1、1本文由 29 商业源码网 提供,盗版必究!3 植物组织培养3.1 定义 从植物体分离符合需要的器官、组织或细胞（含原生质体）等作为外植体，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养，使培养或操作对象表现生长发育等生命活动，以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他生物产品的一种技术。 广义上是指所有类型的植物无菌培养技术 植物培养 胚胎培养 器官培养 组织培养 细胞培养 原生质体培养 狭义上，则指的是愈伤组织培养。即以植物外植体增殖而形成的愈伤组织为培养物的培养。这是因为绝大多数植物组织或器官均可在人为控制条件下诱导形成愈伤组织，而且几乎在所有植物离体培养过程中都伴有愈伤组织产生。 外植体：
2、第一次用于接种的材料 初代培养: 外植体的最初培养继代培养: 将初代培养获得的培养物移植到新培养基中，这种反复多次移植的培养称继代培养.增殖率：每一次继代后所获得的培养物与继代前的比值。 固体培养: 加了琼脂等凝固剂于培养基中使之凝固. 液体培养固液培养：先加固体培养基凝固后，再加液体培养基。悬浮培养：培养物悬浮于液体培养基上.愈伤组织: 是指在培养或自然条件下，植物细胞脱分化，不断增殖所产生的主要由薄壁细胞构成的不定形的组织. 脱分化：已分化静止的细胞开始分裂，改变原有细胞结构和功能，回复到无结构分生组织状态形成愈伤组织。再分化: 从愈伤组织分化细胞团中再分化成完整植株。不定芽：从非正常出芽
3、的部位经诱导而长出的芽。 不定根：从非正常出根的部位经诱导而长出的根。胚状体：组织培养中，培养细胞有时可以分化出具有胚芽、 胚根、 胚轴等类似于胚胎的结构，这种由愈伤组织不经过有性过程而直接诱导产生的类似胚的结构称胚状体。 3.2.植物组织培养的特点主要特点是采用微生物学的实验手段来操作植物离体的器官、组织和细胞。具体表现：培养的整个过程都是在无菌条件下进行的，外植体、培养基、接种环境都须经过无菌处理。组织培养在多数情况下是利用成分完全确定的人工培养基进行的，培养基中包含了植物生长所需的水分和一切大量元素、微量元素、有机物和植物激素，pH 和渗透压也是人为设定的。培养的材料处于完全异养状态。
4、培养的起始材料可以是植物的器官、组织、细胞、小孢子、胚乳、原生质体，它们都处于离体状态下，在组织培养条件下均能再生完整植株。培养物通过连续继代培养可以不断增殖，形成克隆，或通过改变培养基成分，特别是其中的植物激素的种类和配比，而达到不同的实验目的，如茎芽增殖或生根组织培养是在封闭的容器中进行的，容器内气体和环境气体可通过瓶塞或其他封口材料进行交换。容器内的相对湿度几乎是100 %，因此，组培苗叶片表面一般都无角质层或蜡质层，且气孔保卫细胞功能缺乏，气孔始终都是张开的。组织培养的环境温度、光照强度和时间等都是人为设定的，找出这些物理因素的最适参数对组织培养的成功也很重要。 4.研究类型和任务 5
5、.植物组织培养的形成与发展 5.1 理论渊源 （1838-1902）1667 年，虎克发现细胞 1838 年，施莱登提出植物细胞学说 1839 年，施旺认为细胞学说也适用于动物 5.1 理论渊源 （1838-1902）主要之点：细胞是生物体的基本结构单位，由它构成整个生物个体，同时，植物细胞又是在生理上、发育上具有潜在全能性的功能单位。正如施旺所说：如果具有存在于有机体内一样的条件，每个细胞应该可以独立生活和发展。 5.2 理论奠基及探索（1902-1933） 1902 年，哈布兰特(Haberlandt)根据细胞学说原理，提出了高等植物的组织和器官可以不断分割，直到单个细胞。5.2 理论奠基
6、及探索（1902-1933）1904 年，德国植物胚胎学家汉宁用萝卜和辣根胚培养，长成小植株，这是离体培养的第一个成功例子。 1933 年，李继侗将 3mm 以上的银杏胚培养成功，同时发现胚乳提取物促进离体胚的生长。 5.3 组培技术建立（1933-1943） 1934 年美国的 White 等用番茄根尖的组织培养，首次建立了活跃生长的无性繁殖系1937年，White 又发现 B 族维生素和吲哚乙酸，对离体根的生长有重要作用他最早设计出适于植物组织培养的合成培养基配方。培养基是无机盐、糖类和酵母提取物。 5.3 组培技术建立（1933-1943）Gautheret 1934 年培养山毛柳、黑杨
