1、实验五 水五日生化需氧量（BOD 5）的测定1 目的1.1 理解 BOD 的含义及测定条件；1.2 了解水样预处理的道理与预处理方法。2 方法原理生物化学需氧量(BOD)定义为：在规定的条件下，微生物分解存在水中的某些可氧化物质，特别是有机物所进行的生物化学过程所消耗的溶解氧量。该过程进行的时间很长，如在 20培养条件下，全过程需 100 天，根据目前国际统一规定，在 201的温度下，培养五天后测出的结果，称为五日生化需氧量，记为 BOD5，其单位用质量浓度 mg/L 表示。对于一般生活污水和工业废水，虽然含较多有机物，如果样品含有足够的微生物和具有足够氧气，就可以将样品直接进行测定，但为了保
2、证微生物生长的需要，需加入一定量的无机营养盐(磷酸盐、钙、镁和铁盐) 。某些不含或少含微生物的工业废水、酸碱度高的废水、高温或氯化杀菌处理的废水等，测定前应接入可以分解水中有机物的微生物，这种方法称为接种。对于一些废水中存在着难被一般生活污水中微生物以正常速度降解的有机物或含有剧毒物质时，可以将水样适当稀释，并用驯化后含有适应性微生物的接种水进行接种。一般检测水质的 BOD5 只包括含碳有机物质氧化的耗氧量和少量无机还原性物质的耗氧量。由于许多二级生化处理的出水和受污染时间较长的水体中，往往含有大量硝化微生物。这些微生物达到一定数量就可以产生硝化作用的生化过程。为了抑制硝化作用的耗氧量，应加入
3、适量的硝化抑制剂。3 适用范围BOD5 为 21000mg/L 水样，超过 1000mg/L 的水样，应适当稀释。4 主要仪器及设备使用的玻璃仪器皿在实验前应认真清洗，防止油污、沾尘。玻璃器皿干燥后方能使用。常用实验室设备如下：4.1 生化培养箱 温度控制在 20l，可连续无故障运行。4.2 充氧设备 充氧动力常采用无油空气压缩机(或隔膜泵、或氧气瓶、或真空泵 )。充氧流程可分为正压、负压充氧两种流程。4.3 BOD 培养瓶：容积 5501mL。 4.4 样品运输贮藏箱：温度保持 04。4.5 250mL 溶解氧瓶或具塞试剂瓶 26 个。4.6 50mL 滴定管 2 支。4.7 1mL 移液管
4、 3 支，25mL、100mL 移液管各 1 支。4.8 10mL、100mL 量筒各 1 个。4.9 250mL 碘量瓶 2 个。5 试剂采用分析纯试剂。实验用水采用重蒸蒸馏水。5.1 硫酸锰溶液将 MnSO44H2O 480g 或 MnSO42H2O 400g 溶于蒸馏水中，过滤后稀释成 100mL。 (此溶液中不能含有高价锰，试验方法是取少量此溶液加入碘化钾及稀硫酸后溶液不能变成黄色，如变成黄色表示有少量碘析出，即表示溶液中含有高价锰) 。MnO23+2I-+6H+=I2+Mn2+3H2O5.2 碱性碘化钾溶液溶解 500g 氢氧化钠于 300400mL 蒸馏水中，冷至室温。另外溶解 3
5、00g 碘化钾于 200mL 蒸馏水中，慢慢加入已冷却的氢氧化钠溶液，摇匀后用蒸馏水稀释至 1000mL(强碱性溶液腐蚀性很大，使用时注意勿溅在皮肤或衣服上)，如有沉淀，则放置过夜取上清液，贮藏于塑料瓶或棕色试剂瓶中（用棕色试剂瓶时要用橡胶瓶塞） 。5.3 浓硫酸比重 1.84，强酸腐蚀性很大，使用注意勿溅在皮肤或衣服上。5.4 1淀粉指示液称取 2g 可溶性淀粉，溶于少量蒸馏水中，用玻璃棒调成糊状：慢慢加入(边加边搅拌) 刚煮沸的200mL 蒸馏水中，冷却后加入 0.25g 水杨酸或 0.8g 氯化锌 ZnCl2 防腐剂。此溶液遇碘应变为蓝色，如变成紫色表示已有部分变质，要重新配制。5.5
