1、1.某学生在用 EcoRI 切割外源 DNA 片段时，出现了星号活性，请分析可能的原因并提出解决的方案? （6 分）答：(1)导致星号活性因素： a 较高的甘油浓度 b 酶与底物 DNA 比例过高（不同酶情况不同，通常为100v/micHo.g ） c 低盐浓度（PH8.0） e 存在有机溶剂（如 DMSO .乙醇（9 ）.乙烯乙二醇.二甲基乙酰胺.二甲基甲酰胺.sulphalane(12)等） f用其他二价离子代替 Mg2+(Mn2+.Cu2+.Co2+.Zn2+等)（2）抑制星号活性的方法： a 尽量用较少酶进行完全消化反应，这样可避免过度消化及过度的甘油浓度. B 尽量避免有机溶剂（如制
2、备 DNA 时二乙醇）污染 c 将离子浓度提高到 100150mM（若酶活性不受离子浓度影响） d 将反应缓冲液 PH 值降到 7.0 e 二价离子用 Mg2+3、目的基因与启动子拼接后，重组分子若不表达，应如何分析？（10 分）答：a.目的基因的表达方式，细胞内表达或者分泌细胞外，如果蛋白为分泌性，那么细胞内检测不到表达，或者表达很少B.分子量大小，分子量大小决定了蛋白半衰期，因而检测需要延长C.目的基因的抗体特异性不好则很难以检测表达D.许多表达宿主自身有自己的蛋白酶，会将你的产物降解，也可能因为修饰系统不同，使得产物的活性不高或者没有。E.如果宿主菌与蛋白来源菌不同也有可能由于密码子使用
3、偏好性不同导致不表达.4 蓝白斑筛选法为什么也会有假阳性?答：蓝白斑筛选法出现假阳性的原因：-半乳糖苷酶的 N 末端是非必须的，可以进行修饰，并不影响酶的活性或 肽的互补性。如果插入的外源 DNA 引起 肽的可读框的改变或者插入片段在正确的可读框中含有终止密码的话，就形成白色噬菌斑。如果插入 DNA 的碱基数正好是 3 的倍数，或者插入的 DNA 中不含有终止子的话，仍会形成蓝白菌落。这种插入物的长度可达几百个碱基对（1 ）蓝白斑筛选法原理：某些质粒带有大肠杆菌的半乳糖甘酶基因片段，在半乳糖甘酶基因区外又另外引入了一段含有多种单一限制性酶切位点的 dna 序列，这些位点上如果没有克隆外源性 d
4、na 片段，在质粒导入 Lac 的大肠杆菌后质粒携带的半乳糖苷酶基因将正常表达，与大肠杆菌的半乳糖苷酶基因互补，产生有活性的半乳糖苷酶，加入底物 Xgal 和诱导剂 IPTG 后出来蓝色菌落；如果在多克隆位点上插入外源基因，则使 LacZ基因灭火，不能生成半乳糖苷酶，结果菌落出现白色，由于这种颜色标志，重组与非重组体的区分一目了然。(2)假阳性的原因：不一定就是目的基因5、当两种限制性内切核酸酶的作用条件不同时，若要进行双酶切，应采取什么措施? 为什么? （8 分）答：1.同步双酶切：选择能让两种酶同时作用的最佳缓冲液是非常重要的一步，因为在非最佳缓冲条件下时的切割速率会减缓2 .分步酶切：应
5、从反应要求盐浓度低的酶开始，酶切完毕后再调整盐浓度直至满足第二种酶的要求，然后加入第二种酶完成双酶切3.使用配有特殊缓冲液的酶进行双酶切：在大多数情况下，采用标准缓冲液的酶也能在这些特殊缓冲液中进行酶切，这保证了对缓冲液有特殊要求的酶也能良好工作。由于内切酶在非最佳缓冲液中进行酶切反应时，反应速度会减慢，因此需要增加酶量或延长反应时间6、用哪些方法可以检测转基因植物中的外源基因，如何检测？（8 分）答：1、外源基因整合到植物基因组的检测SOUTHERN 杂交、多聚酶链式反应、报告基因检测等2、外源基因在植物基因组中转录检测NORTHERN 杂交是 DNA-RNA 杂交，它是检测特定组织或器官中
