1、第四章 药物定量分析与分析方法验证,第一节 定量分析样品的前处理方法,一、概述分析含金属或含卤素、氮、硫、磷、硒等特殊元素药物分析的前处理方法。 含金属或卤素的药物，如葡萄糖酸锑钠，硬脂酸镁、碘苯酯、磺溴酞钠等，处理方法因金属或卤素在分子中结合的牢固程度而异，如：有机卤素药物，所含卤素原子均直接与碳原子相连，但不同药物中卤素所处的位置不同，则与碳原子结合的牢固程度就有差异。如果卤素和芳环相连接，则结合牢固，与脂肪链的碳原子相连接，则结合不牢固；,而含金属的有机药物，有两种情况：一是金属原子不直接与碳原子相连，通常为有机酸及酚的金属盐或配位化合物，称为含金属的有机化合物，其分子结构中的金属原子结
2、合不够牢固，在水溶液中既可离解出金属离子，可在溶液中直接进行其金属的鉴别或含量定；二是金属原子直接与碳原子以共价键相连接，结合状态比 较牢，称为有机金属药物.在溶液中其金属一般不能解离成离子状态，经适当处理，将其金属转变为适于分析的状态（多转变为无机的金属盐或离子），方可进行其金属的鉴别或含量测定。,二、不经有机破坏的分析方法 （一） 直接测定法凡金属原子不直接与碳原子相连的含金属药物或某些C-M （金属原子直接与碳原子相连）键结合不牢固的有机金属药物， 在水溶液中可以电离，因而不需有机破坏，可直接选用适当的方 法进行测定 。,（二）经水解后测定法1直接回流后测定法2用硫酸水解后测定法 （三）
3、经氧化还原后测定法1 碱性还原后测定,2 酸性还原后测定3 利用药物中可游离的金属离子的氧化性测定含量 三、 经有机破坏的分析方法 （一） 湿法破坏1 硝酸-高氯酸法2 硝酸-硫酸法3 硫酸-硫酸盐法4 其它湿法,（二） 干法破坏,（三） 氧瓶燃烧法 氧瓶燃烧法（oxygen flask combustion method）系将有机药物放入充满氧气的密闭的燃烧瓶中进行燃烧，并将燃烧所产生的欲测物质吸收于适当的吸收液中，然后根据欲测物质的性质，采用适宜的分析方法进行鉴别、 检查或测定含卤素有机药物或含硫、氮、硒等其它元素 的有机药物。,本法是快速分解有机物的简单方法，它不需 要复杂设备，就能使有
4、机化合物中的待测元素定 量分解成离子型。该方法被各国药典所收载。1 仪器装置 燃烧瓶为500ml、1000ml、或 2000ml磨口、硬质玻璃锥形瓶，瓶塞应严密、空 心、底部熔封铂丝一根（直径为1mm），铂丝下 端做成网状或螺旋状，长度约为瓶身长度的23 ， 如图,2 称样 3 燃烧分解操作法 4 吸收液的选择,（ 2） 仪器与材料,仪器装置燃烧瓶为250、500、1000或2000ml无色、磨口、厚壁、硬质玻璃锥型瓶；瓶塞空心，底部熔封铂丝一根，下端呈螺旋状或网状,称样用材料及称样A. 固体样品 无灰滤纸B. 液体样品 纸袋,C. 软膏类样品：将适量样品置不含被测成分的蜡油纸中包裹严密，外层