7、的形成层时，可以不断地增长几个月。这项技术的关键是使用了固体培养基。 1937-1938 年他在培养基中加入 IAA 和维生素 B 等物质，结果使柳树形成层的生长大为增加。法国的另一位学者 Nobecourt(1937-1938)培养胡萝卜根和马铃薯的块茎薄壁组织，也使细胞增殖获得成功 由于 White, Gautheret 和 Nobecourt 等科学家杰出的工作和发现，初步建立起植物离体培养的基本方法。 5.4 植物组织培养物的形态发生研究阶段1941 年，Overbeek 等以椰子汁作为培养基附加物，使曼陀罗心形期幼胚培养成功。1946 年，罗士韦将菟丝子茎尖培养成功并在试管内开花，离
8、体培养技术可以控制花芽形成。21948 年，Skoog 和崔瀓在烟草茎切断和髓培养研究中发现腺嘌呤或腺苷可以解除培养基中生长素对芽的抑制作用，并使烟草茎切断诱导形成芽，从而发现了 Ad/IAA 的比例是控制芽和根分化的决定性因素之一。 高形成芽， 低 形成根。1953 年，Muir 将万寿菊和烟草的愈伤组织，转移到液体培养基中，放在往复式摇床上振荡，获得由单细胞或细胞聚集体组成的细胞悬浮液，而且可以继代繁殖，这是培养方式的突破。1956 年，Miller 发现激动素 激动素/生长素（提出植物形态发生调控的激素平衡理论：在烟草髓组织培养中，根和茎的分化是生长素对细胞分裂素比率的函数，通过改变培养
9、基中这两类生长调节物质的相对浓度可以控制器官的分化：这一比率高时促进生根，低时促进茎芽的分化，二者浓度相等时，组织则倾向于以一种无结构的方式生长。 ）1958 年，Steward 把胡萝卜根韧皮部细胞悬浮培养，从中诱导出胚状体并使其发育成小植株，印证了细胞全能性。是人类第一次实现人工体细胞胚，为组培第一个突破。 1959 年，德国 Gautheret 植物组织培养原理和实践一书，全面论述了植物组织培养，由于控制分化的需要对培养基、激素、营养条件、培养方法进行了大量研究。MS：1962、White：1963 、 B 5： 1968、 Ls：1965、 N 6： 1974 等，也创立了多种植物培养
10、方法。1960 年，英国 Cocking 用纤维素酶和果胶酶溶解番茄根尖的细胞壁，得到原生质体，继续培养原生质体，可重新长壁、分裂分化形成根和芽，最终形成植物体。开创了植物原生质体培养和体细胞杂交工作。为组培第二个突破。1960 年，Kanata、Rangas Wamy 和 Mahshwari 培养婴粟未受精的胚珠并在试管内撒播花粉，成功地获得能正常发芽的种子。 1961 年 Morel 培养兰花茎尖，脱毒快繁兰花。建立了“兰花工业” 。1964 年 Guha 培养毛叶曼陀罗花药，得到由花粉发育来的单倍体植株。1970 年 Kameya 和 Hinata 用悬滴法培养甘兰芥兰杂种一代成熟花粉获
11、得单倍体植株。1971 年 Takebe 烟草叶肉细胞原生质体植株。 5.5 迅速发展和应用研究 （1972今)先后在花药培养及单倍体育种、原生质体培养、植株再生、原生质体融合、体细胞杂交上取得大量成果。1972 年 Carlson 在培养两个不同种的粉蓝烟草和郎氏烟草原生质体时，加入诱导剂（甘露醇、盐类） ，使两种原生质体发生融合，得到了体细胞杂种，而且该细胞杂种经细胞分裂分化形成完整杂种植物。 由于在愈伤组织水平、单个细胞水平、单个生殖细胞水平、原生质体水平、体细胞水平、杂种细胞水平均获完整植株，充分证实了细胞全能性。 1974 年，Bonne 和 Eriksson 成功地完成了细胞器（叶
12、绿体）的摄入。将具有叶绿体的海藻和不具有叶绿体的胡萝卜根原生质体，在聚乙二醇诱导下融合成功。观察到 16%的活胡萝卜原生质体中，含 1 至多个叶绿体。试验证明原生质体是引入外源遗传物质的极好材料。1974 年，Kao 等发现 PEG 可促进原生质体凝聚并高频率融合，使大规模细胞融合成为可能1978 年，Melchers 等首次获得了番茄和马铃薯属间体细胞杂种一 Potamato.这个体细胞杂种的获得，激起人们对于远缘杂种的热情和想象力。 “地面结番茄，地下长土豆”一度成为美谈，甚至有人想象叶肉细胞和牛乳腺细胞的融合同时生产糖类物质和蛋白质！ 1973 年，在烟草冠瘿瘤培养物中发现了来源于农杆菌