6、外源基因是否转录出MRNA 一种有用的方法3、外源基因在植物基因组中翻译的检测WESTERRN 杂交则是蛋白质间的杂交，它是检测特定组织或器官中外源基因是否有翻译出特定蛋白质的方法4、筛选标记基因，如抗菌素抗性基因，抗除草剂基因等来进行，当受体细胞本身不含此类基因时，导入含有或构建有此类基因的供体后，只要起在受体中转化成功，便可用抗菌素或除草剂等进行筛选。5 利用导入外源基因所表达的特殊性状直接鉴定；7、请你自己设计一个抗除草剂 X 的转基因植物，并写出主要操作步骤。 （10 分）答：1.目的基因的获得：找到抗除草剂 x 基因用限制性内切酶进行酶切，在进行 pcr2.转化：可以采用介导转化法，
7、基因枪介导转化法，花粉管通道法3.筛选并检测：利用含有重组基因的植株的抗性进行筛选。已知某蛋白基因 CDNA 长度为 1.8kb,两端的核酸序列如下：ATGAGTGCCAATAGCCCGACAGGAAACGATCCCCATGTATTTGGTATTCAA-GAGCGCAAGTAGCACGCCCTCTTCTACTACAATGTCATAA3经分析发现该基因内部有如下限制性内切酶位点：AflII CTTAAG， EcoRV GATATC，XmaI CCCGGG，EcoRI GAATTC，SmaI CCCGGG， SacI GAGCTC， SalI GTCGAC， HindII AAGCTT， NotI
8、 GCGGCCGC。MCS：BamHI： G|GATCC； SmaI： CCC|GGG； SacI： G|AGCTC；SalI：G|TCGAC； SphI： G|CATGC； XbaI ：T|CTAGA ；PstI：C|TGCAG； HindIII： A|AGCTT； KpnI：G|GTACC。现要把该基因克隆至表达载体 pQE-30 中，并转化到大肠杆菌中表达并规模化生产。1） 写出可用的酶切位点；2） 设计出 PCR 引物；3） 设计 PCR 扩增的程序；4） 详述克隆、筛选、表达纯化及其规模化的过程。（1 ）答：BamHI PstI XbaI KpnI SphI HindIII （2 ）
9、 答： PCR 引物： 设计 PCR 引物 上游引物：53GGG / GGATCC(BamHI)/ATGAGTGCCAATAGCCGACAGTm =4（G+C）+2(A+T)=68下游引物: 53GGG/CTGCAG(PstI)/TTATGACATTGTAGTAGAAGAGTm=4(G+C)+2(A+T)=58（3 ）答：PCR 扩增程序：1 预变性：双链 DNA 在 94 度 左右预变性 5min2 变性：94 度下双链 DNA 变性 30s3 退火：55 度退火 30s4 延伸：72 度延伸 90s5 最后 72 度 延伸 10min 循环三十次（4 ）答：克隆：将载体用 BamHI 酶和
10、 Xbal 酶进行双酶切，然后将目的基因在体外用 DNA连接酶与载体连接，导入事先做好的感受态细胞中，培养在含有氨苄青霉素的培养基上筛选：以为载体上带有抗氨苄青霉素标记基因，所以能在培养基上存活的即为转化子表达纯化：将筛选出来的菌株进行培养，得到的产物进行分离纯化，因为载体上含有6 个组氨酸基因，所以可以用亲合层析的方法进行提纯规模化：将得到的单一菌株大规模培养，可以采用连续培养的方法进行，可以得到大量产物1、 限制性内切酶分为几类？基因工程中常用的为哪一类？有何特点？（6 分）答：1分三类：为限制性内切酶 I 型.II 型.III 型.2基因工程中常用的为 II 型。特点：识别双链 DNA
11、分子中 48 对碱基德特定序列，大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧，识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构。2、什么是 cDNA 文库(complementDNAlibrary)?同基因组文库有何差别? 答：（1）cDNA 文库是通过对一系列 mRNA 反转录并对特殊的克隆予以筛选得到的，cdna文库是以某一生物的总 mRNA 为模板，在无细胞系统中，在反转录酶作用下首先合成一条互补的 DNA 即第一链，破坏 RNA 模板后，在以第一链为模板合成第二链，得到双链的DNA 即 cDNA，选用适合的载体，将合成的 cDNA 重组导入寄主细胞，经筛选得到的 cDNA克隆群为 cDNA 文库（2