6、(1+1)硫酸溶液将浓硫酸(比重 184)与水等体积混合。5.6 2 mol/L(12 H 2SO4)5.7 盐溶液下述溶液至少可稳定一个月，应贮存在玻璃瓶内，置于暗处。一旦发现有生物滋长迹象，则应弃去不用。5.7.1 磷酸盐：缓冲溶液。将 8.5g 磷酸二氢钾(KH 2PO4)、21.75g 磷酸氢二钾（K 2HPO4） 、33.4g 七水磷酸氢二钠(NaH 2PO47H2O)、和 1.7g 氯化铵（NH 4Cl）溶于 500mL 水中，西是指 1000mL。此缓冲溶液的 pH 应为 7.2。5.7.2 七水硫酸镁：22.5g/L 溶液将 22.5g 七水硫酸镁（MgSO 47H2O）溶于水
7、中，稀释至 1000mL 并混合均匀。5.7.3 氯化钙：27.5g/L 溶液将 27.5g 无水氯化钙（CaCl 2） （若用水合氯化钙，要取相当的量）溶于水，稀释至 1000mL 并混合均匀。5.7.4：0.25g /L 溶液将 0.25g 六水氯化铁（） （FeCl 3H2O）溶解于水中，稀释至 1000mL 并混合均匀。5.8 硫代硫酸钠溶液 C(Na2S2O3)=0.025molL 称取 6.2g 硫代硫酸钠(Na 2S2O35H2O)溶于煮沸放冷的蒸馏水中，加入 0.2g 碳酸钠，用水稀释至1000mL。贮于棕色瓶中，使用前用重铬酸钾，C(16K 2Cr2O7)=0.0250mol
8、L 标准溶液标定，标定方法如下。于 250mL 碘重瓶中，加入 l00mL 蒸馏水和 1g 碘化钾，加入 10.00mL 0.0250 mo1L 重铬酸钾标准溶液，5mL 2 mol/L(12 H2SO4)硫酸溶液(5.6)，密塞，摇匀，于暗处静置 5 min 后，用待标定的硫代硫酸钠溶液滴定至溶液呈淡黄色，加入 1 mL 淀粉溶液，继续滴定至蓝色刚好褪尽为止，记录用量。标定反应：K 2Cr2O7+6KI+7H2SO4=Cr2(SO4)3+312+4K2SO4+7H2O(硫酸铬，绿色)I2+2Na2S2O3=2NaI+Na2S4O6(连四硫酸钠，无色 )C=10.000.0250 V式中 C硫
9、酸钠溶液浓度(mol/L)V硫代硫酸钠溶液消耗量(mL)5.9 氢氧化钠，0.5mol/L 5.10 盐酸，0.5molL5.11 稀释水在 5-20L 玻璃内瓶装入一定量的纯水曝气 2-8h，使稀释水的溶解氧接近饱和；曝气后瓶口盖上两层干净纱布，置于 20培养箱中放置数小时，使水中溶解氧含量不少于 8mg/L。临用前每升水中加入四种营养盐溶液(5.7.1) 、(5.7.2) 、(5.7.3)、(5.7.4)各 lmL 并混合均匀。稀释水的 pH 值为 7.2，应在 8h 内使用完。5.12 接种水如被检验样品本身不含有足够的适应性微生物，应采取下述方法获得接种水。接种温度应在 20l。5.1
