1、利用 CEA694 702 2m融合蛋白制备 HLA CEA694 702复合体作者：孟凡岩,沈传来,郭薇,缪凤琴,谢维,张建琼【摘要】 目的： 获得大量 CEA694 702 2 微球蛋白(2m)融合蛋白,并制备 HLA CEA694 702复合体。方法： 通过引物设计在 2m基因的 5端引入 CEA694 702序列和 Linker 序列,并将目的基因克隆到质粒 pET28a 中,在 BL21(DE3)中表达。 CEA694 702 2m和 HLA重链蛋白用金属螯合亲和层析法进行纯化,并经稀释复性法复性。制备的 HLA CEA694 702复合体用 PEG20000 浓缩,应用 ELISA
2、 鉴定其构象,并用尺寸排阻色谱纯化和鉴定。结果： HLA 重链蛋白和CEA694 702 2m蛋白 经金属螯合亲和层析法纯化后纯度提高。ELISA 鉴定结果表明稀释复性后 HLA CEA694 702复合体形成了正确的构象。利用尺寸排阻色谱对 HLA CEA694 702复合体成功地进行了纯化。结论： 利用 CEA694 702 2m融合蛋白成功制备出 HLA CEA694 702复合体,为 HLA CEA694 702四聚体的制备奠定了基础。 【关键词】 2 微球蛋白; 癌胚抗原; 稀释复性法; HLA 肽复合体癌胚抗原(carcinoembryonic antigen, CEA)是一种相对
3、分子质量为180 000200 000 的多糖蛋白复合物,属于免疫球蛋白超家族分子,介导细胞黏附功能,也是重要的肿瘤标志物之一,在结直肠癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、乳腺癌、肝癌及其它恶性肿瘤患者的血清中有不同程度的高表达1。抗原肽 CEA694 702由 9 个氨基酸组成,为HLA A*0201限制性的短肽2, 目前对此抗原肽特异性 T 细胞的数量和功能研究较少3。本研究采用 CEA694 702和 2 微球蛋白(2 microglobulin,2m)融合表达的策略构建 CEA694 702 2m融合蛋白,并和 HLA 重链(heavy chain, HC)复性成 HLA CEA694 702复合
4、体分子,为制备 HLA CEA694 702四聚体,进一步用于抗肿瘤免疫的研究奠定基础。1 材料和方法1.1 材料pET28a 质粒、大肠杆菌 DH5、BL21(DE3)为本实验室保存;限制性内切酶、T4 连接酶及高保真 DNA 聚合 酶均为 TaKaRa 公司产品，Western blot 显影底物及 BCA 蛋白定量 试剂盒均为 Pierce 公司产品，鼠抗人 2m单克隆抗体为 Santa Cruz 公司产品， W6/32 抗体由美国 Dr.Ferrone 惠赠， HRP 标记的羊抗鼠 IgG 抗体为 Sigma 公司产品;Ni NTA为 QIAGEN 公司产品，Superdex 75 p
5、rep grade 为 Amersham Biosciences AB 公司产品。1.2 方法1.2.1 CEA694 702 2m重组质粒的构建和鉴定 以我们构建的 pET28a 2m重组质粒4为模板用两轮 PCR 的方法扩增出CEA694 702 2m融合基因。第 1 轮所用上游引物为5 GGAGGTGGTGGTGGCGGATCAGGAGGCTCAGGAGGTTCAGGAGGCATCCAGCGTACTCCAAAGATT 3,下游引物为 5 CAACTCGAGCATGTCTCGATCCCACTTAAC 3,下划线标示为 Xho 酶切位点。第 2 轮所用上游引物为 5 GGCCCATGGGCG
6、TACTAGTAGGCGTAGCCCTAATCGGAGGTGGTGGTGGCGGA 3,下划线标示为 Nco 酶切位点,下游引物同第 1 轮。质粒载体 pET28a 和 PCR 产物分别用 Nco 和 Xho 酶切,连接后转化入大肠杆菌 DH5感受态细胞。将转化后的 DH5涂布于含硫酸卡那霉素的 LB 培养基平板,置 37 培养过夜。挑取克隆并在LB 液体培养基中培养,然后抽提质粒。重组质粒用 Nco 和 Xho 双酶切结合测序进行鉴定。1.2.2 CEA694 702 2m和 HC 包涵体蛋白的制备 将鉴定正确的重组质粒 pET28a CEA694 702 2m转化入 BL21(DE3)中。
7、挑取克隆,37 培养至 OD600 nm 值为 0.60.8 时,加入 0.1 mmolL-1 IPTG 后于 37 诱导 3 h。离心收集菌体 ,用 Buffer A(50 mmolL-1 Na3PO4、300 mmolL-1 NaCl,pH7.0)重悬,超声破菌后用 Buffer B(50 mmolL-1 Na3PO4、300 mmolL-1 NaCl、0.6 mmolL-1 脱氧胆酸钠、1% Triton X 100,pH7.0)洗 涤包涵体沉淀。最后沉淀重悬于 Buffer C(100 mmolL-1 NaH2PO4、10 mmolL-1 Tris、8 molL-1 urea,pH8.