5、再用无灰滤纸包裹,样品的燃烧点燃包有供试品的滤纸尾部，迅速放入燃烧瓶中，按紧瓶塞，加水少量封闭瓶口，俟燃烧完毕（应无黑色碎片），充分振摇，使生成的烟雾完全吸入吸收液中，放置15min，用水少量冲洗瓶塞及铂丝，合并洗液及吸收液，同法另做空白试验。然后按各药品项下规定的方法进行鉴别、检查或含量测定。,吸收液,A. 作用：吸收液的作用是将样品经燃烧分解所产生的各种价态的卤素、硫、氮、硒等，定量地吸收并转变为一定的便于测定的价态,氧气,B. 吸收液的选择,氟 水 （HF） 氯 NaOH溶液（HCl) 溴 H2O2-NaOH(NaOH饱和溶液-SO2(Br2,HBr) 碘 NaOH饱和溶液-SO2(I2
6、,HI) 硫 浓H2O2溶液 硒 硝酸溶液,（3）操作方法,燃烧瓶燃烧前的准备用洗液洗净后，按各药品项下的规定加入吸收液，将瓶口用水湿润，小心急速地通入氧气1min，立即用表面皿覆盖瓶口。 样品的准备取样品适量，精密称定后按规定方法包裹，固定于铂丝下端的网内或螺旋处。,（5）应用,例 磺溴酞钠的含量测定 ChP (2000),溴 取本品约0.2g，照氧瓶燃烧法（附录 C）进行有机破坏，选用1000ml燃烧瓶，以0.4%氢氧化钠溶液10ml，浓过氧化氢溶液0.5ml与水10ml作为吸收液，俟生成的烟雾完全吸入吸收液后，用水稀释至100ml，煮沸5分钟，放冷，加稀硝酸使成酸性，精密加硝酸银滴定液（
7、0.1mol/l）20ml，摇匀，再加硫酸铁胺指示液2mL，用硫氰酸胺滴定液(0.1mol/L)滴定，并将滴定的结果用空白试验校正。每1mL硝酸银滴定液(0.1mol/L)相当于7.990mg的溴(Br)。,例 碘苯酯的含量测定 ChP（2005）,原理 碘苯酯系有机碘化物，用氧瓶燃烧分解，转变为碘化物，继而氧化为游离的碘，并被定量地吸收于吸收液中，和氢氧化钠反应，生成碘化物与碘酸盐，加入溴-醋酸溶液，使全部转变为碘酸盐，过量的溴以甲酸及通空气去除。加入碘化钾，使与碘酸盐反应析出游离碘，用硫代硫酸钠液滴定，碘与淀粉结合所显的蓝色消失即为终点,取本品约20mg，精密称定，照氧瓶燃烧法进行有机破坏
8、，用氢氧化钠试液2ml与水l0ml为吸收液，待吸收完全后，加溴醋酸溶液(取醋酸钾10g，加冰醋酸适量使溶解，加溴0.4ml，再加冰醋酸使成1000m1)l0ml，密塞，振摇，放置数分钟，加甲酸约lml，用水洗涤瓶口，并通入空气流约35min以除去剩余的溴蒸气，加碘化钾2g，密塞，摇匀，用硫代硫酸钠滴定液(0.02 Mol/L)滴定，至近终点时，加淀粉指示液，继续滴定至蓝色消失，并将滴定的结果用空白试验校正。每lml的硫代硫酸钠滴定液(0.02mol/L)相当于1.388mg的C19H29IO2。,滴定度的计算 放大反应,2mol碘苯酯1molI2 1molI21molNaIO+1molNaI
9、1molNaIO1/3molNaIO3+2/3molNaI,即2mol碘苯酯2molNaIO3,2mol NaIO3+10I-6molI2,即2mol碘苯酯1molI2 6molI212molI12molNa2S2O3,反应摩尔比为16,98：140. 氧瓶燃烧法中的装置有 A. 磨口硬质玻璃锥形瓶 B. 磨口软质玻璃锥形瓶 C. 铂丝 D. 铁丝 E. 铝丝,选择氧瓶燃烧法所必备的实验物品 A. 磨口硬质玻璃锥形瓶 B. 铂丝 C. 普通滤纸 D. 氢气 E. 无灰滤纸,99：76氧瓶燃烧法测定含氯有机药物时所用的吸收液多数为 A. H2O2溶液 B. H2O2NaOH溶液 C. NaOH溶