12、）差别：基因组文库含有全部基因，cDNA 文库含有全部蛋白编码的结构基因，cDNA 文库小于基因组文库3、 PCR 的基本原理是什么? 用 PCR 扩增某一基因，必须预先得到什么样的信息? 答：（1）原理：DNA 半保留复制的原理，在体外进行 DNA 的变性，复性和延伸。首先是在 dsDNA 在高温下变性为 ssDNA，然后 DNA 聚合酶以 ssDNA 为模板，利用聚合酶和 dNTPs合成新生的 DNA 互补链，新合成的 dsDNA 经过变性，复性，延伸，如此反复循环，使目标 DNA 以指数形式扩增（2）要已知待扩增目的基因或者 DNA 片段两侧的序列，据该序列化学合成聚合反应必须的双引物。
13、或者至少预先知道，足够合成一对引物的靶 DNA 序列。4、目的基因与启动子拼接后，重组分子若不表达，应如何分析？（10 分）答：a.目的基因的表达方式，细胞内表达或者分泌细胞外，如果蛋白为分泌性，那么细胞内检测不到表达，或者表达很少B.分子量大小，分子量大小决定了蛋白半衰期，因而检测需要延长C.目的基因的抗体特异性不好则很难以检测表达D.许多表达宿主自身有自己的蛋白酶，会将你的产物降解，也可能因为修饰系统不同，使得产物的活性不高或者没有。E.如果宿主菌与蛋白来源菌不同也有可能由于密码子使用偏好性不同导致不表达.5、为什么 pUC 系列的载体与外源基因形成的重组体可以用蓝白斑实验进行筛选？答：p
14、UC 系列载体带有大肠杆菌的 LacZ基因片段，在该基因内部含有多种限制性内切酶位点，在这些位点上如果没有克隆外源 DNA 片段，在质粒导入 Lac 的大肠杆菌后质粒携带的半乳糖苷酶基因将正常表达，与大肠杆菌的半乳糖苷酶基因互补，产生有活性的半乳糖苷酶，加入底物 Xgal 和诱导剂 IPTG 后出来蓝色菌落；如果在多克隆位点上插入外源基因，则使 LacZ基因灭火，不能生成半乳糖苷酶，结果菌落出现白色，由于这种颜色标志，重组与非重组体的区分一目了然。6、如果知道某一基因的功能及其相应的蛋白质的氨基酸序列组成，可以通过何种方法克隆该基因? 答：先从表达该蛋白质的细胞中提取总的 mRNA，根据蛋白质
15、的氨基酸序列推测其 dna 序列，该序列制成探针，然后与提取出的 mRNA 杂交，能够杂交的即可选出，利用反转录的方法合成 cDNA，再用 pcr 技术克隆该基因。7、欲将一真核生物的结构基因克隆后转移到原核生物(如 Ecoli)中进行表达，克隆时应注意哪些问题? （ 10 分）答：真核生物的结构基因含有内含子，转移的的目的基因要去除内含子，原核生物与真核生物有密码子偏爱性。1、某一质粒载体具有 Tetr 和 Kanr 的表型，在 Kan 抗性基因内有一 Bgl I 的切点。现用Bgl I 切割该载体进行基因克隆，问：(1)转化后涂皿时应加什么样的抗生素 ?(2)培养后长出的菌落具有什么样的抗
16、性基因型?(3)如何利用抗性变化筛选到含有插入片段的重组体?（6分）答：1含 Tet 抗性的抗生素2.Tet(r)+Kan(r)+Tet(r) Tet(r)Kan(s)和 Tet(r)Kan(r)3 先将转化液涂皿在 Tet 平板，再将 Tet 平板上转化子影印在含 Tet,Kan 的平板上在 Tet 平板上生长，但在 Tet,Kan 平板上不生长的转化子即为含有插入片段的重组体2、简述差异杂交的原理及基本思路？答：原理：差异杂交是将基因组文库的重组噬菌体 dna 转移至硝酸纤维素摸上，用两种混合的不同 cdna 探针分别于滤膜上的 dna 杂交，分析两张滤膜上对应位置杂交信息以分离差异表达的
