1、摘 要I摘 要从土壤中筛选出一株产 -半乳糖苷酶的枯草芽孢杆菌，并对菌株和其产生的 -半乳糖苷酶进行了测定。单菌落的最佳生长时间是 10h，最佳接种量是 2.0%，最佳培养时间 24h；该菌株产生的 -半乳糖苷酶的最适 pH 是 6.5，最适生长温度为 37，酶的稳定性较高，4h 后相对酶活仍能维持 85%以上；Mg 2+对酶活性的促进作用最强，当浓度为 10 mmol/L 时，酶活力可达 112.24，Cu 2+对酶活性抑制作用最强，少量 Cu2+（1mmol/L）就可使酶失活。本实验还进行了 -半乳糖苷酶的固定化实验。 以海藻酸钠为栽体、戊二醛为交联剂，对乳糖酶进行固定化。研究了海藻酸钠浓
2、度、氯化钙浓度、戊二醛浓度、固定化时间对酶固定化的影响，并对固定化酶酶促反应的最适 pH、温度等进行了测定。结果表明，4的海藻酸钠，在温度 37、pH67 、氯化钙浓度1、戊二醛浓度 0.1%下对乳糖酶的固定化率最高。酶促反应特性测定结果表明，固定化后乳糖酶的稳定性增强，最适温度范围较非固定化乳糖酶大，最适pH 范围与非固定化乳糖酶大致相同。但固定化酶珠体机械强度较差，尚待改进。关键词：-半乳糖苷酶 酶活性 酶的固定化AbsractIIAbsractA strain isolated from soil in producing -galactosidase of Bacillus subti
3、lis, and strains and -galactosidase were measured which produces. A single colony of the best growth time is 10h, the best inoculum was 2.0%, the best culture time 24h; optimum pH -galactosidase enzyme produced by this strain is 6.5, the optimum temperature is 37, enzyme high stability, 4h after the
4、 relative activity can be maintained above 85%; Mg2+ on the activity of promoting the strongest, when the concentration of 10 mmol/L, the enzyme activity of up to 112.24%, Cu2+ inhibition of enzyme activity most, a small amount of Cu2+ (1mmol/L) can inactivate the enzyme.The experiments were also -g
5、alactosidase immobilization experiments. The lactase was immobilized on sodium alginate carrier by cross-link with glutaraldehyde. The effects of flutaraldehyde concentration, amount of the enzyme and temperature immobilization were analyzed. The reaction conditions (optimun pH and temperature) of t
6、he immobilized lactase were studied. The results show that the high recovery rate of immobilized enzyme could be obtained under the conditions of 0.1% glutaraldegyde, 4% sodium alginate and 37 temperature. Keyword: -galactosidase, enzymes activity, Immobilization of enzyme目 录III目 录摘 要 .IAbsract.II目