10、2.1 城市污水，一般采用住宅区生活污水，过滤后在 20培养箱内放置一昼夜，取上清液作为接种水。5.12.2 待测样品经生化处理构筑物的出水处的出水。5.12.3 当工业废水中含有难降解有机物时，取该工业废水排放口下游 3-8Km 处的水作为做接种水；如无此种水源采用驯化菌种的方法在实验室培养含有适应于待测样品的接种水，建议采用如下方法：取中和或适当稀释后的该水样进行连续曝气，每天加少量新鲜水样。同时加入适量表层土壤、花园土壤或生活污水，使能适应水样的微生物大量繁殖。当水中出现大量絮状物，或分析其化学需氧量的降低值出现突变时，表明适应的微生物已经繁殖，可用做接种水。一般驯化过程需要 3-8d。
11、5.13 接种的稀释水根据需要和接种水的来源，向每升稀释水（5.11）中加入 1.05.0mL 接种水（5.12）中的一种。以接种的稀释水的 5 天（20）耗氧量应在 0.31.0mg/L 之间。6 步骤6.1 实验前准备工作6.1.1 实验前 8h 将生化培养箱接通电源，并使温度控制在 20下正常运行。6.1.2 将实验用的稀释水、接种水和接种的稀释水放入培养箱内恒温备选用。6.2 水样预处理6.2.1 水样的 pH 值不在 6.57.5 之间时；先做单独试验，确定需要的盐酸（ 5.10）或氢氧化钠溶液（5.9）体积，再中和样品，不管有无沉淀形成。当水样的酸度或碱度很高，可改用高浓的碱或酸进
12、行中和，确保用量不少过水样体积的 0.5%。6.2.2 含有少量游离氯的水样，一般放置 1-2h 后，游离氯即可消失。对于游离氯在短时间内不能消失的水样，可加入适量的亚硫酸钠溶液，以除去游离氯。6.2.3 从水温较低的水体中或富营养化的湖泊中采集的水样，应迅速升温至 20左右，以赶出水样中过饱和的溶解氧。否则会造成分析结果偏低。从水温较高的水体中或废水排放口取样，应迅速使其冷却至 20左右，否则会造成分析结果偏高。6.2.4 若待测水样没有微生物或微生物活性不足时，都要对样品进行接种。诸如以下几种工业废水：a、未经生化处理过的工业废水；b、高温高压或经卫生杀菌的废水，特别要注意食品加工工业的废
13、水和医院生活污水；c、强酸强碱性的工业废水；d、高 BOD5 值的工业废水；e、含铜、锌、铅、砷、镉、铬、氰等有毒物质的工业废水。以上的工业废水都需采用具有足够微生物。7 测试7.1 不经稀释水样的测定溶解氧含量较高、有机物含量较少的地表水，可不经稀释而直接以虹吸法将约 20的混匀水样转移入两个溶解氧瓶内，转移过程应注意不使产生气泡。以同样的操作使两个溶解氧瓶充满水样后溢出少许，加塞。瓶内不应留有气泡。其中一瓶随即测定溶解氧，另一瓶的瓶口进行水封后，放入培养箱中，在 20 培养 5 天。在培养过程中注意添加封口水。从开始放入培养箱算起，经过 5 昼夜后，弃去封口水，测定剩余的溶解氧。7.2 需
14、经稀释水样的测定7.2.1 稀释倍数的确定根据实践经验，提出下述计算方法，供稀释时参考。7.2.1.1 地表水由测得的高锰酸盐指数与一定的系数的乘积，即求的稀释倍数。高锰酸盐指数与系数的关系见表 2-3。表 2-3 由高锰酸盐指数与系数的关系高锰酸盐指数（mg/L） 系数 高锰酸盐指数（mg/L） 系数55100.2、0.31020200.4、0.60.5、0.7、1.07.2.1.2 工业废水由重铬酸钾法测得的 COD 值来确定，同程需作单个稀释比。使用稀释水时，由 COD 值分别乘以系数 0.075、0.15、0.225，即获得三个稀释倍数。使用接种稀释水时，则分别乘以系数 0.075、0
