1、奶粉的大肠菌群检验方法,大肠菌群的定义,大肠菌群：一群在37，经24h能发酵乳糖，并产酸产气，需氧或兼性厌氧生长的革兰氏阴性的无芽孢杆菌。其中包括有大肠杆菌（也称大肠埃希氏菌）、肠杆菌属、枸橼酸菌属、克雷伯氏菌属中的一部分和沙门氏菌属的第亚属。,P139,大肠杆菌的定义,大肠杆菌指革兰氏阴性无芽孢杆菌、乳糖发酵产酸产气、IMViC试验（靛基质、MR、V-P、柠檬酸盐试验）为+-或-+-的细菌。大肠杆菌（也称大肠埃希氏菌），分类于肠杆菌科，归属于埃希氏菌属。 与人类有关的大肠杆菌统称为致泻性大肠杆菌，包括五种：肠毒素性大肠杆菌（ETEC）、致病性大肠杆菌（EPEC）、出血性大肠杆菌（EHEC）、
2、侵袭性大肠杆菌（EIEC）、黏附性大肠杆菌（EAEC）。,大肠菌群和大肠杆菌的关系,耐热大肠菌群的定义：能在液体乳糖培养基中35/37 培养48h产酸产气，并在44.5培养24h产酸产气的细菌（依据ISO标准）,卫生学意义,大肠菌群和大肠杆菌作为食品卫生标准的意义在于，是评价卫生质量的重要指标，作为食品中的粪便污染指标。 另外，肠道致病菌如沙门氏菌属和志贺氏菌属等，对食品安全性威胁很大。经常检验致病菌有一定困难。而食品中的大肠菌群较容易检出，肠道致病菌与大肠菌群的来源相同，而且在一般条件下大肠菌群在外环境中生存时间也与主要肠道致病菌一致所以大肠菌群的另一重要食品卫生意义是作为肠道致病菌污染食品
3、的指示菌 大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。,大肠杆菌的生物学特性,基本形态：此菌为两端钝圆的短小杆菌，一般约0.5-0.8m*1.0-3.0 m，多单独存在或成双，但不呈长链排列。约50%的菌株有周生鞭毛，但多数只有1-4根，一般不超过10根，故菌体动力弱。多数菌株有菌毛，有的有荚膜或微荚膜，不形成芽孢，对普通碱性染料着色良好，革兰氏染色阴性。,大肠杆菌的生物学特性,培养特性： 大肠杆菌合成代谢能力强，在含无机盐、铵盐、葡萄糖的普通培养基上生长良好。最适生长温度为37，在42-44 条件下仍能生长，生长温度范围15-46 。,在普通营养琼脂上有3种菌落形
4、态：1）光滑型：菌落边缘整齐，表面有光泽、湿润、 光滑、呈灰色，在生理盐水中易分散；2）粗糙型：菌落扁平、干涩、边缘不整齐，易在生理盐水中自凝；3）黏液型：常为含有荚膜的菌株。,食品中大肠菌群数是以每100mL（g）检样内大肠菌群最近似数（MPN）表示。,大肠菌群数的定义,P142,GB/T 4789.3-2010大肠菌群,初发酵,复发酵,24 2h 48 2h,大肠菌群MPN计数法 操作步骤,实验材料,检测样品：奶粉 设备和材料：恒温培养箱、天平、摇床、无菌移液管（1ml）、无菌锥形瓶、无菌试管、小倒管、精密pH试纸 培养基和试剂：LST肉汤、BGLB肉汤、无菌生理盐水、1mol/L NaO
5、H 、1mol/L HCl,实验步骤：前期准备,每个小组准备器材：移液管1mlX6、10mlX2、锥形瓶500mlX2、试管X14 准备试剂： 配制：LST肉汤（1000ml）和BGLB肉汤生理盐水（500ml）,相关配方,相关配方,生理盐水：8.5g+1000ml蒸馏水（一锥形瓶瓶装225ml，剩下的装在另外一个锥形瓶中）,将相关玻璃仪器进行灭菌前包装 将配制好的LST肉汤加入试管中（注意1），然后小心将小倒管放入肉汤中（注意2）（每组10支） 将所有东西包扎好放入灭菌锅中灭菌20min,实验步骤：前期准备,实验步骤：检样稀释,称取25g样品加入225ml生理盐水中摇床匀质制成1:10样品匀
6、液 取一支无菌试管+9ml生理盐水+1ml1:10样品制成1:100稀释液 如2方法制成1:1000稀释液（注意3） 分别标注好标号,实验步骤：初发酵,用1ml无菌移液管分别吸取3个稀释度的稀释样品至LST肉汤发酵试管中（每一稀释度3管）,加好后塞好试管塞，放进培养箱培养24-48h,实验步骤：复发酵,将LTS发酵管取出，观察倒管是否有气泡，将初发酵产气的管数种类进行记录,注意：在发酵试验工作中，经常可以看到在发酵倒管内极微少的气泡（有时比小米粒还小），有时可以遇到在初发酵时产酸或沿管壁有缓缓上浮的小气泡。实验表明，大肠菌群的产气量，多者可以使发酵倒管全部充满气体，少者可以产生比小米粒还小的气
7、泡。如果对产酸但未产气的乳糖发酵如有疑问时，可以用手轻轻打动试管，如有气泡沿管壁上浮，即应考虑可能有气体产生，而应作进一步试验。,实验步骤：复发酵与结果,准备BGLB肉汤发酵管（分装、灭菌等） 用接种环接一环产气的LTS发酵管至BGLB发酵管中，并记号 放进培养箱培养48h 取出观察倒管是否产气，如果两种发酵管均产气则证实为大肠菌群阳性，并根据管数查MPN检测表（P142-143），得出MPN值,大肠菌群测定MPN法检验几点说明,MPN检索表：MPN 为最大可能数(Most Probable Number)的简称。这种方法，对样品进行连续系列稀释，加入培养基进行培养，从规定的反应呈阳性管数的出
8、现率，用概率论来推算样品中菌数最近似的数值。MPN检索表只给了三个稀释度，如改用不同的稀释度，则表内数字应相应降低或增加10倍。,初发酵和证实试验：1）两步法进行了两次乳糖发酵试验。初发酵和证实实验所用培养基不同，但都是为了证实培养物是否符合大肠菌群的定义，即“在37分解乳糖产酸产气”。 LST中提供了磷酸盐缓冲体系，氯化钠可维持渗透压，月桂基硫酸钠可抑制非大肠菌群的生长，这个缓冲蛋白胨乳糖肉汤允许“缓慢乳糖发酵（Slow lactose fermentations）”来促进菌体产气。BGLB中胆盐和煌绿可以抑制革兰氏阳性细菌和除了大肠菌群的很多革兰氏阴性细菌。2）初发酵阳性管，不能肯定就是大肠菌群细菌，经过证实试验后，有时可能成为阴性。有数据表明，食品中大肠菌群检验步骤的符合率，初发酵与证实试验相差较大。因此，在实际检测工作中，证实试验是必需的。,大肠菌群测定MPN法检验几点说明,不适于用大肠菌群作为粪便污染指示菌的食品,冷冻食品经射线照射处理的食品pH较高的食品在上述食品中大肠菌群的细菌比许多肠道病原微生物更易死亡。,数据记录,记录初发酵与复发酵的产气管数以及实验现象 MPN值查询 讨论实验结果（与其他组比较）,
