1、.中文名称：重组 DNA 技术。英文名称：recombinant DNA technique;recombinant DNA technology定义 1：用人工手段对 DNA 进行改造和重新组合的技术。包括对 DNA 分子的精细切割、部分序列的去除、新序列的加入和连接、DNA 分子扩增、转入细胞的复制繁殖、筛选、克隆、鉴定和序列测定等等，是基因工程技术的核心。重组 DNA 技术（recombinantDNAtechnique）又称遗传工程，在体外重新组合脱氧核糖核酸（DNA）分子，并使它们在适当的细胞中增殖的遗传操作。这种操作可把特定的基因组合到载体上，并使之在受体细胞中增殖和表达。因此它不
2、受亲缘关系限制，为遗传育种和分子遗传学研究开辟了崭新的途径。2.列出分子生物学常用仪器的名称，用途。答：恒温气浴摇床：常用于液体摇匀以培养微生物、细菌和细胞等。注意要依据不同的用途设置不同的参数。超净工作台：常用于为微生物学实验提供无菌操作环境。注意操作时关掉紫外灯，避免给人类带来伤害。低温台式高速离心机：常用于分离纯化蛋白、病毒、细胞等。使用时不能随便移动离心机或打开盖子；离心机运行时要处于锁定状态；离心管的放置要处于平衡状态。微量移液管：用于计量和转移微量液体的专用仪器。操作时注意避免枪头的污染；调节刻度时不宜超过最大量程；使用完后将刻度调到最大收藏。电泳仪：可对不同物质进行定性或定量分析
3、，或将一定混合物进行组分分析或单个组分的提取制备。操作时不可把导线极性接反；当电泳仪进入工作状态后，避免人体与其各部分的接触，不同介质支持物的电泳不要同时在同一电泳仪上进行；若使用时出现异常，要立刻切断电源。PCR 仪：用于扩增 DNA 片断。操作时应注意盖子要盖紧，按正确步骤进行。高压高温灭菌锅：用于杀菌消毒。使用时应严格按照规程操作，避免发生安全事故。3. 如何正确使用微量移液器。一、标准操作适用的液体：水、缓冲液、稀释的盐溶液和酸碱溶液。1)按到第一档，垂直进入液面几毫米。2)缓慢松开控制按钮，否则液体进入吸头过速会导致液体倒吸人移液器内部吸人体积减少。3)打出液体时贴壁并有一定角度，先
4、按到第一档，稍微停顿 1s 后，待剩余液体聚集后，再按到第二档将剩余液体全部压出。二、黏稠或易挥发液体的移取在移取黏稠或易挥发的液体时，很容易导致体积误差较大。为了提高移液准确性，建议采取以下方法：1)移液前先用液体预湿吸头内部，即反复吸打液体几次使吸头预湿，吸液或排出液体时最好多停留几秒。尤其对于移取体积大的液体(如 10001)，建议将吸头预湿后再移取。2)采用反相移液法：吸液时按到第二档，慢慢松开控制按钮，打液时按到第二档，部分液体残留在吸头内。三、常见的错误操作1)吸液时，移液器本身倾斜，导致移液不准确(应该垂直吸液，慢吸慢放)。2)装配吸头时，用力过猛，导致吸头难以脱卸(无需用力过猛
5、，选择与移液器匹配的吸头)。3)平放带有残余液体吸头的移液器(应将移液器挂在移液器架上)。4)用大量程的移液器移取小体积样品(应该选择合适量程范围的移液器)。5)直接按到第二档吸液(应该按照上述标准方法操作)。6)使用丙酮或强腐蚀性的液体清洗移液器(应该参照正确清洗方法操作)。1.感受态细胞在生理上与普通细胞有何差异？（1）细胞表面暴露出一些可接受外来 DNA 的位点（以溶菌酶处理，可促使受体细胞的接受位点充分暴露） 。（2）细胞膜通透性增加（用钙离子处理，可使膜通透性增加，使 DNA 直接穿过质膜进入细胞）.（3）受体细胞的修饰酶活性最高，而限制酶活性最低，使转入的 DNA 分子不易被切除或
6、破坏。（4）受体细胞本身处于非生长繁殖阶段（即受体细胞染色体相对稳定） 。（5）不存在载体的筛选基因，多采用限制酶阴性、修饰酶阳性的大肠杆菌作为受体细胞2.振荡是为了让氧气充分溶于液体，振荡利于大肠杆菌繁殖3.防止不受水气之类影响,保持培养基干燥，防止外物掉在培养基上4.（ 1）如何计算转换率，转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌落数（CFU）可计算出转化子总数和转化频率，公式如下：转化子总数菌落数涂板前离心管中菌液体积涂板时所用菌液体积转化频率 转化子总数质粒 DNA 加入量(mg) 转化效率转化子总数感受态细胞总数（2）影响感受态细胞转化效率的因素及实际操作过程中应