15、.15、0.25 即获得三个稀释倍数。7.2.2 稀释操作7.2.2.1 一般稀释法：按照选定的稀释比例，用虹吸法沿筒壁先引入部分稀释水（或接种稀释水）于 1000mL 量筒中，加入需要量的均匀水样，再加入稀释水（或接种稀释水）至 800mL，用带胶板的玻棒小心上下搅匀。搅拌时勿使搅棒的胶板露出水面，防止产生气泡。按照（7.1）相同的步骤操作，测定培养 5 天前后的溶解氧。另取两个溶解氧瓶，用虹吸法装满稀释水（或接种稀释水）作为空白试验，测定培养 5 天前后的溶解氧。7.2.2.2 直接稀释法直接稀释法是在溶解氧瓶内直接稀释。在已知两个容积相同（其差1mL）的溶解氧瓶内，用虹吸法加入部分稀释水
16、（或接种稀释水） ，再加入根据瓶容积和稀释比例计算出来的水样量，然后用稀释水（或接种稀释水）使刚好充满，加塞，勿留气泡于瓶内。7.3 溶解氧的测定： 溶解氧的测定方法用碘量法（通常用叠氮化钠改良法） ，详见本书第二章实验六 水溶解氧（DO ）的测定8 计算8.1 不经稀释直接培养的水样BODs = DO1DO 2 BODs水样的 BOD5 值，mg LDO1：水样在培养前的溶解氧浓度，mgLDO2：水样在培养五天后的溶解氧浓度，mgL8.2 经稀释后培养的水样 21115 )()(ffBCBODC1水样在培养前的溶解氧浓度，mgLC2水样在培养五天后的溶解氧浓度，mgLB1稀释水（或接种稀释水
17、）在培养前的溶解氧浓度，mgLB2稀释水（或接种稀释水）在培养五天后的溶解氧浓度，mgLf1稀释水（或接种稀释水）在培养液中所占比例f2水样在培养液中所占比例 119 注意事项9.1 根据废水浓度高低及毒性大小确定使用稀释水、接种水还是稀释接种水，若稀释比大于 100，将分两步或几步进行稀释。11注：f 1、 f2 的计算：例如培养液的稀释比为 3%，即 3 份水，97 份稀释水，则 f1=0.97，f 2=0.03。9.2 培养时要注意避光，防止藻类生长影响测定结果。9.3 其他注意事项参见本书第二章实验六 水溶解氧（DO）的测定中（7.27.6 ） 。链接 水溶解氧（DO）的测定碘量法1
18、目的1.1 掌握碘量法测定水中溶解氧的原理和方法；1.2 掌握水样存在不同干扰物时的处理方法或选用合适的测定方法。2 原理测定水中溶解氧常用碘量法及其修正法和膜电极法。清洁水可直接采用碘量法测定。其原理是：水样中加入硫酸锰和碱性碘化钾，水中溶解氧将低价锰氧化成高价锰，生成四价锰的氢氧化物棕色沉淀。加酸后，氢氧化物沉淀溶解并与碘离子反应，释出游离碘。以淀粉作为指示剂，用硫代硫酸钠滴定释出的碘，却可计算出溶解氧的含量。反应式如下：MnSO4+2NaOH=Mn(OH)2+Na2SO4（白色）2Mn(OH)2+O2=2MnO(OH)2( 棕色，即 H2MnO3 亚锰酸)MnO(OH)2+2KI+2H2