17、基因。适用于基因组不太复杂的真核生物表达基因的比较，假阳性绿较低，但对基因组非常复杂的盐酸核生物，则因工作量太大，表达的序列所占百分比较低，价值不大基本思路：将一种细胞的 mRNA 反转录生成 cRNA 第一链，然后将该 cRNA 与另一种细胞过量的 mRNA 进行杂交，第一种细胞中如果存在不同于第二种细胞的特殊基因表达，则会产生该特殊基因的 mRNA 和反转录形成的 cDNA，该 cDNA 不能与第二种细胞的 mRNA 形成杂交体，该杂交体反应产物再经羟基磷灰石柱层析，便于分离纯化出未形成杂交体的 cDNA，它代表前一种细胞中特殊基因，以该链作为探针后，第一种细胞的 cDNA 文库的两套重复
18、拷贝杂交，跟探针能够杂交克隆是在组织细胞中特异表达的 mRNA，再对这样的克隆进行测序比较，鉴定，就分离到这种组织，特异表达的基因，所有包含重组体的菌落，阳性反应在 X 射线上呈现黑色的点。4、 PCR 引物设计引入酶切位点时，为什么需在酶切位点后加上一些碱基？（6答：pcr 引物设计引入酶切位点时需在酶切位点后加上 2-3 个 GC 碱基作为保护碱基，其可以保护 pcr 引物被酶降解，还为限制性内切酶的切割充当一个支点，作用点使得切割更容易。5、当两种限制性内切核酸酶的作用条件不同时，若要进行双酶切，应采取什么措施? 为什么? （10 分）答：1.同步双酶切：选择能让两种酶同时作用的最佳缓冲
19、液是非常重要的一步，因为在非最佳缓冲条件下时的切割速率会减缓2 .分步酶切：应从反应要求盐浓度低的酶开始，酶切完毕后再调整盐浓度直至满足第二种酶的要求，然后加入第二种酶完成双酶切3.使用配有特殊缓冲液的酶进行双酶切：在大多数情况下，采用标准缓冲液的酶也能在这些特殊缓冲液中进行酶切，这保证了对缓冲液有特殊要求的酶也能良好工作。由于内切酶在非最佳缓冲液中进行酶切反应时，反应速度会减慢，因此需要增加酶量或延长反应时间6、目前常用的转基因方法有哪些，各有何特点？答：（1）.Ca 离子诱导的转化，Ca 离子与细胞外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经过热脉冲发生收缩作用，使得细胞膜出现空隙，细菌细胞此时的
20、状态叫感受态。（2 ）电穿孔转化：将待转化的质粒或 dna 重组连接液加在电穿孔转换仪的样品池中，两级施加高压电场，在强大电场的作用下，细菌细胞壁和细胞膜产生缝隙，质粒或 dna 重组分子进入，特点是（3 ）细菌原生质体的转化：革兰氏阴性菌如枯草杆菌接纳外源 dna 的主要屏障是细胞壁，因而这类细菌通常用原生质体转化的方法转移质粒或重组 dna 分子，酵母菌，霉菌，植物细胞也可用此法。7、请你自己设计一转抗菌肽鱼，并写出主要操作步骤。 （ 12 分）答：1.抗菌肽基因的获得：寻得含有抗菌肽基因的生物体并提取出抗菌肽基因，再将这段基因连接到载体上，获得含有目的基因的载体2.选择基因转移的受体细胞
21、，这种受体细胞需要是全能细胞，如生殖细胞受精卵，胚胎干细胞，3.将获得的含有目的基因的载体用转基因的方法导入受体细胞，如鱼受精卵中4.培养转化的受精卵，产生转基因鱼，5.检验试验鱼是否产生抗菌肽表型1、载体的功能与应具备的条件答。运送外源基因高效转入受体细胞为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因的扩增或表达提供必要的条件具备的条件：具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点具有较高的外源 DNA 的载装能力具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点具有合适的筛选标记1 质粒的基本特征 自主复制性不相容性可转移性携带特殊的遗传标记质粒的分离纯化 Cscl 密度梯度
