1、第 10 章、酶的作用机制和酶的调节（P384）本章重点：1、酶的活性中心，2、影响酶活性的条件和因素，3、酶和底物之间的相互作用和关系，4、酶催化反应机制，5 酶概念的发展-核酶本章的主要研究内容：（一）酶的活性部位（1）酶活性部位：酶的特殊催化能力只局限在大分子的一定区域，活性部位又称活性中心。酶分子中与酶活力直接相关的区域称为活性中心，分为： 结合部位：负责与底物结合，决定酶的专一性。 催化部位：负责催化底物键的断裂或形成，决定酶的催化能力。对需要辅酶的酶，辅酶分子或辅酶分子某一部分结构往往是酶活性部位组成部分。（2）酶活性部位特点：1. 活性部位只占酶分子中相当小的部分，通常 12%。
2、P384 表 10-1 列举一些酶活性部位的氨基酸残基。如溶菌酶一共 129 个氨基酸残基，活性部位为 Asp52 和 Glu35；胰凝乳蛋白酶 241 个残基，活性部位为His57，Asp 102，Ser 195。2. 活性部位为三维实体。活性部位氨基酸残基在一级结构上可能相距甚远，甚至不在一条肽链上，但在空间结构上相互靠近。因此空间结构破坏酶即失活。活性中心以外部分可为酶活性中心提供三维结构。3. 酶与底物的结构互补是指在酶和底物结合过程中，相互构象发生一定变化后才互补。如 P385 图 10-1。4. 活性部位位于酶分子表面的一个裂缝内。裂缝中为一个疏水微环境，也含有某些极性氨基酸残基有
3、利于催化，底物在此裂缝内有效浓度很高。5. 酶与底物结合形成 ES 复合物主要靠次级键：氢键、盐键、范德华力和疏水相互作用。6. 酶活性部位具有柔性和可运动性。（二） 研究酶活性部位的方法（1） 酶侧链基团化学修饰法：1. 特异性共价修饰：如二异丙基磷酰氟（DFP）专一地与酶活性部位Ser-OH 的羟基共价结合，使酶失活。如胰凝乳蛋白酶共 28 个 Ser，但 DFP只与活性中心的 Ser 反应，见 P386。反应后，用 HCl 将酶部分水解，得含二异丙基磷酸酯（DIP）基团的肽的片断，序列分析定出 DIP-Ser 为 Ser195。2. 亲和标记：用与底物结构相似的修饰剂，对酶活性部位进行专
4、一性共价修饰。如 TPCK（结构式见 P387） ，结构与胰凝乳蛋白酶的底物对甲苯磺酰 -L-苯丙氨酸乙酯（ TPE）类似，TPCK 只与胰凝乳蛋白酶中 His57 结合，说明His57 为该酶活性部位的一个氨基酸残基。（2） X-射线晶体结构分析：可提供酶分子三维结构，了解酶活性部位氨基酸残基所处相对位置与状态，与底物结合后酶分子在底物周围氨基酸残基排列状况，被作用键周围残基状况等。由此提出活性中心处氨基酸残基组成及催化作用形式。如溶菌酶：对它水解的糖苷键周围氨基酸残基分析后确定酶的催化基团为 Glu35 和 Asp52。又如胰凝乳蛋白酶经 X-射线晶体结构分析，表明活性部位由Ser195、
5、 His57 和 Asp102 组成，并提出这三个氨基酸残基联在一起形成一个“电荷中继网” ，如 P409 图 10-40 所示： 没有底物时， His57 未质子化，三联体排列为 A； 在加上底物后，Ser 195 转移一个质子给 His57，带正电荷的咪唑环通过带负电荷的 Asp102 静电相互作用被稳定，成为 B。详细酶作用机制见 P410 图 10-42。（三） 影响酶催化效率的有关因素：（1） 底物和酶的邻近效应与定向效应。酶催化反应高效率一重要原因是将分子间反应变为分子内反应。邻近效应：底物与酶先形成中间体络合物，两分子成一个分子，分子内反应速度比分子间反应速度提高。P388 图