13、的 Ti 质粒，它可以自发地整合到植物的基因组中去，由此开始了植物重组 DNA 和基因工程的研究。近 20 年来，细胞工程技术被广泛用于植物的基因转化，于是细胞工程和基因工程紧密结合，构成了现代植物生物技术的主体。 1981 年，Larkin 和 Scowcroft 评述了大量的组织培养文献后指出，再生植株中变异株的出现是一种普遍的现象。由组织培养诱发的变异叫做体细胞无性系变异，由此产生的变异株叫做细胞突变体。利用无性系变异，经过离体或田间筛选获得有用的细胞突变体，是一种新的细胞工程育种途径。 植物细胞大量培养生产有用的次生代谢产物是植物细胞工程另一个重要的领域。6.应用及展望 6.1 植物离
14、体快繁 植物离体快繁是植物组织培养在生产上应用最广泛、产生较大经济效益的一项技术，特点是繁殖系数大、周年生产、繁殖速度快、苗木整齐一致等 对繁殖系数低、不能用种子繁殖的“名、优、特、新、奇”的作物品种、脱毒苗、新育成、新引进、稀缺品种、优良单株、濒危植物和基因工程植株等可通过离体快繁，以比常规方法快数万倍到数百万倍的速度进行扩大增殖，及时提供大量优质种苗或种薯。试管苗在国际市场上已形成产业化。6.2 无病毒苗木培育 很多农作物都带有病毒，特别是无性繁殖植物，如马铃薯、甘薯、草莓、大蒜等，病毒在体内积累，影响生长和产量，对生产造成极大损失。但是，感病植株并非每个部位都带有病毒， White 早在
15、 1943 年就发现，植物生长点附近的病毒浓度很低甚至无病毒，利用组织培养方法，取一定大小的茎尖进行培养，再生植株就可脱除病毒，获得脱病毒小苗。由于大部分病毒都不是通过种子传播的，因此若是使用未受侵染或侵染程度较轻个体的种子进行繁殖，就有可能得到无病毒植株。不过有性繁殖后代常常表现遗传变异性，在园艺和造林业中，品种的无性繁殖十分重要，而这一般都是通过营养繁殖实现的。 如果在一个品种中，并非全部母株都受到侵染，那么只要选出一个或几个无病株进行营养繁殖，也有可能建立起无病的核心原种。但是，若一个无性系的整个群体都已受到侵染，获得无病植株的惟一办法，就是由该植株的营养体部分把病原菌消除，并由这些组织
16、中再生出完整的植株。 病毒在植物体内的分布是不均匀的。在受侵染的植株中，顶端分生组织一般说或者是无毒的，或者是只携有浓度很低的病毒。在较老组织中，病毒数量随着与茎尖距离的加大而增加。分生组织所以能逃避病毒的侵染，可能的原因是： 在一个植物体内，病毒易于通过维管系统移动，但在分生组织中不存在维管系统。病毒在细胞间移动的另一个途径是通过胞间连丝，但它的速度很慢，难以追赶上活跃生长的茎尖； 在旺盛分裂的分生细胞中，代谢活性很高，使病毒无法进行复制； 倘若在植物体内确实存在着“病毒钝化系统”的话，它在分生组织中应比在任何其他区域都有更高的活性，分生组织不受侵染；在茎尖中存在高水平内源生长素，可以抑制病
17、毒的增殖。已知病毒是 DNA 大3分子，病毒 DNA 随植物细胞分裂而复制。细胞分裂和病毒繁殖之间存在相互竞争，在迅速分裂的植物细胞中，是正常核蛋白合成占优势，而在细胞伸长期间，是病毒核蛋白合成占优势。生长点、分生组织细胞是活跃分裂的细胞。分裂速度比病毒 DNA 复制速度快，故采用旺盛分裂的生长锥离体培养，可能脱除病毒。“无病毒”：带有“特定无病毒”的涵义。6.3 培育新品种或创制新物种 6.3.1 培育远缘杂种 受精后障碍导致远缘杂交的植物不孕，使得植物的种间和远缘杂交常难以成功采用胚的早期离体培养可以使杂种胚正常发育，产生远缘杂交后代，从而育成新物种；通过原生质体融合，可以克服有性杂交不亲
18、和性，从而获得体细胞杂种，创制出新物种或新类型。 6.3.2 离体选择突变体 培养细胞处在分裂状态，易受培养条件和诱变因素影响产生变异，可以筛选出对人类有用的突变体，育成新品种。尤其对原来诱发突变较为困难、突变率较低的一些性状，用细胞培养进行诱发、筛选和鉴定时，由于处理细胞数远远多于处理个体数，因此一些突变率极低的性状有可能从中选择出来。 6.3.3 单倍体育种 由于具有所有基因均能表现、基因型可快速纯合等优点。5.3.4 次生代谢物生产 利用组织细胞的大规模培养，生产天然有机化合物，如蛋白质、脂肪、糖类、药物、香料、生物碱及其他活性化合物。 对于人类来说，植物次生代谢产物是药物和工业原料的重