22、离心法 质粒 DNA 纯度高、周期长，设备要求高，溴乙啶污染 沸唱浴法 质粒 DNA 纯度低，快速，操作简便 碱溶法蓝-白筛选的原理答。某些质粒带有大肠杆菌的半乳糖苷酶基因片段，在半乳糖苷酶基因的基因区外又另外引入了一段含有单一限制酶位点的 DNA 序列。这些位点上如果没有克隆外源性 DNA 片段，在质粒被导入 lac-的大肠杆菌后，质粒携带的半乳糖苷酶基因将正常表达，与大肠杆菌的半乳糖苷酶基因互补，产生有活性的半乳糖苷酶，假如人工底物 X-gal 和诱导剂 IPTG 后，出现蓝色的菌落。如果在多克隆位点上插入外源 DNA 片段，将使 lacZ 基因灭活，不能生成半乳糖苷酶，结果菌落出现白色。
23、由于这种颜色标志，重组克隆和非重组克隆的区分一目了然。4。受体细胞应具备的条件限制性缺陷型 外切酶合内切酶活性缺陷重组整合缺陷型 用于基因扩增或高效表达的受体细胞具有较高的转化效率 具有与载体选择标记互补的表型 感染寄生缺陷型 防止重组细菌扩散污染， ，生物武器除外5。影响杂交的因素答。核酸分子的浓度和长度：核酸浓度越大，复制性速度越快。探针长度应控制在 50-300 个碱基对为好温度：温度过高不利于复性，而温度过低，少数碱基配对形成的局部双链不易解离，适宜的温度是较 TM 值低 25 度离子强度：在低离子强度下，核酸杂交非常缓慢，随着离子强度的增加， ，杂交反应率增加。高浓度的盐使碱基错配的
24、杂交体更稳定，所以进行序列不完全同源的核酸分子杂交时必须维持杂交反应液中的盐浓度合洗膜液中的盐浓度。杂交液中的甲酰胺：甲酰胺能降低核酸杂交的 TM 值。它有以下优点：在低温下探针更稳定，能更好的保留非公价结合的核酸。 核酸分子的复杂性：是指存在于反应体系中的不同顺序的总长度。两个不同基因组DNA 变性后的相对杂交速率取决于样品浓度绝对一致时的相对复杂性。6。克隆 DNA 序列检测限制性酶切图谱法菌落噬菌斑杂交法DNA 序列分析法7。外源基因产物检测蛋白质生物功能测定法：a。淀粉酶目的基因的鉴定 b。抗菌性抗性基因的鉴定 c。DNA结合蛋白编码基因的鉴定 d。杂交释放转译鉴定蛋白质生物结构鉴定法
25、：a。放射免疫原位杂交鉴定 b。免疫沉淀法聚丙烯酰胺凝胶电泳法：如果待筛选鉴定的目标蛋白既不能测定生物活性，有无现成的抗体使用，则可采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法进行粗略的筛选8。菌落噬菌斑原位杂交法答。工作原理：根据克隆的目的基因或 DNA 片段的同源序列设计并合成探针以此搜寻筛选含有目的基因的目的重组子基本操作：用硝酸纤维素薄膜影印克隆平板用 0.4N 的 NaOH 溶液浸泡影印薄膜用 SSC 溶液浸泡清洗影印薄膜80C 烘干固定影印薄膜薄膜置于含有探针的杂交溶液中保温用 SSC-SDS 液洗涤杂交薄膜 用 X 光胶片覆盖薄膜感光基因工程是指重组 DNA 技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下
26、游技术两大组成部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组 DNA 技术） ；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。基因工程的支撑技术核酸凝胶电泳技术、核酸分子杂交技术、细菌转化转染技术、DNA 序列分析技术寡核苷酸合成技术、基因定点突变技术、聚合酶链反应（PCR）技术用于核酸操作的工具酶：限制性核酸内切酶、DNA 连接酶、DNA 聚合酶、核酸酶、核酸修饰酶限制性核酸内切酶的发现及其生物功能识别双链 DNA 分子中的特定序列，并切割 DNA 双链主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来 DNA 的入侵细菌的限制与修饰作用影响限制性核酸内切酶活性
