1、基因工程第五章第五章 基因的体外重组和转化第一节 DNA 片段的体外连接 第二节 重组体导入细菌细胞一、黏性末端的连接黏性末端连接(Cohesive end ligation)：具有黏性末端的两个双链 DNA 分子在 DNA 连接酶的作用下, 连接成为一个杂合双链 DNA。 优 点? 经济省时，操作方便；? 外源片段容易回收；问 题? 载体自身环化 ? 插入片段可双向插入 2.不同限制酶酶切产生黏末端的连接? 载体和目的基因分子上有两个相同的酶切位点? 载体和目的基因只有一个相同的限制酶识别位点? 无相同的限制酶识别位点，有同尾酶Sal片段（CAGCTG） Xho 片段(GAGCTC) ? 若
2、均不是以上情况呢？二、平末端的连接平末端连接(blunt end ligation)：在 T4DNA 连接酶的作用下，将两个具有平末端的双链DNA 分子连接成杂种 DNA 分子。优 点可以用 T4 连接酶连接任何 DNA 平端 ? 5-突出粘性末端的补齐可用 Klenow 聚合酶补齐? 3-突出粘性末端的削平可用 T4 DNA 聚合酶削平 主 要 问 题连接效率低? 高浓度的底物和 T4 DNA 连接酶? 添加凝聚剂：如聚乙二醇不易回收外源 DNA 片断双向插入三、修饰黏末端连接? 同聚物加尾法：同聚物加尾(homopolymer tails joining)连接就是利用末端转移酶在载体及外源
3、双链 DNA 的 3端各加上一段寡聚核苷酸, 制成人工粘性末端, 然后在 DNA 连接酶的作用下, 连接成为重组的 DNA。 优 点不会发生自身环化作用；连接效率较高；存在问题? 操作繁琐? 外源片段难回收? 可能会影响基因表达? 衔接物连接法衔接物（linker）是指用化学方法合成的一段由 812 个核苷酸组成、具有一个或数个限制酶识别位点的平末端的双链寡核苷酸短片段。? DNA 接头法：DNA 接头（adapter）是一类人工合成的一头具某种限制酶粘性末端另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸短片段。? 讨论如何将一平末端的 DNA 片段与 BamH形成的粘性末端连接？（P156.4）四、PC
4、R 产物的连接1.限制性内切酶酶切位点引入法? 在引物上添加或引入限制酶识别位点，使 PCR 产物两端带有相应的限制酶识别位点，进一步与相应载体进行连接。！注意添加保护序列? Primer1:5 GCGGggatccTATGGTGAGCAAGGGCGAGGA? Primer2:5 GCGGggatccTCTTGTACAGCTCGTCCATGCC引入的酶切位点是单一的（2）利用突变在引物 5端引入酶切位点通过在 PCR 引物序列的 5端突变一个或几个碱基，创造出限制酶识别位点的方法。2.T-A 克隆利用嗜热聚合酶如 Taq 聚合酶的模板非依赖性末端转移酶活性(在 7075活性高)，使 PCR 产
5、物的 3末端加一个 A 的粘性端，将其直接克隆至 3粘性末端含一个 T 的线性克隆载体中.? T 载体的构建： ? 用限制性内切酶如 XcmI, HphI, 与 MobII 酶切产生 3末端未配对的 T； ? 应用末端转移酶与双脱氧 TTP 加入一个突出的 T 残基到线形化载体的 3末端。 ? 应用不依赖末端的 Taq DNA 聚合酶的末端转移酶活性在线形化载体的 3末端出的羟基基团上催化连接上一个 T 碱基。 五、Gateway 载体构建系统Gateway 技术：一种克隆操作平台：把目的基因克隆到入门载体（Entry Vector）后，就不用依赖限制性内切酶，而靠载体上存在的特定重组位点和重