7、录 .III第 1 章 绪论 .11.1 研究背景 .11.2 课题研究目的和意义 .21.3 国内外研究现状和发展趋势 .21.4 -半乳糖苷酶的来源及其特性 .41.4.1 细菌产生的 -半乳糖苷酶 .41.4.2 酵母菌产生的 -半乳糖苷酶 .41.4.3 霉菌产生的 -半乳糖苷酶 .41.5 -半乳糖苷酶在食品工业中的应用 .51.5.1 水解牛乳和其它乳制品中的乳糖 .51.5.2 生产低聚半乳糖(Galactooligosaccharide) .61.5.3 分析食品中乳糖含量 .71.5.4 -半乳糖苷酶在制药工业中的应用 .71.5.5 -半乳糖苷酶在酶联免疫反应(EIA) 中
8、的应用 .7第 2 章 材料和方法 .82.1 材料 .82.1.1 材料与试剂 .82.1.2 仪器与设备 .82.1.3 培养基 .82.2 产 -半乳糖苷酶菌的筛选 .92.2.1 菌株筛选方法 .92.2.2 分离纯化 .92.2.3 菌种生理生化鉴定 .92.2.4 -半乳糖苷酶粗酶液制备 .92.2.5 邻硝基苯酚（ONP）标准曲线 .92.2.6 -半乳糖苷酶酶活力测定 .102.3 -半乳糖苷酶酶学性质 .102.3.1 菌种生长曲线测定 .102.3.2 培养时间对菌株产酶能力的影响 .102.3.3 接种量对菌株 BGJ222 产酶能力的影响 .102.3.4 pH 值对
9、-半乳糖苷酶活力和稳定性的影响 .102.3.5 温度对 -半乳糖苷酶活力和稳定性的影响。 .112.3.6 不同金属离子及离子浓度对 -半乳糖苷酶的影响。 .11第 3 章 -半乳糖苷酶酶学性质 .123.1 高产 -半乳糖苷酶细菌的筛选 .123.2 邻硝基苯酚（ONP）标准曲线 .123.3 菌株生长曲线测定 .133.4 培养时间对菌株产酶能力的影响 .143.5 接种量对菌株产酶能力的影响 .14目 录IV3.6 pH 对酶活性和稳定性的影响 .153.7 温度对酶活性和稳定性的影响 .163.8 不同金属离子及离子浓度对 -半乳糖苷酶的影响 .17第 4 章 酶的固定化研究 .19
10、4.1 固定化酶简介 .194.2 酶的固定方法 .204.2.1 包埋法 .204.2.2 吸附法 .204.2.3 吸附法 .204.2.4 交联法 .204.3 固定化酶反应器的类型 .214.3.1 连续操作搅拌式反应器(Continuous Flow Stirred Tand Reactor，CSTR) .214.3.2 固定床反应器(Packed Bed Reactor，PBR) .224.3.3 流化床反应器(Fluidzed Bed Reactor，FBR) .234.3.4 中空纤维反应器(Hollow Fiber Reactor) .234.4 固定化乳糖酶国内外研究进展
11、.244.4.1 国外研究进展 .244.4.2 国内研究进展 .254.5 -半乳糖苷酶的固定 .264.5.1 包埋材料选择 .264.5.2 -半乳糖苷酶固定方法 .264.5.3 固定酶活力测定 .264.6 固定化的最适条件 .274.6.1 海藻酸钠浓度的确定 .274.6.2 CaCl2 浓度的确定 .274.6.3 固定化时间的确定 .284.6.4 戊二醛交联试验 .284.7 固定化酶的酶学性质 .294.7.1 固定化酶的最适 pH.294.7.2 固定化酶的最适温度 .304.8 固定化酶的催化反应机理探讨 .304.8.1 固定化酶对反应体系的影响 .314.8.2
12、影响固定化酶的动力学因素 .314.9 固定化酶保护剂的筛选 .32参 考 文 献 .34致 谢 .35第 1 章 绪 论0第 1 章 绪 论1.1 研究背景-半乳糖苷酶（-galactosidase） ，全名为 -D-半乳糖苷水解酶（-D-galactoside- galcagalcato-hydrolase，EC.3.2.1.23） ，常简称为乳糖酶。一般说来，该酶有两种催化性质：一是催化水解反应，将乳糖分解为葡萄糖和半乳糖；二是催化转移反应，在乳糖分子的半乳糖一侧连接 14 个半乳糖，生成低聚半乳糖(galactooligosaccharide,GOS)；在乳糖水解产物半乳糖一侧连接果糖