19、SO4=I2+MnSO4+K2SO4+3H2OI2+2Na2S2O3=2NaI+Na2S4O6（连四硫酸钠）3 仪器3.1 250ml 溶解氧瓶或具塞试剂瓶 2 个。3.2 50ml 滴定管 2 支。3.3 1ml 移液管 3 支，25ml、100ml 移液管各 1 支。3.4 10ml、100ml 量筒各 1 个。3.5 250ml 碘量瓶 2 个。4 试剂4.1 硫酸锰溶液将 MnSO44H2O 480g 或 MnSO42H2O 400g 溶于蒸馏水中，过滤后稀释成 1000ml。 (此溶液中不能含有高价锰，试验方法是取少量此溶液加入碘化钾及稀硫酸后溶液不能变成黄色，如变成黄色表示有少量碘
20、析出，即表示溶液中含有高价锰)。Mn023+2I-+6H+=I2+Mn2+3H204.2 碱性碘化钾溶液溶解 350g 氢氧化钠于 300400ml 蒸馏水中，冷至室温。另外溶解 300g 碘化钾于 200ml 蒸馏水中，慢慢加入已冷却的氢氧化钠溶液，摇匀后用蒸馏水稀释至 1000ml（为强碱性溶液，腐蚀性很大，使用时注意勿溅在皮肤或衣服上)，如有沉淀，则放过夜后，倾出上清液贮藏于塑料瓶或棕色瓶中。4.3 浓硫酸比重 1.84，强酸腐蚀性很大，使用注意勿溅在皮肤或衣服上。4.4 1淀粉指示液称取 2g 可溶性淀粉，溶于少量蒸馏水中，用玻璃棒调成糊状：慢慢加入(边加边搅拌)刚煮沸的200mL 蒸
21、馏水中，冷却后加入 0.25g 水杨酸或 0.8g 氯化锌 ZnCl2 防腐剂。此溶液遇碘应变为蓝色，如变成紫色表示已有部分变质，要重新配制。4.5 (1+1)硫酸溶液将浓硫酸(比重 184)与水等体积混合。4.6 硫代硫酸钠溶液 C(Na2S203)=0.025mol/L 称取 6.2g 硫代硫酸钠(Na 2S2035H20)溶于煮沸放冷的蒸馏水中，加入 0.2g 碳酸钠，用水稀释至1000mL。贮于棕色瓶中，使用前用重铬酸钾，C(1/6K 2Cr207)=0.0250mol/L 标准溶液标定，标定方法如下。于 250ml 碘重瓶中，加入 l00ml 蒸馏水和 1g 碘化钾，加入 10.00
22、ml 0.0250 mo1/L 重铬酸钾标准溶液，5mL 2 mol/L(1/2 H2S04)，硫酸溶液，密塞，摇匀，于暗处静置 5 min 后，用待标定的硫代硫酸钠溶液滴定至溶液呈淡黄色，加入 1 ml 淀粉溶液，继续滴定至蓝色刚好褪尽为止，记录用量。标定反应：K 2Cr207+6KI+7H2S04=Cr2(S04)3+3I2+4K2S04+7H20(硫酸铬，绿色)I2+2Na2S203=2NaI+Na2S406(连四硫酸钠，无色)C=10.000.0250V式中：C硫代硫酸钠溶液浓度(mol/L)V硫代硫酸钠溶液消耗量(ml)5 实验步骤5.1 采样将取样管插入取样瓶（溶解氧瓶）底让水样慢
23、慢溢出，装满后再溢出半瓶左右后，取出取样管，赶走瓶壁上可能存在的气泡，盖上瓶盖(盖下不能留有气泡)。5.2 溶解氧的固定用移液管插入溶解氧瓶的液面下，加入 lml 硫酸锰溶液（4.1） ，2ml 碱性碘化钾溶液（4.2） ，盖好瓶盖颠倒混合数次，静置。待棕色沉淀物降至半瓶时，再颠倒混合一次，待沉淀物降到瓶底。5.3 碘析出轻轻打开瓶塞，立即用移液管插入液面下加入 1.5ml(1+1)硫酸（4.5） ，小心盖好瓶塞，颠倒混合摇匀，至沉淀物全部溶解为止，放置暗处 5min。5.4 滴定取 100.0ml 上述溶液于 250ml 锥形瓶中，用硫代硫酸钠（4.6）滴定至溶液呈淡黄色，加 lml 淀粉溶