8、0)中,室温轻缓搅拌,直至沉淀溶解。离心收集上清,分装后置-70 保存备用。含pET28a HC重组质粒的 BL21(DE3)菌为以前实验室所备5,HC 包涵体的制备过程同上。1.2.3 Western blot 鉴定 CEA694 702 2m蛋白 制备的CEA694 702 2m包涵体蛋白用 Western blot 鉴定其表达是否正确,方法是：CEA694 702 2m 蛋白经 SDS PAGE后转移至 PVDF 膜上,加入 3% BSA PBS封闭液,4 封闭过夜。将封闭液倒掉,加入鼠抗人 2m单抗于室温孵育 1 h。洗 涤后加入 HRP 标记的羊抗鼠 IgG 抗体,室温孵育 1 h。
9、洗涤后在膜上滴加 DAB 显 色。1.2.4 HC 和 CEA694 702 2m蛋白的亲和纯化 利用金属螯合亲和层析(immobilized metal ion affinity chromatography, IMAC)纯化 HC 和 CEA694 702 2m蛋白,方法是：分别将 HC 和CEA694 702 2m蛋白与 2 ml Ni NTA在室温混合 30 min,然后装入空色谱柱中,用 Buffer C 洗至吸光度稳定。然后分 别用 Buffer D、E和 F 洗脱蛋白 ,其中 Buffer D、E 和 F 成分同 Buffer C,pH 分别为6.3、5.9 和 4.5。收集各洗
10、脱成分并进行电泳。1.2.5 HLA CEA694 702复合体的制备 将纯化后的 HC(3 molL-1)和 CEA694-702 2m(6 molL-1)分 3 次加入到 100 ml 复性缓冲液(100 mmolL-1 Tris、2 mmolL-1 EDTA、400 mmolL-1 L 精氨酸、5 mmolL-1 还原型谷胱甘肽、 0.5 mmolL-1 氧化型谷胱甘肽和0.2 mmolL-1 PMSF)中,于 10 搅拌 48 72 h 进行复性。复性后经PEG 20000 浓缩,用 Buffer G(20 mmolL-1 Tris、150 mmolL-1 NaCl,pH8.0)进行透
11、析。1.2.6 ELISA 鉴定 HLA CEA694 702复合体的构象 浓缩并透析的复性蛋白进行 SDS PAGE,用软件根据灰度 值计算 HC 和CEA694 702 2m蛋白的比例，然后用 ELISA 鉴定HLA CEA694 702复合体的构象,方法是：将复性蛋白和对照(未复性的 HC 和 CEA694 702 2m蛋白,其比例同复性蛋白) 包被在 96孔酶标板中,用含 2% BSA 的 PBS 于 4 封 闭 2 h。加入 W6/32 于 4 孵育 2 h,洗涤后加入 HRP 标记的羊抗鼠 IgG 抗体,4 孵育 2 h。洗涤后加入底物 A 液和 B 液显色后用 2 molL-1
12、H2SO4 终止，最后用酶标仪于 495 nm 处读取 OD 值。1.2.7 尺寸排阻色谱纯化并鉴定 HLA CEA694 702复合体 尺寸排阻色谱 Superdex 75(柱长 70 cm,柱内径 1.0 cm)用 Buffer G 平衡,然后将浓缩并透析的蛋白样品加到色谱柱上端,用 Buffer G 洗脱,流速为 0.3 mlmin-1,收集洗脱成分并进行电泳。2 结 果2.1 CEA694 702 2m重组质粒的构建和 鉴定如图 1A 所示,CEA694 702 2m 基因从 N 端到 C 端依次包含有：抗原肽 CEA694 702序列、Linker 序列、2m 基因和 His tag
13、序列,全长 396 bp。pET28a CEA694 702 2m重组质粒构建后经 Xho 和 Nco 双酶切后显示出预期长度的目的基因条带和载体 DNA条带,说明目的基因被正确地插入质粒载体中(图 1B);经测序分析,目的基因的序列与设计的序列完全一致。将测序正确的重组质粒 pET28a CEA694 702 2m转化入BL21(DE3)中,经 IPTG 诱导后发现 CEA694 702 2m主要以包涵体的形式表达。SDS PAGE 显示经提取和初步 纯化后包涵体蛋白的条带位置与其相对分子质量(14 700)相符。Western blot 结果表明,表达蛋白可以与抗人 2m的单克隆抗体结合,