13、，生成乳果糖（lactulose） 。图 1 乳糖水解机理-半乳糖苷酶的分子 540kD，为四聚体结构。其结构基因为 LacZ(半乳糖苷酶)，与 LacY（半乳糖苷透性酶）和 LacA（半乳糖苷转乙酰酶）共同组成乳糖操纵子，并在特异的乳糖操纵系统中的阻遏物、操纵基因、启动子等的协同下，支配调节 -半乳糖苷酶的合成。当培养基中无诱导物质时，每一细胞中虽然没有几个分子的 -半乳糖苷酶，但一旦被诱导，则每一世代都能合成多达几千个分子的酶。-半乳糖苷酶可用于治疗乳糖不耐症。几乎所有的哺乳动物在断奶后将失去分泌乳糖酶的能力，仅有极少数能在其肠道内保持较高的乳糖酶活性。乳糖酶缺乏症人群的乳糖摄入量超过其胃
14、肠消化能力时，就会导致乳糖代谢不完全。未被消化的乳糖在渗透压的作用下进入肠内被其他细菌分解代谢，会生成乳酸以及其他有机酸，导致消化不良和胃肠不适。可见，未被消化的乳糖及有机酸的渗透作用是酸性腹泻的诱发剂。此外，主要碳水化合物为乳糖的牛奶是一种第 1 章 绪 论1全价营养食品，可以为人体提供蛋白质、能量、钙、磷和钾等多种营养，促进人体健康。但是由于乳糖不耐症的存在，很多人难以食用牛奶或其他乳制品，这极大地抑制了乳品行业的发展。乳糖消化的程度取决于以下几种因素：乳糖摄入量、在肠胃内停留时间（由饮食时间决定） 、-半乳糖苷酶摄入量以及乳制品摄入量。科研人员通过对乳糖不耐症与乳糖摄入量关系的大量研究，
15、发现乳糖的摄入量与乳糖不耐症的严重程度具有直接的关系：摄入较少剂量的乳糖（少于 12g 或一杯牛奶）不会导致乳糖不耐症，而摄入较高剂量的乳糖（20g50g）时则会导致较为严重的乳糖不耐症。因此解决乳糖不耐症最好的办法是将乳糖从食物中去除，以无乳糖配方的形式供给人体。常见的去除乳糖的方法有大豆配方和水解配方，然而大豆配方对于体重小于 1.8kg 的早产儿其营养成分远远不够，因此开发可以分解乳糖的酶或微生物以水解配方解决乳糖不耐症的方法成为研究的主要方向。1.2 课题研究目的和意义-半乳糖苷酶可以有效降低乳制品中乳糖含量。在酸奶发酵中，向牛奶中接种保加利亚乳杆菌（Lactobacillus del
16、brueckii subsp. bulgaricus）和嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）进行发酵，可分解掉牛乳中 2550%的乳糖，使牛奶中乳糖含量降至约 4%。乳酸菌定植于肠道内，它们仍能代谢被摄入人体内的乳糖。因此，乳酸菌可以广泛用于各种乳品加工生产低乳糖制品。采用筛选出的菌种进行酸奶加工，验证其加工性能，掌握其工艺加工性能和应用于乳品加工的潜力，从而将其应用于乳品发酵产品，降低乳糖含量，缓解人体普遍存在的乳糖不耐症，扩大乳品的消费量。具有较高 -半乳糖苷酶活性的乳酸菌能将牛奶中的乳糖分解为葡萄糖和半乳糖，这对于乳品行业的发展具有很大的应用潜力。此外，-半
17、乳糖苷酶可被加工成液态、药剂或粉末状形式的产品，用来治疗乳糖不耐症。这些都为产 -半乳糖苷酶的开发利用提供了潜在的发展市场。1.3 国内外研究现状和发展趋势历史上，-半乳糖苷酶的研究为微生物学的发展作出了巨大贡献。国外对东北电力大学学士毕业论文2-半乳糖苷酶的研究较早，许多研究工作主要集中在 -半乳糖苷酶在食品加工中的应用。1889 年，荷兰生物学家 Beijerincek 第一次报道了 -半乳糖苷酶可水解乳糖。1944 年 Whitter1就比较全面的讨论了 -半乳糖苷酶的应用。1948 年Caputto2等讨论了通过大量培养和纯化脆壁酵母（Saccharimyces fragilis）生产
18、-半乳糖苷酶的方法。法国的雅各（Jacob ）和莫诺德（Monod） 3通过对大肠杆菌 -半乳糖苷酶的研究，于 1961 年提出了乳糖操纵子学说，阐明了酶生物合成的调节机制，使酶的生物合成可以按人们的意志加以调控，为研究其他生物的代谢调控提供了依据。1972 年 Rorglun 等报道了真菌 -半乳糖苷酶的特性。进入 80 年代，Jrodon 等 4首次对小鼠成功的获得了动物基因转移，是纯合子动物分泌的乳汁中完全不含乳糖，为利用基因工程生产低乳糖牛乳奠定了基础。国内对 -半乳糖苷酶的研究起步较晚，是在 20 世纪 80 年代以后开始的。1980 年天津工业微生物研究所 5组成 -半乳糖苷酶研究
19、组，对 -半乳糖苷酶产生菌的选育、发酵工艺研究、酶的提取纯化、酶学特性的进行了较为全面的研究。1990 年无锡轻工业大学的李强军等选育到黑曲霉菌 CWL2NU-3，经发酵条件优化后产酶活力达 12u/ml（ONPG 单位） 。1985 年东北农业大学的万贤生对-半乳糖苷酶在乳清中的综合利用展开了研究。上海复旦大学的郭杰炎等以乳酸酵母 Y12-1 发酵生产的 -半乳糖苷酶活力达 40u/ml（ONPG 单位） ，干燥制成的酶粉冰箱保藏半年，酶活残存 98%。目前，-半乳糖苷酶主要用于低乳糖制品的研制和开发，以满足乳糖不耐症患者对乳制品消费的需求。工业生产上最直接、有效的方法就是将酶直接加入到牛乳