7、注意的事项： 1细菌的生长状态：实验中应密切注视细菌的生长状态和密度，尽量使用对数生长期的细胞（一般通过检测 OD600 来控制。DH5 菌株 OD600 为 0.5 时细胞密度是 5 107/ml ） ；2所有操作均应在无菌条件和冰上进行；3经 CaCl2 处理的细胞，在低温条件下，一定的时间内转化率随时间的推移而增加， 24 小时达到最高，之后转化率再下降（这是由于总的活菌数随时间延长而减少造成的） ；4化合物及无机离子的影响：在 Ca2+的基础上联合其他二价金属离子（如 Mn2+或 Co2+） 、 DMSO 或还原剂等物质处理细菌，可使转化效率大大提高（ 100-1000 倍） ；5所使
8、用的器皿必须干净。迹量的去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率；6质粒的大小及构型的影响：用于转化的应主要是超螺旋的 DNA ；7一定范围内，转化效率与外源 DNA 的浓度呈正比；（3）细胞生长状态和密度、质粒的质量和密度、试剂的质量、防止杂菌和杂 DNA 的污染 5.电转化的原理是？为何转换率高于氯化钙法？原理：电转化法是利用瞬间高压在细胞上打孔，因而需用冰冷的超纯水多次洗涤处于对数生长前期的细胞，以使细胞悬浮液中应含有尽量少的导电离子。转化效率为 1091010 转化子/g DNA；?1.碱法提取质粒 DNA 中各溶液的作用是什么？及其注意事项？答：各溶液的作用如下：溶液：葡
9、萄糖增稠，使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部；EDTA 抑制DNase 的活性。这一步溶液中还可以加入 RNase，不受 EDTA 影响，并且可以在后续步骤中被除去溶液： 0.2M NaOH / 1% SDS破细胞的主要是碱，而不是 SDS，所以才叫碱法抽提。溶液 ：3M 醋酸钾 / 2M 醋酸这一步的 K 置换了 SDS（十二烷基磺酸钠）中的 Na，得到 PDS（十二烷基磺酸钾）沉淀；SDS 易与蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个 SDS 分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质也沉淀了，同时基因组 DNA 也被 PDS 共沉淀 。注意事项1收集菌体提质粒前，培养基
10、要去除干净，同时保证菌体在悬浮液中充分悬浮。2在添加溶液与溶液后溶液的混合一定要柔和，采用上下颠倒的方法，千万不能在旋转器上剧烈振荡。其中加入溶液后，溶液变成澄清，并有黏性；加入溶液后，出现絮状沉淀。3苯酚具有腐蚀性，能造成皮肤的严重烧伤及衣物损坏，使用时应注意。如不小心皮肤上碰到苯酚则应用碱性溶液、肥皂及大量的清水冲洗。4苯酚可以用于抽提纯化 DNA，由于苯酚的氧化产物可以使核酸链发生断裂。所使用的苯酚在使用前必须经过重蒸，且都必须用 0.1mol/LTris-HCl (pH7.6)进行平衡。所以取酚/氯仿 /异戊醇时应取下层溶液，因为上层是 Tris-HCl 液隔绝空气层。5酚/氯仿/ 异
11、戊醇抽提时，应充分混匀。经酚/氯仿/ 异戊醇抽提后，吸取上清液时注意不要把中间的白色层吸入，其中含有蛋白质等杂质。6实验中，涉及酚/氯仿溶液的操作要格外小心，而且与之接触的吸头、Ep 管，全部弃用，不回收。7有些质粒本身可能在某些菌种中稳定存在，但经过多次移接有可能造成质粒丢失。因此不要频繁转接，每次接种时应挑单菌落。2.描述质粒 DNA 的电泳图谱，并解释可能产生的现象及原因？质粒 DNA 电泳会有三条带（最前面跑最快的是超螺旋，中间的是开环质粒，最后是质粒的复制中间体） 。最远的是线形 DNA（lDNA）： 质粒的两条链均断裂；线性分子；中间的是开环 DNA（ocDNA ）： 质粒的一条链