27、的因素核酸内切酶的缓冲液性质：高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端 pH 值等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即所谓的 Star activity 现象 载体的功能运送外源基因高效转入受体细胞、为外源基因提供复制能力或整合能力、为外源基因的扩增或表达提供必要的条件载体应具备的条件具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性） 具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点 具有较高的外源 DNA 的载装能力 具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点 具有合适的筛选标记 受体细胞应具备的条件限制性缺陷型 外切酶和内切酶活性缺陷（recB-，recC-，hsdR-） 重组整合缺陷型
28、 用于基因扩增或高效表达的受体细胞（recA-） 具有较高的转化效率具有与载体选择标记互补的表型感染寄生缺陷型 防止重组细菌扩散污染，生物武器除外 基因工程的操作过程A DNA 的体外重组（切、接） B 重组 DNA 分子的转化和扩增（转、增） C 转化子的筛选和鉴定（检）重组率的定义 重组率 = 含有外源 DNA 的重组分子数 / 载体分子总数Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化Ca2+诱导的完整细胞的转化适用于革兰氏阴性细菌（如大肠杆菌等） ，其原理是 Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，细菌细胞此时的状态叫做感受态 大肠杆菌感受态细胞的制备
29、：100 ml 菌体培养至 OD600 = 0.5，离心收集菌体 用 10 ml 冰冷的 10 mM CaCl2 溶液悬浮菌体，离心收集菌体用 1 ml 冰冷的 75 mM CaCl2 溶液悬浮菌体 冰浴放置 12 - 24 小时，备用 大肠杆菌感受态细胞的质粒转化：取 100 ml 感受态细胞，加入相当于 50 ng 载体的重组 DNA 连接液，混匀冰浴放置半小时 在 42 保温 2 分钟（热脉冲） 快速将转化细胞转移至冰浴中放置 1 - 2 分钟 加入 1 ml 新鲜培养基，于 37培养 1 小时（扩增） 涂在合适的固体培养基平板上进行筛选 电穿孔转化将待转化的质粒或 DNA 重组连接液加
30、在电穿孔转化仪的样品池中，两极施加高压电场。在强大电场的作用下，细菌细胞壁和细胞膜产生缝隙，质粒或 DNA 重组分子便可进入细胞内电穿孔转化法操作简单，而且几乎对所有含细胞壁结构的受体细胞均有效，但转化效率差别很大同样的原理，电穿孔法也可用于质粒消除实验转化率的定义转化率是衡量转化效率的重要指标，其定义为：每微克载体 DNA 在最佳转化条件下进入受体细胞的分子数。由于在一般的转化实验规模下，每个受体细胞最多只能接受一个载体分子，因此转化率的定义也可以表征为：每微克载体 DNA 转化后，受体细胞接纳 DNA的个数，即克隆数（在筛选时，未接纳载体或重组子的受体细胞不长）扩增操作的目的增殖转化细胞，
31、使得有足够数量的转化细胞用于筛选程序 扩增和表达载体分子上的标记基因，便于筛选 表达外源基因，便于筛选和鉴定 转化子的筛选和鉴定（检）载体遗传标记检测 克隆 DNA 序列检测 外源基因产物检测抗药性筛选法 营养缺陷型筛选法 显色筛选法 限制性酶切图谱法 DNA 序列分析法( 测序)菌落噬菌斑原位杂交法菌落或噬菌斑原位杂交法的工作原理是根据克隆的目的基因或 DNA 片段的同源序列设计并合成探针，以此搜寻筛选含有目的基因的目的重组子。其中，DNA 同源序列之间的特异性互补杂交是该技术的基本理论依据 菌落原位杂交法的基本操作：用硝酸纤维素薄膜影印克隆平板 用 0.4N 的 NaOH 溶液浸泡影印薄膜