20、中制得乳糖水解乳，该法水解条件温和（pH3.88，温度 5060） ，产物简单，不会破坏乳中的其他营养成分。国外已有一些大公司生产商业用乳糖酶制剂，用于生产乳糖水解乳制品。随着研究的不断深入，微生物发酵法生产的 -半乳糖苷酶活性会进一步得到提高。如果在国内能够实现 -半乳糖苷酶的工业化生产，其制品的生产和应用成本将会大幅度降低。因此，-半乳糖苷酶具有广阔的市场前景，并且会取得相当可观的经济效益和社会效益。第 1 章 绪 论31.4 -半乳糖苷酶的来源及其特性-半乳糖苷酶存在于植物（尤其是杏、桃、苹果） ，细菌（大肠杆菌、乳酸菌等） ，真菌（米曲霉、黑曲霉、脆壁酵母、乳酸酵母、热带假丝酵母等）
21、，放线菌以及哺乳动物（特别是婴儿）的肠道中。目前仅来源于微生物的 -半乳糖苷酶有工业应用价值，利用微生物发酵法制取 -半乳糖苷酶，酶源丰富，产量高，生产成本低，周期短，而且不受季节、地理位置等因素的影响。不同微生物来源的 -半乳糖苷酶的性质有所不同 6。1.4.1 细菌产生的 -半乳糖苷酶细菌 -半乳糖苷酶，尤其是嗜热细菌产生的酶正得到广泛的研究，到目前为止，大肠杆菌（Escherichia coli）产生的 -半乳糖苷酶是研究的最彻底、最深入，并已大量用于生化分析中。细菌产生的 -半乳糖苷酶是胞内酶，在培养过程中不能分泌到培养基中，它的耐热性较高，这一点有利于固定化酶的制造。但因产量低及可能
22、的毒性问题，故迄今未用于工业化生产。1.4.2 酵母菌产生的 -半乳糖苷酶酵母菌产生的 -半乳糖苷酶通常是胞内酶，制备纯品必须破碎细胞，该酶对酸、热较不稳定，当某些离子存在时，才有最大活性，因此不适于在工业上进行应用。但是，酵母菌容易培养，在深层培养条件下可以大量生产 -半乳糖苷酶，这些优点掩盖了它的不足，故酵母菌产生的 -半乳糖苷酶才得以成功的进行开发。酵母菌产生的 -半乳糖苷酶最适 pH 近于中性，与牛乳的天然 pH 值接近，最适温度较低，适于处理牛乳和甜乳清中的乳糖。脆壁酵母和乳酸酵母（Saccharimyces lactic ）是生产 -半乳糖苷酶的主要酵母菌种。1.4.3 霉菌产生的
23、 -半乳糖苷酶霉菌产生的 -半乳糖苷酶是胞外酶，可以用固态培养也可以采用液态深层培养来生产，在培养过程中酶分泌到培养基中，提取较为方便。霉菌产生的 -东北电力大学学士毕业论文4半乳糖苷酶较耐热、耐酸，不需要活化剂和稳定剂，稳定性较高。M.S.Palunbo等人发现，米曲霉产生的 -半乳糖苷酶即使在 45高温下贮藏 6 个月，仍能保存其活力的 93.4%。曲霉 -半乳糖苷酶的最适 pH 值较低，适用于面包的制造以及分解面团中的乳糖，有利于酵母发酵，并使制品具有良好的色泽。同时，由于它较为稳定，有很好的耐受性，比酵母 -半乳糖苷酶更适合于固定化酶的制造。目前应用较多的霉菌 -半乳糖苷酶产生菌主要是
24、米曲霉（Aspergillus oryzse）和黑曲霉（Aspergillus niger） 。1.5 -半乳糖苷酶在食品工业中的应用1.5.1 水解牛乳和其它乳制品中的乳糖1.5.1.1 解决乳糖不耐症患者的乳品消费问题牛乳中含有丰富的蛋白质、脂肪、碳水化合物以及几乎全部已知的维生素，尤其是牛乳中含有丰富的钙质，且极易被人体吸收，被誉为“近乎完善的食物” 。但据有关资料报道，有 10的白人，51的印第安人，81的非裔加勒人和70的亚洲人由于肠道内缺乏 -半乳糖苷酶而患有程度不同的乳糖不适症(又称乳糖不耐症) 7。用 -半乳糖苷酶水解牛乳中的乳糖以满足乳糖不适症患者的需要，是较为实用、有效的方法。采用给患者同时服用乳制品和 -半乳糖苷酶片(通常是霉菌 -半乳糖苷酶，它的最适 pH 值与胃环境相一致)，也可以解决这一问题。1.5.1.2 提高乳制品的甜度乳糖的甜度较低，只有蔗糖的 20，水解后，一分子乳糖生成一分子葡萄糖和一分子半乳糖，可以明显提高乳制品的甜度，减少甜味剂的用量，而且不增加食品的热量 8。1.5.1.3 防止乳制品冷冻时出现结晶乳糖的溶解度较低，只有蔗糖的 10，在制作冷冻乳制品时容易结晶析出，