12、断裂；松弛的环状分子；共价闭合环状DNA（cccDNA）： 质粒的两条链没有断裂；超螺旋 这是由于在质粒提取过程中，机械力、酸碱度、试剂等的原因，使质粒 DNA 链发生断裂。1.DNA 在电泳过程中的迁移率取决于哪些因素？答：DNA 在电泳过程中的迁移率取决于 DNA 分子特性和电泳条件。 DNA 分子大小 DNA 分子越大在胶中的摩擦阻力就越大，泳动也越慢，迁移速率与线状DNA 分子质量的对数值成反比。 DNA 分子构型 对于质粒 DNA 分子即使具有相同分子质量，因构型不同也会造成电泳时受到的阻力不同，最终造成泳动速率的不同。常规电泳中质粒 DNA 分子的 3 种构型泳动速率：超螺旋最快、
13、线状分子次之，开环分子最慢。 不同的胶浓度 对于同种 DNA 分子胶浓度越高，电泳速率越慢。不同胶浓度对于 DNA片段呈线性关系有所区别，浓度较稀的胶线性范围较宽，而浓的胶对小分子 DNA 片段呈现较好的线性关系。所以常规实验中对于小片段 DNA 分子的分离采用高浓度的胶分离（有时甚至用 2的凝胶） ，而对于分离大片段则用低浓度的凝胶。 溴化乙锭 简称EB，电泳中的染色剂，具有扁平结构，能嵌入到 DNA 碱基对间，对线状分子与开环分子影响较小而对超螺旋态的分子影响较大。当 DNA 分子中嵌入的 EB 分子逐渐增多时，原来为负超螺旋状态的分子开始向共价闭合环状转变，电泳迁移速度由快变慢；当嵌入的
14、 EB分子进一步增加时，DNA 分子由共价闭合环状向正超螺旋状态转变，这时电泳迁移速率又由慢变快。这个临界点的游离 EB 质量浓度为 0.1g/ml0.5g/ml，即电泳时所加的浓度。因此一般电泳可以忽略此因素，而对于特殊电泳，消除此因素影响可采用电泳后染色。 电场强度电泳缓冲液 2.琼脂糖电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳的区别DNA 电泳一般使用的都是琼脂糖凝胶电泳，电泳的驱动力靠 DNA 骨架本身的负电荷。 蛋白质电泳（一般指 SDS-PAGE）一般使用的都是聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳的驱动力靠与蛋白质结合的 SDS 上所携带的负电荷。 所以相同点就是样品都是带负电荷的，从负极向正极移动，移动的距离
15、都和样品的分子量有关。而且这两个电泳体系可以互相交换使用。进行大分子蛋白质电泳时，可以考虑换用琼脂糖凝胶，因为该体系孔径大。相反，如果需要精确到各位数碱基的 DNA 电泳也可以使用聚丙烯酰胺凝胶系统，因为使用该系统可以将相差一个碱基的两条 DNA 链分开。 不同点首先是样品不同。这个就不用多说了。其次是结果的观察方法不同。DNA 电泳普遍使用 EB 做染料，在紫外灯下观察；而蛋白电泳使用的考马斯亮蓝染色，还需要经过脱色步骤，不过观察起来比较简单。还有就是胶体系的差别，DNA 电泳通常是一胶跑到底，而蛋白质电泳则会有分离胶和浓缩胶之区别。 电泳中样品移动的本质确实是样品所携带的电荷。但是，区分这
16、些条带直接可以用分子量而无需使用电荷数，是因为这些样品的电荷/分子量比都是恒定的了。以 DNA 分子为例，它在电泳中的移动是靠其骨架中磷酸所携带的负电荷来实现的，而这个磷酸分子又是每一个核苷酸中都有的，所以 DNA 分子所携带的负电荷数是由其核苷酸总数决定的。而且，DNA 分子中核苷酸的组成动辄成百上千，在如此大的分子量面前，讨论单个核苷酸之间分子量的差别就显得毫无意义。这样，DNA 分子中负电荷的量就可以用 DNA 的分子量来代替，反过来，DNA 的分子量也就可以用 DNA 分子所携带的电荷来代替（一句话，DNA分子的电荷/分子量比是恒定的） 。 这在蛋白电泳中（特别是 SDS-PAGE 中
17、）是一样的。在 SDS-PAGE 中，SDS 将蛋白质变性成直线分子并紧密包裹于其上，使得其所携带的电荷与蛋白分子量成了一定的比例，剩下的就和核酸电泳一样了。 至于为什么核酸的横着跑，蛋白竖着跑，个人认为最大的问题是蛋白制胶的过程导致的。蛋白制胶由于使用了两种不同的凝胶系统，所以需要一个水平的分界面。这个分界面在配胶的过程中是依靠异丙醇在重力作用下的压力下形成的。所以，一并就竖着跑了1.基因组 DNA 提取过程中应注意哪些问题?如何保证和检测 DNA 的质量？核酸制备时应注意的事项:尽量简化操作步骤，缩短提取过程。减少化学因素对核酸的降解。减少物理因素对核酸的降解：机械剪切力和高温防止核酸的生