19、要来源。长期以来，为了取得这些产物，人们大量采挖资源植物，造成许多稀有野生资源植物的短缺，甚至威胁到物种的生存。即使栽培资源植物，也需要占用耕地，而且受到地域和气候的限制。植物细胞离体培养成功不久，人们就试图利用细胞大量培养的方法来生产次生代谢产物。6.3.5 植物种质资源的离体保存6.3.6 人工种子 人工种子：植物离体培养中产生的胚状体或不定芽，被包裹在含有养分和保护功能的人工胚乳和人工种皮中，从而形成能发芽出苗的颗粒体。意义：人工种子结构完整,体积小,便于贮藏与运输,可直接播种和机械化操作；不受季节和环境限制，胚状体数量多、繁殖快、利于工厂化生产 利于繁殖生育周期长、自交不亲和、珍贵稀有
20、的一些植物，也可大量繁殖无病毒材料；可在人工种子中加入抗生素、菌肥、农药等成分，提高种子活力和品质；体细胞胚由无性繁殖体系产生，可以固定杂种优势。7.国内外微繁概况 第一章 实验室及基本设备 实验室包括:准备室(化学实验室：洗涤、培养基配制、灭菌)、无菌操作室（带缓冲间） 、培养室、鉴定室（细胞学实验室）和温室。 有无菌操作设备、培养设备、药品贮存、配制仪器设备及观察分析仪器设备等。 植物组织培养的基本操作包括：各种玻璃器皿的洗涤、灭菌；培养基的配制、灭菌；无菌室的消毒及接种操作。影响外植体生长和分化因子：物理环境（温度、光照和湿度） ；化学环境（培养基组成、pH 和渗透压） ，生物环境（外植
21、体种类、大小、细胞密度） 。1.1 实验室设计原则 满足能进行无菌操作和无菌培养需要,首先具有一定的无菌环境（无菌室，无菌箱，超净台） 。使用无菌的容器和用具，进行无菌操作。然后把被培养的植物材料，放在一定的温度,光照，RH，营养条件下，使其生长，发育，繁殖。设计原则（1）为减少污染，组培室最好设走道,人从外面进入，先通过一缓冲走道。 （2）培养室应建在房屋南面，南、东或西应有大窗尽量利用自然光。 （3）培养室房间宜小,门也宜小,最好为滑门,以保温节能.接种室房间也宜小,备有准备小间,以更换衣帽等,超净台较宽,门应稍大, 装紫外线灯.1.3 设备2 器皿的选择与清洗 2.1 配制培养基需要的器
22、皿 2.2 细胞组织培养用的器皿2.3 玻璃器皿的清洗 一般用洗涤剂溶液清洗即可。 清洗用过的、装有培养物的器皿时，先除去残余的培养基或大块的残渣，用自来水冲洗一次后再用洗涤剂溶液浸泡。然后用试管刷把器皿壁内外刷洗干净，用自来水冲洗数遍，最后用蒸馏水过一遍，晾干后即可。2.3 玻璃器皿的清洗 吸量管和容量瓶用洗涤剂和自来水冲洗、晾干，再浸入硫酸加重铬酸钾洗液内浸泡几小时，在自来水中冲洗干净后再用蒸馏水冲洗-3 遍，稍晾一会儿，待不滴水珠时，即可放入烤箱烘干备用3 培养基的配制 3.1 培养基种类由功能划分：（1）分化培养基:用于诱导愈伤组织形成和器官分化。加入一定浓度 2，4-D（2）增殖培养
23、基:用于愈伤组织或芽增殖（3）生根培养基:用于分化芽生根，加入少量生长素，基本培养基浓度减半。根据培养基的成分和浓度分： 含盐量较高的培养基 特点：无机盐浓度高，特别是硝酸盐、钾离子和铵离子含量丰富。元素平衡较好，缓冲性能好。微量元素和有机成分含量齐全且较丰富。 MS、LS、BL、ER 等。硝酸钾含量较高的培养基 有 B5, N6, SH 等。特点是培养基的盐类浓度较高，铵态氮含量较低，但 VB1和硝酸钾含量较高。中等无机盐含量的培养基 有 Nitsch 、Miller 、H 等。特点是大量元素含量约为 MS 的一半，微量元素种类少但含量较高，V 种类较多。 低无机盐含量的培养基 包括怀特、W
24、S、HE 等。特点是无机盐含量非常低，为 MS 的 1/4 左右，有机成分也很低。 3.2 培养基特点 3.3 培养基成分与作用 3.3.1 大量元素 0.5 mmol/l C、H、O、N、P、S、K、Ca、Mg 4作用:组成各种化合物，参与机体建造构成特殊生理活性物质，参与活跃新陈代谢。元素间互相协调，以维持离子浓度的平衡。影响形态发生和组织器官建成 糖：a 调节培养基渗透压；b 作为碳源和能源；c 较高浓度糖防止幼胚早熟萌发3.3.2 微量元素 Fe、Mn、B、Zn、Cu、Mo、Cl 3.3.3 铁盐 细胞分裂与伸长，少铁细胞分裂停止 3.3.4 有机成分：多数植物细胞在培养时都能合成所需
25、的 V，但合成数量不足肌醇 ：肌醇本身并不促进外植体生长，但有助于活性物质发挥作用，提高 VB1的效果，促进外植体生长，胚状体及芽形成。 Adenine （腺嘌呤）及其硫酸盐,促进芽的形成和生长.Ad 是合成细胞分裂素前体之一.椰子汁（10） ，乳熟期玉米浆，荸荠汁，麦芽提取物，番茄汁（5-10） ，香蕉泥（100-200mg/L）：提供一些必要的营养成分，生理活性物质和生长激素等3.3.5 琼脂 固化剂，琼脂加量与培养基硬度呈线性关系，降低细胞分裂素的活性. 优点:操作简便，对培养物支持，通气易解决.便于经常观察研究. 缺点：用量、离子浓度降低、长时间高温、过酸过碱、加入吸附剂（活性炭）等会