32、 用 SSC 溶液浸泡清洗影印薄膜 80烘干固定影印薄膜 薄膜置于含有探针的杂交溶液中保温 用 SSC-SDS液洗涤杂交薄膜 用 X 光胶片覆盖薄膜感光 聚丙烯酰胺凝胶电泳法如果待筛选鉴定的目标蛋白既不能测定生物活性，又无现成的抗体使用，则可采用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行粗略的筛选基因文库（gene library or gene bank）从特定生物个体中分离的全部基因，这些基因以克隆的形式存在（人工构建） 。根据构建方法的不同，基因文库分为： 基因组文库（含有全部基因） cDNA 文库（含有全部蛋白质编码的结构基因） 大肠杆菌表达外源基因的优势全基因组测序，共有 4405 个开放型阅读框架基因
33、克隆表达系统成熟完善繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定被美国 FDA 批准为安全的基因工程受体生物大肠杆菌表达外源基因的劣势缺乏对真核生物蛋白质的复性功能 缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白 细胞周质内含有种类繁多的内毒素核糖体结合位点外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于转录启动的频率，而且在很大程度上还与 mRNA 的翻译起始效率密切相关。大肠杆菌细胞中结构不同的 mRNA 分子具有不同的翻译效率，它们之间的差别有时可高达数百倍。mRNA 翻译的起始效率主要由其 5 端的结构序列所决定，称为核糖体结合位点（RBS） 大肠杆菌核糖体结合位点包
34、括下列四个特征结构要素：位于翻译起始密码子上游的 6-8 个核苷酸序列 5 UAAGGAGG 3，即 Shine-Dalgarno（SD）序列，它通过识别大肠杆菌核糖体小亚基中的 16S rRNA 3端区域 3 AUUCCUCC 5并与之专一性结合，将 mRNA 定位于核糖体上，从而启动翻译；翻译起始密码子，大肠杆菌绝大部分基因以 AUG 作为阅读框架的起始位点，但有些基因也使用 GUG 或 UUG 作为翻译起始密码子；SD 序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成；基因编码区 5 端若干密码子的碱基序列 密码子偏爱性对外源基因表达的影响由于原核生物和真核生物基因组中密码子的使用频率具有较大程
35、大的差异性，因此外源基因尤其是高等哺乳动物基因在大肠杆菌中高效翻译的一个重要因素是密码子的正确选择。一般而言，有两种策略可以使外源基因上的密码子在大肠杆菌细胞中获得最佳表达： 外源基因全合成 同步表达相关 tRNA 编码基因外源基因全合成按照大肠杆菌密码子的偏爱性规律，设计更换外源基因中不适宜的相应简并密码子，重组人胰岛素、干扰素以及生长激素在大肠杆菌中的高效表达均采用了这种方法 同步表达相关 tRNA 编码基因对于那些含有不和谐密码子种类单一、出现频率较高、而本身分子量又较大的外源基因而言，则选择相关 tRNA 编码基因同步克隆表达的策略较为有利。包涵体及其性质在某些生长条件下，大肠杆菌能积
36、累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体（Inclusion Bodies，IB ） 。富含蛋白质的包涵体多见于生长在含有氨基酸类似物培养基的大肠杆菌细胞中，由这些氨基酸类似物所合成的蛋白质往往会丧失其理化特性和生物功能，从而集聚形成包涵体。由高效表达质粒构建的大肠杆菌工程菌大量合成非天然性的同源或异源蛋白质，后者在一般情况下也以包涵体的形式存在于细菌细胞内。除此之外，包涵体中还含有少量的 DNA、RNA 和脂多糖等非蛋白分子包涵体表达形式的优点：能简化外源基因表达产物的分离操作 包涵体的水难溶性及其密度远大于其它细胞碎片和细胞
