1、PCR 注意事项151 PCR 的操作注意事项模板： PCR 所用的模板一般稀释至纳克数量级，并保存于-20。C。闭环 DNA 模板的扩增效率略低于线性 DNA。当使用高分子量的 DNA（10kb）作模板时，如用限制性内切酶先行消解（靶序列中没有此酶切位点） ，则扩增效率更好。PCR 所用的模板一般使用量为：哺乳动物基因组 DNA 1.0ug DNA。酵母 110ng细菌 10ng100ng质粒 0.1ng10ng引物：标准 PCR 反应（不限制引物数量）每条引物的典型浓度时0.10.5umol/L（即 6101231013 个分子） 。该浓度扩增 1kbDNA 片段少于 30 个循环的 PC
2、R 反应绰绰有余，更高浓度的引物可能引起错配，导致非特异性扩增。买来的引物应先离心几秒钟后，加入一定量的 TE 至引物浓度为 40M，保存于20。C。使用时，稀释成 20uM，避免反复冻融。dNTP：在 MgCl2 1.5mmol/L 条件下，每种 dNTP 的浓度一般在200250umol/L 之间。高浓度 dNTP（4mmol/L）对扩增反应起抑制作用。因为 dNTP 与 Mg2+螯合而引起。如扩增片段在约 1kb 长度。每种 dNTP 浓度控制在 20 umol/L 至 0.51.0pmd/L，可能会使扩增产物获得满意产率。普通 PCR 用的 dNTP 浓度为 2.5mM，保存于-20。C 避免反复冻融。在-20。C 长期保存的 dNTP 少量水分会蒸发，然后凝结在管壁上，因此使用前要离心几秒钟。Mg2+：通常缓冲液中 Mg2+最佳浓度时 1.5mmol/L。适当增加 Mg2+浓度可以减少非特异性引导。DNA 聚合酶：常规 PCR。 rTaqE 每个标准的 2550ul 反应体系用 0.52.5 单位。