6、10-2 所示：用咪唑催化乙酸对硝基苯酯水解来证实：咪唑可催化乙酸对硝基苯酯的酯键水解成乙酸和对硝基苯酚；若将咪唑分子先共价连接在底物上，在分子内催化酯键水解，可增速 24 倍。定向效应：底物反应基团和酶催化基团正确取位会大大加速反应。P389 表 10-3 用二羧酸单苯酯水解相对速度和结构关系实验表明：分子内催化反应，当催化基团羧基与酯键愈邻近并有一定取向，反应速度愈大。每移去一个旋转自由度，反应速度约增加 200 倍。又如 P389 所示制备邻羟苯丙酸内酯的分子内酯化反应表明：当在分子中引入甲基使羧基和酚羟基定位，反应速率可提高 2.51011 倍。（2） 底物的形变和诱导契合：酶使底物分
7、子内敏感键中某些基团的电子云密度增高或降低，产生“电子张力” ，底物扭曲而接近过渡态，使反应加速。如具有五元环构象的乙烯环磷酸酯（P390） ，由于构象更接近磷酸酯水解时的过渡态，P-O 键有电子张力，因此水解速度是磷酸二甲酯的 108 倍。溶菌酶作用细菌细胞壁，水解由 N-乙酰基葡萄糖胺等构成的糖苷键。溶菌酶与底物结合时会引起糖环构象由椅式变成半椅式，可加速水解。（3） 酸碱催化：酶为广义酸碱催化。咪唑基既是一个强亲核基团，又是一个有效的广义酸碱催化功能基团，因此蛋白质中 His 含量虽少，但却占有重要的地位。此外酶蛋白中还有氨基、羧基、巯基、羟基等，都具有广义酸碱催化功能。（4） 共价催化
8、：有亲核催化或亲电催化。酶在催化过程中形成中间物，P392 表 10-5列出形成共价中间物的一些酶。酶分子中氨基酸侧链上有许多亲核基团如羟基、巯基、咪唑基等，可进攻底物的酰基、磷酰基和糖基等。（5） 金属离子催化：几乎三分之一的酶催化需要金属离子，金属离子可以与酶紧密结合，也可以是松散结合。 金属作用与 H+相似，但由于带正电荷更多而作用更强，且容易维持一定浓度。 金属离子可通过电荷屏蔽作用而促进反应。如 Mg+屏蔽 ATP中磷酸基负电荷，消除负电荷排斥作用而加速激酶的反应，此时激酶真正作用底物是 Mg2+-ATP，而不是 ATP，见 P394。 金属离子通过水的离子化，使水分子更具酸性，促进
9、亲核催化。 许多氧化还原酶都含有金属的辅基。（6） 多元催化和协同效应：酶催化反应时常常是几个功能团适当排列共同作用。如胰凝乳蛋白酶活性中心处三个氨基酸残基组成“电荷中继网” ，催化肽键水解；核糖核酸酶催化水解时，His 12 起广义碱催化作用，接受一个质子，而 His119 起广义酸作用，和磷酸的氧原子形成氢键。亚胺内酯水解：在咪唑缓冲液中得酰胺，而在磷酸缓冲液中，尽管 pH相同产物却为胺和酯，其区别即为磷酸盐双功能催化。（7） 微环境影响：酶促反应在酶表面的疏水裂缝（活性中心）中进行，如同反应在有机溶剂中进行，反应基团不为溶剂化，亲核亲电反应均可加速。如溶菌酶Glu35 的羧基在非极性区，
10、催化功能增速 3106 倍。模拟酶由此设计胶束模拟酶和环糊精等。（四） 酶催化反应机制实例：溶菌酶（Lysozyme，EC3.2.1.17）是第一个用 X-衍射阐明结构和功能的酶。生物功能为催化某些细菌细胞壁多糖的水解，结构如 P395 图 10-9所示。细胞壁是由 NAG（N-乙酰氨基葡萄糖）和 NAM（N- 乙酰氨基葡萄糖乳酸）通过 （14）糖蔗键交替排列而成的多糖。溶菌酶底物为 NAG-NAM 交替的六糖，可表示为 ABCDEF。（1） 在酶活性部位凹穴中，底物受酶影响 D-环发生变形，糖环构象从椅式变成能量较高的半椅式或船式，接近过渡态构象。（2） 酶活性基团处于非极性区的 Glu35 的羧基不解离，提供一个 H+到D 环与 E 环间的糖苷键上氧原子上，D 环上的 C1 与氧原子间的糖苷键断开，形成正碳离子（SP 2）过渡态中间物，并为处于极性区的活性基团 Asp52 上的羧基负离子所稳定。六糖中的 E 及 F 两糖残基成 HO-EF 离开，如 P398图 10-16 所示。（3） 正碳离子中间产物进一步与来自溶剂中的 -OH 反应，解除 SP2 张力，ABCD 四糖残基离开酶分子，Glu 35 同时质子化恢复原状。如 P399 图 10-17 所示。（4） 至次一次反应完成，细胞壁打开一个缺口。