6、组酶，高效、快速地将目的基因克隆到其它的受体载体（Destination Vector，目的载体）上。Gateway 技术的灵活性：? 整合后的附着位点为attL（BOP ）attR（POB ）? 整合位点-attB attP切除位点-attL attR? 整合过程需要介导蛋白和重组位点。第二节、重组体导入细菌细胞? 转化(transformation):受体细胞捕获并表达质粒 DNA 的生命过程；? 转染(transfection):受体细胞捕获并表达噬菌体 DNA 的生命过程；? 转导(transduction):重组体包装成噬菌体导入受体细胞的过程。一、大肠杆菌感受态的制备 感受态：细胞
7、处于能摄入核酸分子时的生理状态就称为感受态。1970 年 Mandel 和 Higa 发现用 CaCl2 处理过的大肠杆菌能够吸收噬菌体 DNA。此后不久，Cohen 等人用 CaCl2 法实现了质粒 DNA 转化大肠杆菌的感受态细胞，操作原理如下：? 将处于对数生长期的细菌置入 0的 CaCl2 低渗溶液中，使细胞膨胀，再加入 DNA，Ca2+与 DNA 结合形成抗 DNase 的羟基-磷酸钙复合物，并粘附在细菌细胞膜的外表面上；经短暂的 42热脉冲处理后，细菌细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，随之出现许多间隙，致使通透性增加，DNA 分子便趁机进入细胞内。二、重组 DNA 导入大肠杆菌重组 D
8、NA 转移到大肠杆菌细胞内的过程1.吸附：双链 DNA 分子吸附在受体菌表面2.转入：双链 DNA 分子解链，单链 DNA 分子进入受体菌，另一链降解；3.自稳：外源质粒 DNA 分子在细胞内又复制成双链环状；4.表达：供体基因随同复制子同时复制，并被转录、翻译。思考题：试述 DNA 片段的体外连接方式？练习题：打算将一个 cDNA 克隆到一个表达载体，以便在 Ecoli 中大量制备相应的蛋白质。这个 cDNA 的两侧具有 BamHI 的位点，因此计划将它从 BamH的位点插入载体中。实验严格地按照克隆手册中的方法进行：载体用 BamHI 切割以后，立即用碱性磷酸酶处理除去5磷酸；接着将处理过
9、的载体同用 BamHI 切割的 cDNA 片段混合，加入 DNA 连接酶后进行温育，连接之后，将 DNA 同已处理过的可以接受 DNA 的细菌感受态细胞混合。最后，将混合物涂布在加有抗生素固体培养基的平板上。由于载体上带有抗生素的抗性基因，所以，转化的细菌能够存活。实验中同时设置了 4 个对照：? 对照 1： 将未同任何载体接触过的细菌细胞涂布在培养平板上；? 对照 2： 将未切割载体转化过的细菌细胞涂布在培养平板上；? 对照 3： 将经切割(但未用碱性磷酸酶处理)并用连接酶连接(但没有 cDNA 片段)的载体转化过的细菌细胞涂布在培养乎板上；? 对照 4： 将经切割(并用碱性磷酸酶处理过)并
10、用 DNA 连接酶连接(但没有 cDNA 片段)的载体转化过的细菌细胞涂布在培养子板上。在进行第一次实验时，感受态细胞不是自己制备的，结果，在所有的平板上都长出了多到无法计数的菌落。在第二次实验中，自己制备感受态细胞，但这一次，所有的平板上都没有菌落生长。接着又进行了第三次实验，这次得到了转化子。从实验平板上挑出 12个菌落，分离了质粒 DNA，并用 BamHI 进行切割，其中 9 个克隆产生大小同载体一样的单一的一条带，另三个克隆中切出一个 cDNA 片段，实验终于获得成功。? cDNA 克隆的结果实验结果 制备的样品 1 2 3对照 1 只有细胞 TMTC 0 0对照 2 未切的载体 TMTC 0 1000对照 3 省去磷酸酶处理，无 cDNA TMTC 0 435对照 4 无 cDNA TMTC 0 25实验样品 TMTC 0 34? 注：TMTC=too many to count，多到无法计数。? (1)你如何看待第一次的实验结果?对照 1 的目的是什么? (2)影响第二次实验结果的原因是什么?对照 2 的作用何在? (3)对照 3 和 4 各有什么作用? (4)为什么要用碱性磷酸酶处理载体?