18、物降解。注意事项核酸沉淀、溶解当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分沉淀时加入 1/10 体积的 NaAc（pH5.2，3M） ，有利于充分沉淀沉淀后应用 70的乙醇洗涤，以除去盐离子等晾干 DNA，让乙醇充分挥发（不要过分干燥）若长期储存建议使用 TE 缓冲液溶解TE 中的 EDTA 能螯和 Mg2+或 Mn2+离子，抑制 DNasepH 值为 8.0，可防止 DNA 发生酸解 2.基因组 DNA 提取与质粒 DNA 提取有何差异质粒 DNA 提取一般用沸水浴法和碱裂解法，现在一般都采用碱裂解法，并有试剂盒可用，它主要是将细胞内的环状质粒提取出来，一般需要用 SDS 裂解，
19、RNA 酶降解，然后过柱，再进行洗脱。过程比较简单。而基因组 DNA 提取则较为复杂，也需要用 SDS 裂解和 RND 酶降解，但降解时间较长，同时对有些革兰氏阳性细菌还要进行溶菌酶处理，最后用氯仿-苯酚进行除蛋白，这一步重复进行多次，在用氯仿除去多余的苯酚，用乙醇清洗烘干后溶于 TE 缓冲液中，整个过程比提质粒更复杂，耗时也更多。1.重组实验中常用的酶有哪几类DNA 重组技术中几种常用酶限制性核酸内切酶 ：识别 DNA 特定序列，切断 DNA 链 ； DNA 聚合酶： 或 Klenow 1、 缺口平移制作标记 DNA 探针； 2、 合成 cDNA 的第二链； 3、 填补双链 DNA3凹端；
20、4、 DNA 序列分析耐热 DNA 聚合酶（Taq DNA 聚合酶等） 聚合酶链反应（PCR） ； DNA 连接酶： 连接两个 DNA 分子 多核苷酸激酶 ：催化多核苷酸 5羟基末端磷酸化，制备末端标记探针 末端转移酶 ：在 3末端加入同质多聚物尾； SI 核酸酶/绿豆核酸酶： 降解单链 DNA 或 RNA，使双链 DNA 突出端变为平端； DNA 端酶： 降解 DNA，在双链 DNA 上产生随机切口 ； RNA 酶 A： 降解除 RNA ； 磷酸酶 ：切除核酸末端磷酸基 ； 核酸酶： 1、 核酸外切酶（exonuclease）：是从核酸的一端开始，一个接一个把核苷酸水解下来；2、 核酸内切酶
21、(endonuclease)：是从核酸链中间水解 3，5磷酸二酯键，将核酸链切断DNA 限制性内切酶 ：粘性末端配对重组； 同裂酶 ：有一些来源不同的限制酶识别的是同样的核苷酸靶子序列，这类酶称为同裂酶。同裂酶产生同样的切割，形成同样的末端； 同尾酶： 这一类的限制酶来源各异，识别的靶字序列也不相同，但产生相同的粘性末端。由同尾酶产生的 DNA，是能够通过其粘性末端之间的互补作用彼此连接起来的；2、限制性内切酶 注意：1分子克隆是微量操作技术，DNA 样品与限制性内切酶的用量都极少，必须严格注意吸样量的准确性及全部放入反应体系中。 2要注意酶切时加样的次序，一般次序为水、缓冲液、DNA 各项试
22、剂，最后才加酶液。取液时，Tip 头要从溶液表面吸取，以防止 Tip 头沾去过多的液体与酶，待用的内切酶要放在冰浴内，用后盖紧盖子，立即放回-20冰箱，防止限制性内切酶的失活。 3凡用在酶切反应中的一切塑料器皿（Eppendorf 管，Tip 头等） ，都要新的，最后用重蒸水清洗，湿热灭菌，置 50温箱中烘干，使用前打开包装，用镊子夹取，不直接用手去拿，严防手上杂酶污染。 4当样品在 37与 65保温时，要注意：（l）防止因盖子未盖严密使水汽进入管内，使反应溶液体积大量增加，造成实验失败。 （2）防止由于标签脱落，分不清样品类型。 5由于温差原因，往往在盖上有水汽，因此样品酶切完毕或中间取样电泳要离心 2 秒钟，以集中体积内溶液，否则会发现酶切后体积少了。10%：但要确保酶体积不超过反应总体积的 10%，否则酶活性将受到甘油的抑制