10、液 D硫酸肼饱和液 E. NaOH硫酸肼饱和液,.氧瓶燃烧法可用于 A. 含卤素有机药物的含量测定 B. 醚类药物的含量测定 C. 检查甾体激素类药物中的氟 D. 检查甾体激素类药物中的硒 E. 芳酸类药物的含量测定,第二节 定量分析方法特点一、 容量分析法 （一） 容量分析法的特点 （二） 容量分析法的计算问题1 滴定度2 滴定度（T）的计算3 百分含量计算（1） 直接滴定法,（2）回滴定法（剩余滴定法 ）,A:被测药物，B：滴定剂,m 滴定液的摩尔浓度（mol/l),滴定度T,例：用碘量法测定VitC(176.13）m(I2)=0.05mol/l,aMA b WA mBV,T:药典规定的摩
11、尔浓度的滴定度,剩余滴定法： 药物+定量过量的滴定液A，用另一滴定液B回滴；空白实验,剩余滴定法：,二、 光谱分析法（一）紫外-可见分光光度法 1特点紫外-可见分光光度法是根据物质分子对波 长为200nm760nm 这一范围的电磁波的吸收特性所 建立起来的光谱分析方法。主要特点如下： （1）灵敏度高，可达10-4g/ml10-7g/ml 。 （2）准确度高，相对误差为2% 5%。 （3）仪器价格较低廉，操作简单，易于普及。,2郎伯-比耳定律3仪器校正和检定4对溶剂的要求5测定方法 1)对照品比较法,标示量（%）：制剂含量相当于标示量的百分数,单位制剂的平均装量，如：g/片，g/粒，g/ml,
12、ml/ml B:标示量:单位制剂的标示量（ g/片，g/粒，g/ml, ml/ml ）,2）吸收系数法,（二） 荧光分析法1特点2荧光分析仪3含量测定,三、 色谱分析法 （一） 高效液相色谱法1对仪器的一般要求系统适用性实验（1）色谱柱的理论塔板数（n）（2）分离度,. 测定法（1）内标法加校正因子测定供试品中主成分含量：,内标法,样品中加入内标物，以待测组分和内标物的响应信号对比定量,内标物和标准物是同一物质时,应用示例（一）黄体酮测定-HPLC 柱:C18 流动相:甲醇-水(65:35) 检测波长:254nm 内标物:已烯雌醇1mg/ml 对照品:黄体酮标品,方法:,（1）取本品约20mg
13、，精密称定，置25 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀.精密量取该溶液与内标溶液各5ml，置另一个25ml量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀，进样20 l 得峰面积分别为A样和A内，（2）另取对照品m对同法测定，得峰面积分别为A对和A内 按内标法以峰面积计算含量.（1）求含量（2）求fi,(1)求fi,（黄体酮对已烯雌醇的相对校正因子）,（2）求药片中黄体酮含量,注意:mi是指样品中含有纯黄体酮的质量,实际工作中的计算方法,m样是指称取样品的质量,对于液体或气体样品,（2）外标法测定供试品中主成分含量：外标法可分为标准曲线法和外标一点法。1）标准曲线法：2）外标一点法：,(二) 气相色谱法1.