37、成分，菌体经超声波裂解后，直接通过高速离心即可将重组异源蛋白从细菌裂解物中分离出来能在一定程度上保持表达产物的结构稳定 在形成包涵体之后，大肠杆菌的蛋白酶降解作用基本上对异源重组蛋白的稳定性已构不成威胁包涵体表达形式的缺点：以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了原有的生物活性，必须通过有效的变性复性操作，才能回收得到具有正确空间构象（因而具有生物活性）的目标蛋白，因此包涵体变复性操作的效率对目标产物的收率至关重要。然而，这也是一个技术难题，尤其当目标蛋白分子中的 Cys 残基数目较高时，体外复性蛋白质的成功率相当低，一般不超过 30%包涵体的复性与重折叠的主要任务是：将多肽链中被拆开的游离巯基重新折
38、叠 通过次级键的形成使蛋白质复性分泌型异源蛋白的表达在大肠杆菌中表达的异源蛋白按其在细胞中的定位可分为两种形式：即以可溶性或不溶性（包涵体）状态存在于细胞质中；或者通过运输或分泌方式定位于细胞周质，甚至穿过外膜进入培养基中。蛋白产物 N 端信号肽序列的存在是蛋白质分泌的前提条件分泌表达形式的优点：1 目的蛋白稳定性高 重组人胰岛素原若分泌到细胞周中，其稳定性大约是在细胞质中的 10倍 2 目的蛋白易于分离 3 目的蛋白末端完整 相当多的真核生物成熟蛋白 N 端并不含有甲硫氨酸残基。当这些真核基因在大肠杆菌中表达时，蛋白质 N 端的甲硫氨酸残基往往不能被切除。如若将外源基因与大肠杆菌的信号肽编码
39、序列重组在一起，一旦分泌型表达，其N 端的甲硫氨酸残基便可在信号肽的剪切过程中被有效除去 分泌表达形式的缺点：相对其它生物细胞而言，大肠杆菌的蛋白分泌机制并不健全。外源真核生物基因很难在大肠杆菌中进行分泌型表达，少数外源基因既便能分泌表达，但其表达率通常要比包涵体方式低很多，因此目前用于产业化的异源蛋白分泌型重组大肠杆菌尽管有，但并不普遍融合型异源蛋白的表达除了直接表达异源蛋白外，还可将外源基因与受体菌自身的蛋白质编码基因拼接在一起，并作为一个开放型阅读框架进行表达。由这种杂合基因表达出的蛋白质称为融合蛋白。在这种融合蛋白结构中，通常受体细菌的蛋白部分位于 N 端，异源蛋白位于 C 端。通过在
40、DNA 水平上人工设计引入的蛋白酶切割位点或化学试剂特异性断裂位点，可以在体外从纯化的融合蛋白分子中释放回收异源蛋白以融合形式表达目的蛋白的优缺点目的蛋白稳定性高 尤其对分子量较小的多肽效果更佳目的蛋白易于分离 利用受体蛋白成熟的抗体、配体、底物进行亲和层析，可以快速获得纯度较高的融合蛋白目的蛋白表达率高 与受体蛋白共用一套完善的表达元件目的蛋白溶解性好 由于受体蛋白的存在，融合蛋白往往能在胞内形成良好的空间构象，且大多具有水溶性目的蛋白需要回收 融合蛋白需要裂解和进一步分离，才能获目的蛋白。在实际生产中，产品主要的成本往往就在该工段工程菌遗传不稳定性的产生机制受体细胞中的限制修饰系统对外源重
41、组 DNA 分子的降解外源基因的高效表达严重干扰受体细胞正常的生长代谢 能量、物质的匮乏和外源基因表达产物的毒性诱导受体细胞产生应激反应：关闭合成途径，启动降解程序重组质粒在受体细胞分裂时的不均匀分配 这是重组质粒逃逸的基本原因受体细胞中内源性的转座元件促进重组分子的缺失重排施加选择压力根据载体上的抗药性标记，向培养系统中添加相应的抗生素 根据载体上的营养缺陷型标记，向培养系统中添加相应的营养组份 培养基复杂，成本较高控制目的基因的过量表达使用可控型启动子控制目的基因的定时表达及表达程度使用可控型复制子控制质粒的定时增殖或降低质粒的拷贝数优化基因工程菌的培养工艺培养基组成：限制培养基比丰富培养基更有利于稳定培养温度： 较低的培养温度有利于重组质粒的稳定