26、使凝固力下降. 3.3.6 植物激素 生长素类 ：用于诱导细胞分裂、根的分化、诱导愈伤组织形成, 胚状体产生以及生根,配合一定细胞分裂素诱导腋芽及不定芽发生与生长 2,4-D NAA, IBAIAA 设 IAA 为活性 1,则 NAA:3-4, 2.4-D:10-20, 细胞分裂素：促进细胞分裂和器官分化，延缓组织衰老，增强蛋白质合成，抑制顶端优势，促进侧芽生长3.3.7pH 值 3.3.8 其它成分 活性炭（AC） AC 防植物组织自身酚类物质排泌和变褐老化，对形态发生和器官形成有良好效应。AC 具有强大吸附能力，主要吸附非极性物质和色素大分子，减少一些有害物质影响，但吸附选择性差。抗生素
27、：防菌类污染，减少培养材料损失，但其对植物组织生长也有抑制作用 3.4 母液的配制为了避免每次配制培养基都要称量各种化学药品，常常把培养基中必需的一些化学药品，按原量的浓度增大 10 倍、100 倍或1000 倍后称量，配成一种浓缩液，这种浓缩液就叫做母液 母液配制程序 A.准备蒸馏水、药品、容器等，确定扩大倍数、定容体积B.清洁容器、称量药品 C.分别溶解 D.混合定容 E.贴标签（药品名称及重量、扩大倍数定容体积、配制人、日期）3.5 培养基的配制程序 3.5.1.高温消毒的培养基确定配方及配制数量，准备母液及培养瓶称量琼脂，加水到培养基最终容积的 2/3-3/4, 加热煮沸溶解。 吸取母
28、液：根据配方要求，按顺序用量筒或移液管吸取大量元素、微量元素、铁盐、维生素、植物激素等各种母液，放在干净的烧杯中。定容调 pH 值：把母液、糖，倒入煮好的琼脂中定容，混匀，用 0.1 N NaOH 或 HCl 调 pH，一般为 5.6-5.8.分装：把培养基分到所选用的培养容器中。盖瓶盖：将培养瓶用瓶盖盖上拧紧。灭菌：高压灭菌锅先加水，放入培养瓶，开电，0.07MPa 时排气到 0， 0.11MPa （121）计时，维持在 0.11-0.12MPa 之间 20min. 排气到 0 后取出培养基，冷却备用。培养基高压蒸汽灭菌注意事项 装锅不可过满，需使锅内具有一定空间，便于热蒸汽的上下回流，才能
29、收到良好灭菌效果。锅内冷空气必须排尽，否则压力表指针虽然达到规定压力，但由于锅内冷空气的存在，达不到相应的温度，影响灭菌效果.锅内达到一定压力后，注意在保持压力的过程中，严格遵守时间。时间过长会使培养基内一些化学物质遭到破坏，影响培养基成分；时间不足则达不到灭菌效果3.5.2.过滤消毒的培养基 过滤消毒是用过滤消毒器完成的。在过滤器的漏斗和接收瓶之间安装孔径为 0. 45m 或 0. 22m 的微孔滤纸，当与抽气泵连接并减压时，培养液通过微孔滤纸，但是培养液中的微生物因体积大于微孔而无法通过滤膜4 材料器械的消毒与无菌操作 4.1 植物材料的消毒 4.2 外植体的选择和处理4.2.1 外植体的
30、选择原则 再生能力强遗传稳定性好外植体来源丰富外植体灭菌容易 4.2.2 常用的外植体茎尖节间部叶和叶柄鳞片其他 4.2.3 外植体的灭菌 灭菌要求：既要把材料表面和内部的菌消灭,又不损伤或轻微损伤材料,不影响生长。灭菌剂要求：既要有良好的灭菌效果，又容易除去，不影响材料生长。4.2.3.3 植物材料灭菌的过程 材料前处理。从田间取回的材料，用自来水冲洗 10min，洗去泥土等污垢，剪去残伤部分，再用自来水冲洗数次，剪成小段灭菌剂配制。开启超净工作台，配制 70酒精、次氯酸钠、氯化汞等灭菌剂。为使灭菌剂湿润整个组织，还需在药液中加入数滴（浓度小于 0.）表面活性剂吐温 20 或吐温 80。5准
31、备无菌杯、无菌水。材料灭菌。把材料放入 70酒精中，进行表面消毒。取出后立即放入灭菌剂中。数分钟后取出，放入无菌水中冲洗 3-5 次。然后，将材料放到无菌培养皿中待接种时使用。如果材料所带杂菌较少，酒精消毒的步骤可省略。操作中所用的镊子、解剖刀、滤纸等，均需高压灭菌。镊子等器具在使用时，还要随时用酒精灯消毒4.3 器械的消毒玻璃培养容器常常与培养基一起灭菌 各种器械，如镊子、解剖刀、解剖针和小铲子等，先在 90酒精中浸一下，然后在火焰上灼烧，待冷却后使用4.4 无菌操作的步骤 1）无菌操作室（接种室）长期停用后再用时，需进行熏蒸灭菌。每次使用前用紫外线灯照射 15-20 min，进行室内空气灭