14、 对仪器的一般要求2. 系统适应性实验3. 测定法,第三节 药品质量标准分析方法验证验证内容有：准确度、精密度（包括重复性、日间和日内精密度和重现性）、专属性、检测限、定量限、线性范围和耐用性。一、 准确度 （一）含量测定的准确度 准确度系指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程 度，一般以回收率（%）表示。准确度应在规定的范围内建立。 回收率的计算可按下式：,原料药,原料药,二 、 精密度 精密度系指在规定的测定条件下，同一个均匀样品，经过多 次取样测定所得的结果之间的接近程度。 (一) 精密度表示方法1. 偏差(deviation，d ).标准偏差(standard deviation
15、 ，SD ),3. 相对标准偏差(relative standard deviation,RSD ),也称变异系数(coefficient of varation,CV ),(二) 重复性、中间精密度及重现性1. 重复性 在相同的条件下，由一个分析人员测定所得结果的精密度称为重复性。 2中间精密度 同一个实验室，不同时间由不同分析人员用不同设备测定结果的精密度，称为中间精密度。 3重现性 在不同实验室由不同分析人员测定结果的精密度，称为重现性。,(三) 数据要求 三、专属性专属性系指在其他成分（如杂质、降解产物、辅料等）可 能存在下，采用的方能准确测定出被测物的特性。 (一) 鉴别反应 (二)
16、 含量测定和杂质测定 四、 检测限检测限（limit of detection，LOD）是试样中被测物能被检 测出的最低浓度或量。LOD是一种限度检验效能指标，即反映 方法与仪器的灵敏度和噪音的大小，也表明样品经处理后空白 （本底）值的高低。它无需定量测定，只要指出高于或低于该 规定的浓度或量即可。根据所采用的方法来确定检测限。,(一) 常用的方法 1. 非仪器分析目视法 2. 仪器分析时的测定法 （二）数据要求 五、定量限定量限（limit of quantitation ，LOQ）是指样品中被测物能被定量测定的最低量，其测定结果应具一定准确度和精密度。杂质和降解产物用定量测定方法研究时，应
17、确定定量限。,六、线性线性 系指在设计的范围内，测试结果与试样中被测物浓 度直接呈正比关系的程度。,七、范围范围是指能到达一定精密度、准确度和线性、测试方法适用 的高低限浓度或量的区间。 八、耐用性耐用性 系指在测定条件有小的变动时，测定结果不受影响 的承受程度，为常规检验提供依据。1用于鉴别试验2用于原料药中杂质测定或制剂中的降解产物测定的方法3用于原料药中主成分或制剂中有效组分含量测定及溶出 度测定,第四节 生物样品分析方法的基本要求 一、常用样品的种类、采集和储贮藏生物样品包括各种体液和组织，但实际上最常用的是比 较容易得到的血液（血浆、血清、全血）尿液、唾液。 (一) 血样 血浆（pl
18、asma）和血清（serum）是最常用的生物样品。 (二) 唾液 (三) 尿液 二、生物样品分析前处理技术 (一) 去除蛋白质,1加入与水相混溶的有机溶剂 2加入中性盐 3加入强酸 4加入含锌盐及铜盐的沉淀剂 5酶解法 （二）缀合物的水解 （三）分离、纯化与浓集 1液-液提取法(liquid-liquid extraction ,LLE) 2液-固提取法(liquid solid extraction,LSE) 3被测组分的浓集,(四) 化学衍生化 1GC中化学衍生化法 2HPLC中化学衍生化法 三、 定量分析方法验证 (一) 特异性必须证明所测定的物质是原形药物或特定的活性代谢物， 内原性物
19、质和相应的代谢物及同时服用的其他药物不得干扰 样品的测定。对于色谱法至少要提供空白样品色谱图、空白 生物样品加标准物质色谱图及用药后的样品色谱图。,(二) 标准曲线与线性范围所测定物质的浓度与响应的相关性，用回归分析方法 所得的回归方程来评价。一般控制相关系数r0.9900。标准曲线高低浓度范围为线性范围，在线性范围内浓度测定结果应达到试验要求的精密度和准确度。 (三) 精密度与准确度要求选择三个浓度的质控样品同时进行方法的精密度 和准确度考察，低浓度选择在最低定量限（LOQ）附近， 高浓度在标准曲线的上限附近，中间选一个浓度，每一个 浓测定五个样品。,精密度用质控样品的日内和日间相对标准偏差 （RSD）表示，一般RSD 应小于15%，在LOQ附近RSD应小于20%。 准确度是指用特定方法测得的生物样品浓度与真实浓度的接近程度，可用相对回收率表示，即采用“回收率”或“加样回收率”得到的药物自样品中回收率。其值一般应在85%115%范围内，在LOQ附近应在80%120%范围内。,(四) 最低定量限最低定量限指标准曲线的最低浓度点，也称灵敏度，表示 测定样品中符合准确度和精密度要求的最低药物浓度，要求 LOQ至少能满足测定35个半衰期时样品中的药物浓度或Cmax 的1/101/20时的药物浓度。 (五) 样品稳定性 (六) 提取回收率 (七) 质控样品 (八) 质量控制,
