与否对其残留率的影响，非跳动心脏残存率为 6714 %，而跳动心脏注射后液体即从心脏表面针道口漏出，其实际有效残存率减少为 1111 %。类似的现象也在 Dow 等3 细胞心肌注射实验中证实， 注射 10 min 后仅 4418 %的细胞滞留在心肌，这一看似细微的现象使细胞注射剂量与实际心肌滞留量之间存在很大差异，这也可能是导致各个实验室之间结果差别的原因之一。国内4 采用大鼠心外膜缝线打结的方法闭合针道外口，以减少细胞丢
21、失。但是，在更贴切反映临床疗效的大型动物实验中，心肌至少需 8 ， 10 点注射，而在不停跳状态下过多的心外膜浅层缝线势必导致手术繁琐，并且会造成额外的心肌损伤。本实验采用的纤维蛋白封闭剂提前混溶，注射拔针后心外膜点滴少许，对心肌无任何刺激，封闭效果明确，术中直视观察及术后组织学量化分析均证实该改进能够显著增加心肌内移植细胞的滞留量，进而促进微血管再生，改善血流灌注，为提高注射骨髓 M SCs 的效果提供了新的途径，为各实验室及临床研究提供可比性方法。本实验采用密度梯度离心法和贴壁培养法联合分离纯化得到骨髓 M SCs5 。在体外培养扩增传代过程中，需要考虑的一个重要问题是合适的细胞密度6 。
22、同样道理，当细胞从体外培养液移植到体内组织间隙时，稳定局部的细胞密度也至关重要。本实验联合应用的针道外口封闭剂， 由纤维蛋白原、凝血因子 、凝血酶、氯化钙等组成，已经广泛应用于脏器裂口粘合和组织创面封闭等领域，通过模拟人体自身凝血反应，形成具有良好弹性和稳定性的膜状纤维蛋白多聚体，牢固的粘合在心外膜表面，封闭针道外口创面，维持细胞密度恒定，为其向内皮细胞分化提供适宜微环境（niche ） 7 。并且该蛋白制剂无细胞毒性8 ，对实验组 M SCs 不产生影响。 IPP 软件能够准确的分析图片中某一特殊染色区域的面积，在指标量化方面具有独特优越性9 ，特别是在血管计数方面。传统的方法是随机行高倍视
23、野人工计数，一方面可能增加人为误差，另一方面，当血管直径差别较大时（图 3 、图 5 ，见封三） ，其改善心肌灌注的能力是不同的，若将管径大小不一的血管均单一计数，显然是不合理的。而 IPP 软件则排除以上干扰，以血管壁阳性着色面积进行量化分析，能够准确比较区域内整体血管密度。但是，在 IPP 软件应用中，应当特别注意各组放大倍数和曝光时间的一致性，并且病理切片在染色过程中条件应相同，避免着色深浅对结果产生偏差。参考文献：1 金倩;氯地酊联合激光治疗痤疮 158 例疗效观察J;广东医学;1997 年 10 期 2 董新亭,李卫莉,张随学;自拟粉刺消治疗痤疮 126 例J;中国中医药科技;199
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