32、菌。同时将工作服、口罩等物品一起照射灭菌。(2)接种台灭菌：超净台，每次接种前，先用紫线灯照射或用 70%-75%酒精喷雾灭菌，然后使超净台正常送风 30-40 min后再接种。接种箱每次使用前必须坚持熏蒸灭菌。 (3)工作人员操作前，先用肥皂洗涤双手，穿好工作服，戴好工作帽，用70-75酒精拭擦台面及双手。一应接种器械，均沾以 70%-75%酒精，在酒精灯上严格烧灼灭菌。灭菌后的器械，在接种前严禁再度污染。操作时尽量不要讲话，防喷沫造成污染。(4)接种打开瓶盖时，注意不要污染瓶口。打开瓶盖和盖瓶盖前，坚持瓶口烧灼灭菌。操作时注意手臂切勿从培养基、无菌材料、接种器械上方经过，以免引起再度污染。
33、4.5 污染源及其表现特征 4.5.1 污染物种类 细菌、真菌细菌污染 在培养过程中，在培养基表面或材料表面出现沾液状物体、菌落或混浊的水迹状，泡沫发酵状等，其中又以乳白色芽孢杆菌最严重，它多数分布在培养基内部,偶尔出现在培养基表面,这种芽孢杆菌能耐一定高温、高压，对消毒剂和紫外线也有一定抗性,多在培养基灭菌后 2-3d 发生真菌污染 污染部分长有不同颜色的霉菌，在接种 3d 甚至半个月后才出现。继而很快出现黑、白、黄、绿等孢子。真菌污染的原因多为外植体本身带菌、周围环境不清洁、超净工作台过滤装置失效、培养器皿口径过大等4.5.2 污染产生原因及克服环境不洁、培养基和培养材料消毒不彻底、操作过
34、程中不慎、操作人员或工具带菌等引起。接种室消毒： 甲醛(2-10ml/m 3)和 KMnO4(1-5g/m3)熏蒸消毒(培养室用乙二醇 6ml/m3熏蒸消毒以避免甲醛使培养物中毒死亡)，使用前用 75%酒精喷雾降尘，打开超净台 1520 分钟，用 75%酒精擦净超净台工作区域，接种完壁后，用 2%新洁尔灭擦超净台台面和地板,并开启紫外灯(距地 2m,15-30w/6-9m3)杀菌 30min。培养基和接种用具的消毒培养材料选择与灭菌 通常多年生木本材料比一二年生草本材料带菌多；老材料比幼嫩材料带菌多；田间材料比温室材料带菌多；带泥土材料比清洁材料带菌多；晴天取材比雨天取材可降低污染率。对木本植
35、物，可采用多次灭菌或多种药液、多次灭菌的方法来增强效果。比较珍贵的材料，接种几天后发现污染。若为细菌污染，则舍去，若为真菌污染，可用 2%NaClO 消毒15min，无菌水漂洗后接种；也可用镊子夹住材料在酒精灯火焰上烧污染部分几秒钟。再换培养基，可减少材料污染损失人为污染的防止 在实际操作中，工作人员的责任心、操作技术及熟练程度是减少污染的又一重要环节。a.责任心：工厂化生产中一定要经常提醒工人认真负责。否则把未灭过菌的碟子当作灭过菌的使用，定会全部污染，培养基排气不彻底或计时时间不够均会引起芽孢杆菌污染。b.种源选择：由技术熟练、认真仔细的工人负责选苗。选出那些无任何污染迹象的正常种源，并用
36、 75%酒精擦拭瓶子外壁、瓶底和瓶盖，尤其是瓶盖和瓶子接缝部位一定要认真擦净。 c.进接种室前用 0.01%新洁尔灭洗手,接种前用 75%的酒精擦洗双手，穿工作服，戴工作帽、口罩，严禁谈话。d.接种用镊子、剪刀等工具每用一次都必须严格灼烧灭菌，防交叉感染；接种时瓶子要倾斜,使瓶口位于火焰上方充分灼烧灭菌瓶口,防止打开瓶口时因压力增加而使空气中细菌孢子落入瓶中。接种镊子与切分碟子成 45 度角,镊子任何时候均不能离开工作区域。手不能伸到碟子上方，防细菌孢子掉入碟中。e.培养过程中,培养室要求清洁，干燥，定期检查，发现污染及时清除。引进无菌分化芽污染的防止 因途中运输，瓶外壁会积落灰尘和细菌孢子，
37、先用 75%酒精擦洗瓶子并用透明胶布封瓶口，用新纸箱包装。材料运到后及时用 75%酒精擦洗瓶子,培养观察一周后转接。对珍贵材料，可每瓶只接一芽,能较好防止污染;对已污染的生根苗，可及时洗出移到珍珠岩或椰糠、河沙等基质中，可减少损失提高出苗率。 第二章 基本原理1 植物细胞全能性1.1 植物的再生现象 1.2 植物细胞全能性概念1.2.1 细胞全能性的认识过程 Schleiden1838;Schwann1839 细胞学说：细胞是在生理上、发育上具有潜在全能性的功能单位。Harberlandt:1902,高等植物的器官和组织可以不断分割，直到单个细胞。White 1943，在烟草愈伤组织培养中偶然