24、液（4.4） ，继续滴定至蓝色刚好褪去为止，记录硫代硫酸钠用量。6 计算溶解氧（O 2mg/L）=CV 281000/100ff=V0/(V0-V1)式中：C硫代硫酸钠溶液浓度（mol/L）V2滴定时消耗硫代硫酸钠体积（ml）8氧（1/2，0）摩尔质量（g/mol）V0250（ml）V1加入 MnSO4、碱性碘化钾的体积之和（ml）7 注意事项7.1 一般规定要在取水样后立即进行溶解氧的测定，如果不能在取水样处完成，应该在水样采取后立即加入硫酸锰及碱性碘化钾溶液，使溶解氧“固定” 在水中，其余的测定步骤可送往实验室进行。取样与进行测定时间间隔不要太长，以不超过 4 小时为宜。7.2 瓶中充满水
25、样时，必须不留空气泡，不然空气泡中的氧也会氧化 Mn(OH)2，使分析结果偏高。7.3 水中如果有亚硝酸盐存在，亚硝酸氮含量大于 0.1mg/L 时，由于亚硝酸盐与碘化钾作用能析出游离碘，在反应中析出的 N0 在滴定时受空气氧化而生成亚硝酸2NO2-十 4H+2I-2NO+I 2+2H2O2 NO+O2 2NO 2 2NO2+H2OHNO 2+HNO3亚硝酸又会从碘化钾中将碘析出，这样就使分析结果偏高。为了获得正确的结果，可在用浓硫酸溶解沉淀之前，在水样瓶中加入数滴 5%叠氮化钠溶液，其反应如下：2NaN3+H2SO42HN 3 +Na2SO4叠氮化钠 叠氮酸HNO2+HN3H 2O+N2+N
26、2O7.4 当 Fe3+的含量大于 1mg/L 时，溶液酸化后 Fe3+将与 KI 作用而析出碘，这样就使分析结果偏高。2Fe3+ +2I-2 Fe 2+I2为了使测定溶解氧获得正确的结果，可以在沉淀未溶解以前，加入 2ml 40的氟化钾溶液，然后用 4ml 85的磷酸 H3P04 代替硫酸，此时沉淀溶解，同时所有的 Fe3+与 F-或 PO34络合成FeF 63-或Fe(PO4)23-，这样就抑制了 Fe3+与 KI 的作用。7.5 如果水样中含有还原物质 Fez+、S 2-、SO23、NO 和有机物等，则可采用在酸性条件下加高锰酸钾来去除，过量的高锰酸钾，用草酸还原去除。去除的具体步骤如下
27、：取水样 250ml，在水样瓶中，用移液管沿瓶口壁加 0.7ml 浓硫酸，再加 1ml(0.6)高锰酸钾溶液(移液管插入溶液)，盖好瓶盖摇匀，溶液为淡红但，如溶液中红色很快褪去，则再加 1ml 高锰酸钾溶液摇匀，红色保持 5min 不褪为止。5min 后，用移液管加 2草酸液 1mL(移液管仍须插入液面之下)，盖好盖子摇匀，红色褪尽。若红色未褪尽，则需再加草酸，草酸的用量要恰好为使高锰酸钾完全作用，否则要造成测定结果偏低的可能。过程中试剂的全部加入量要准确记录以便结果计算时校正，同时注意防止水中溶解氧的损失或大气氧溶入。去除还原物质后的水样，其溶解氧的测定按碘量法步骤进行。7.6 硫代硫酸钠标定中的注意事项用重铬酸钾作氧化剂，必须在高酸度条件下。而碘和硫代硫酸钠定量的反应要求在微酸性或中性溶液中进行。因为酸度高，会加快硫代硫酸钠的分解，因此，必须把高酸度的溶液稀释，与此同时，溶液稀释后亦可减少碘分子在滴定过程中的损失。