14、说明 CEA694 702 2m表达正确(图 2)。2.3 HC 和 CEA694 702 2m融合蛋白的 纯化HLA 重链蛋白 HC 和 CEA694 702 2m融合蛋白都带有His tag,所以可以用 IMAC 进行纯化。如图 3 所示,当溶液 pH 为 4.5时洗脱出来的蛋白最多。据光密度扫描分析,纯化前的 HC 和CEA694 702 2m的 纯度分别约为 72%和 77%,纯化后这两种蛋白的纯度分别约为 92%和 86%。在单体 CEA694 702 2m融合蛋白(14 700)的上方有一条带,大小约为 29 000,经 IMAC 纯化后仍存在,能被抗人 2m单抗结合(数据未展示)
15、,推测其为 CEA694 702 2m的二聚体,这可能是由 Loading buffer 中的 巯基乙醇还原能力下降引起的。CEA694 702 2m 的纯度计算包括此条带在内。W6/32 是一种针对 HLA 类分子构象的特异性单抗。将稀释复性法制备的 HLA CEA694 702复合体,以及未复性的 HLA 重链和 CEA694 702 2m分别在 ELISA 实验中用 W6/32 检测,结果显示 HLA CEA694 702复合体能与 W6/32 特异性结合,其 OD 值高于游离重链和 CEA694 702 2m对照组的 OD 值(图 4)。2.5 HLA CEA694 702复合体的纯化
16、及鉴定HLA CEA694 702复合体用尺寸排阻色谱 Superdex 75 进行纯化,得到 3 个蛋白洗脱峰(图 5)。SDS PAGE显示,第 1 个洗脱峰中含有 HC 和 CEA694 702 2m蛋白,为 MHC CEA694 702复合体峰;第 2 个洗脱峰为 CEA694 702 2m蛋白; 第 3 个洗脱峰没有蛋白,可能是溶液中其它成分,如 EDTA 等。3 讨 论HLA 类分子由 HC、2m和抗原肽三部分组成。为了减少合成抗原肽的步骤并增加 HLA 肽复合体的稳定性,Uger 等6 建立了肽和 2m融合表达的方法,即肽和 2m利用一段 815 个氨基酸组成的 Linker 连
17、接起来形成肽 2m 融合蛋白。这种方法的优点是不用合成抗原肽,肽 2m 融合蛋白可以在 细菌中大量表达 ,构建成的MHC 肽复合体分子 产 量高且更加稳定。实验表明,利用肽 2m 融合蛋白和 MHC 重链蛋白复性成的 MHC 肽复合体分子,已成功地应用于抗原特异性 T 细胞的刺激增殖以及抗原特异性 T 细胞的检测6 10。我们以前的实验表明,MART127 35 2m 融合蛋白可以在宿主菌 BL21 中大量表达,并可以和 HC 结合复性成稳定的HLA MART127 35复合体11。我们将 CEA694 702和 2m融合表达,同样制备出结构和构象正确的 HLA CEA694 702复合体。本
18、实验选取质粒 pET28a 为 CEA694 702 2m的表达载体，一是因为 pET28a 质粒在我们以前的实验中可以大量表达我 们的目的蛋白,包括 HLA HC 和 2m等;二是因为利用此质粒可以很方便地在目的蛋白羧基端加上 6 个组氨酸组成的 His tag,能通过 IMAC 进行纯化,而蛋白纯度的提高有利于随后的复性12;同时,His tag 分子量很小,不会影响后继的复性过程。CEA694 702(GVLVGVALI)是从结肠癌细胞系 SW1116 和新鲜结肠癌组织中鉴定出来的 CEA 的一个 T 细胞表位2。有研究者3的实验表明，CEA694 702 与 HLA A2分子的 亲和力
19、以及其免疫原性均较弱。目前对该段抗原肽研究仍较少,而 HLA CEA694 702复合体的制备为进一步研究 CEA694 702 特异性 T 细胞提供了方便。【参考文献】1李偶 连,刘翠,童 艳丽,等.癌胚抗原(CEA)检测技术的研究进展J.现代医学仪器与应用,2008,20(2): 48 51.2SCHIRLE M,KEILHOLZ W,WEBER B,et al.Identification of tumor associated MHC class ligands by a novel T cell independent approach J.Eur J Immunol,2000,30
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