38、发现形成了一个芽提出：.植物的每个细胞都具有该植物体全部的遗传信息。.每个植物细胞都具有发育成完整植株的能力。 1958 年，Steward 等和 Reinert 等分别从胡萝卜培养细胞中获得了人工胚，首次证实了 White 所提出的细胞全能性假说分子生物学：全能性意味着每一个细胞中包含着产生一个完整有机体的全部基因，在适当的条件下，一个细胞就会形成一个完全新的有机体（Sinnoit, 1960；曹宗巽等，1980） 。郑光植等(1980; 1981)认为：任何植物的离体细胞在人工培养下都具有它们“母体”植物的那种合成药用成分的能力培养细6胞的药物生物合成的全能性1984 年，国际组织培养协会
39、：细胞全能性是细胞的某种特征，有这种能力的细胞保留形成有机体所有细胞类型的能力林顺全：每个植物活细胞都具有该物种的生命特征属性，在合适的离体培养条件下，可以展现这些特征属性。 细胞是新陈代谢生理生化活动的场所，也是遗传基因存在的地方，因此具有植物体全部的遗传信息；组成植物体的每个细胞都是由最初的一个细胞分裂产生的，但处在植物体中不同部位的生活细胞受到植株整体的控制和影响，因而总有一些基因受到控制阻遏而不能表答，故完整植株中不同部位的生活细胞通常只表现出一定的形态和生理功能.但当植物的器官组织与植株分离后，就不再受完整植株的控制。如果供给离体细胞组织以合适的营养和生长调节物质。满足离体细胞组织生
40、长发育的条件便有可能促使细胞按其遗传信息的指示分裂、分化、形成组织器官乃至完整植株。细胞全能性学说认为，植物的细胞具有发育为胚胎和植株的潜能。组培实践表明，虽然不是植物所有细胞都具有全能性，但是的确许多类型的细胞可以在离体培养条件下发育为胚状体或者植株 一般说来高度分化或特化的细胞，如筛管和根冠细胞，已失去分裂和再分化能力，即使在离体培养条件下，也不可能发育成植株。只有那些胚性细胞或分化程度不高的细胞才可具备发育为胚胎或植株的全能性一个细胞通过脱分化向分生状态回复可能达到的程度，取决于它已有的分化程度。分化程度较低的细胞，如形成层细胞和薄壁细胞，可以脱分化形成营养生长点，再分化产生器官或植株。
41、而分化程度很高的细胞，如厚壁细胞或纤维细胞只能回复到形成层细胞状态，能够分裂形成某些组织，但不可能再生植株。由此看来，被子植物的茎端分生细胞，形成层分生细胞和薄壁细胞属于胚胎干细胞，而其他分化程度高的细胞可以看做是组织干细胞。 分化细胞脱分化条件：创伤和外源激素。创伤使组织中的生长素分布发生变化，伤口处生长素浓度的提高是细胞开始脱分化的直接原因。组培时，培养基中添加的外源激素对细胞脱分化起着决定性的作用在自然条件下分化细胞通常停止细胞分裂，执行特定的代谢功能，直至死亡。在离体培养条件下，静止的分化细胞脱分化的前提就是启动第一次细胞分裂，分化细胞一旦开始分裂，就可以连续分裂形成分生状态的细胞群体
42、。如果能够揭露启动脱分化第一次细胞分裂时基因表达的细节，找出细胞脱分化的相关基因，我们就能了解细胞脱分化过程的本质，从而达到精确控制细胞全能性表达的目的。 1.2.5 植物细胞全能性的实现途径1.2.5.1 离体培养技术在细胞全能性实现和利用中的作用细胞全能性是通过生命周期、细胞周期和组织培养周期来实现。2 植物细胞的分化2.1 定义 细胞分化：由于细胞的分工而导致的细胞结构和功能的改变，或发育方式改变的过程。细胞分化的结果，导致形态发生，从而形成不同器官，不同器官又执行着不同功能2.2 分子遗传学观点如何解释细胞分化 由受精卵发育成的植物个体，它的每一个细胞在遗传上均是相同的，具有相同的基因
43、组成。植物个体发育的过程，表现为染色体上不同基因，按一定顺序,选择性活化或阻遏。由于不同基因活化的结果，表现为合成不同的酶和蛋白质分子。那么，当同一种基因型的细胞合成不同酶和蛋白质时，即出现细胞分化3 离体培养条件下植物细胞的脱分化和再分化 3.1 定义 3.2 离体培养条件下细胞的脱分化和再分化的时期愈伤组织诱导的成败关键主要不是外植体的来源和种类，而是培养条件，其中激素的种类和来源最为重要。从接种外植体到形成愈伤组织，大致要经历诱导期，分裂期和分化期等三个时期。这三个时期中细胞代谢、细胞数目、细胞形态均有明显差别。3.2.1 诱导期：细胞分裂的准备期即细胞准备进行分裂的时期，通常接种的外植
44、体细胞均是成熟细胞，处于静止状态，欲使其代谢活性加强，迅速进行核酸和蛋白质合成，就必须利用激素和其它一些刺激手段来对其进行诱导3.2.2 分裂期：细胞通过分裂不断增殖的过程，是细胞脱分化的开始.分裂期细胞的特征：细胞分裂快，结构疏松，缺少有组织的结构，颜色浅而透明外植体脱分化难易与其种类和生理状况有关，一般幼嫩组织脱分化易，成熟老组织难，花器官脱分化易，茎叶较难，茄科、十字花科脱分化易，禾谷类难. 3.2.3 分化期：即通过分裂期的细胞发生生理代谢变化而形成形态和功能各异的细胞并形成愈伤组织的过程.分化期的特征：细胞形态大小保持相对稳定，体积不再减小，愈伤组织不再增殖。生长旺盛的愈伤组织一般呈
45、奶黄色或白色，有时也呈浅绿色或绿色；老化的愈伤组织则多转变为黄色或褐色。 3.2.4 愈伤组织的增殖愈伤组织形成后，可以分切转接到新鲜培养基上进行增殖，其生长是发生在不与琼脂接触的表面。愈伤组织通常有松脆和坚实两种明显不同的质地，通过调节二者可以互相转变，加入高浓度的生长物质，可使坚实的愈伤组织变松脆，减少或除去生长物质，则松脆愈伤组织可以变坚实， 一般地前者更有利于以后的形态发生。 3.2.5 愈伤组织状态的调控来源于不同植物或同一种植物不同部位的愈伤组织，在颜色、结构和生长习性上都可能存在差异。颜色可能或是黄或白，外观是光滑或是粗糙，结构可能致密或是松脆，它们的遗传生理功能可能具有胚性，或
46、不具胚性。但优良的愈伤组织通常必须具备以下 4 个特性中的-个特性： 高度的胚性或再分化能力，以便从这些愈伤组织得到再生植株。 容易散碎，以便用这此愈伤组织建立优良的悬浮系并且在需要时能分离出全能性原生质体 旺盛的自我增殖能力，以便用这些愈伤组织建立大规模的愈伤组织无性系。 经过长期继代保存而不丧失胚性，以便有可能对它们进行各种遗传操作生长素是促使细胞进入亢进状态（细胞分裂）的因子细胞分裂素是促使细胞进入保守状态（器官分化）的因子；氮源除供给7培养物氮素营养外还原态氮还具有促进细胞分裂作用硝态氮具有抑制细胞分裂作用。当增加生长素浓度促进细胞分裂效果不明显时，增加氨态氮（谷氨酰胺、Arg、水解酪
47、蛋自等还原氮）可起到明显促进分裂作用，使用细胞分裂素或降低生长素对细胞分裂抑制效果不显著时，增加硝态氮或减少还原氮，起到显著的抑制分裂作用。 3.3 细胞分化 无论是在离体还是在活体条件下，植物细胞分化的研究重点是维管组织的分化，特别是木质部成分的分化，由于技术上的困难对韧皮部分化过程的研究较少3.3.1 影响维管组织分化过程的因子 生长素和蔗糖是对维管组织分化过程有显著影响的两种物质 3.4 细胞脱分化和再分化的条件3.4.1 植物细胞的机械隔离和生理隔离 整体植物的每个细胞、组织和器官均受其周围的细胞、相邻的组织、器官的制约。一般情况下，它们只能执行着自已特定的功能。3.4.2 植物激素的
48、作用4 影响植物细胞脱分化和再分化的因子分外因和内因两方面。所谓外因即指植物细胞的营养条件和环境条件；内因即指植物的遗传性和生理状态4.1 培养基组成的影响4.1.1 培养基的营养组成 培养基作用：向细胞提供所需各种营养，调节渗透压、酸碱度和供给水分。 木本植物茎尖培养时如在诱导芽之后反复使用 MS 培养基，可引起芽退化。A.硝酸盐和铵盐的比例 B.天然复合物类 C.生长素 D.赤霉素 E.乙烯 F.脱落酸 4.1.2 培养基的渗透压 4.1.3 培养基的酸碱度 pH 值调节的依据按照植物长期生活所适应环境的酸碱度来调节 pH 值。多数植物为 5.8-6.0 依据培养基硬度来决定随 pH 值升
49、高，培养基硬度也偏硬； 依据培养基中某些物质的稳定性4.2 环境条件与植物细胞脱分化和再分化4.2.1 温度控制原则依据植物起源和生态类型来决定。喜温性植物：2628。冷凉性植物：1822或25 4.2.2 光质（光的波长）的影响 离体培养条件下，用日光灯进行光照，光谱成分主要是蓝紫光，波长为 419467 nm。芽分化有效光谱成分为蓝紫光，波长为 419540 nm，其中蓝光更为适宜，波长为 450540 nm。波长为 660 nm 的红光，对芽分化无效。根分化则和芽分化相反，根分化受红光 600680 nm 所刺激，蓝光无效红光和远红光交替照射对芽器官分化起积极作用4.3 供体遗传性和生理状态与植物细胞脱分化和再分化4.3.1 供体植物的遗传性与器官发生不同基因型，形态建成能力差异很大. 种与种间、品种之间、纯种和杂种间4.3.1.1 种间形态建成能力的差异 4.3.1.2 品种之间形态建成的差异柑橘类中，甜橙的离体胚胎发生能力强,宽皮橘（或橘）次之，
